Úloha: ELEKTROPORACE TETRACYKLINOVÉHO PLAZMIDU pT181 DO RECIPIENTNÍHO KMENE 5. aureus RN4220
(l.skupina)
Nastavení přístroje Gene Pulser Xcell: Voltáž (V)2500, Kapacitní odpor (u.F)25, Odpor (Q)200, Kyveta (mm) 2
Pozn. Všechny média před použitím sterilizovat. Výsledná selekce transformant se provádí na 1,5% TSA agaru s příslušnou selekční látkou. Předem je nutné ověřit, na jakých minimálních koncentracích rostou buňky obsahující přenášený plazmid a zda na stejné koncentraci neroste recipientníkmen bez plazmidu.
I. Příprava stafylokokových kompetentních buněk
Výchozím materiálem je kultura recipientního kmene inkubovaná v TSB/37°C/18 h.
• 0,5 ml kultury (viz výše) přidáme do 50 ml LB a inkubujeme při 30°C do OD60oO,4 (maximálně
0. 7..
• Inkubace na ledu 30 min. (Pozn. Od tohoto kroku je důležité pracovat při teplotách kolem 4°C, tzn. udržovat na ledu a předchladit rotor v centrifuze.)
• Centrifugace 10 min./7000 rpm/4°C.
• Vylít supernatant a resuspendovat pelet ve 40 ml 0,5M sacharózy.
• Centrifugace 10 min./8000 rpm/4°C.
• Vylít supernatant a resuspendovat pelet ve 20 ml 0,5M sacharózy.
• Centrifugace 10 min./8000 rpm/4°C.
• Vylít supernatant a resuspendovat pelet v 10 ml 0,5M sacharózy.
• Centrifugace 10 min./8000 rpm/4°C.
• Vylít supernatant a resuspendovat pelet v 250 u.1 0,5M sacharózy.
• Buňky rozdělíme po 50 u.1 a skladujeme v -80°C. (Pozn. Nejlepšíje pracovat s ten den připravenými buňkami.)
II. Elektroporace
• Připravit DNA pro elektroporaci do sterilních 1,5 ml mikrozkumavek (5 ng - 2 u.g ne ve větším objemu než 20 u.1). Je možno vyzkoušet různé koncentrace/objemy elektroporované DNA (5uJ, lOu.1 a 20uJ).
• Rozmrazit kompetentní buňky při pokojové teplotě. Přidat 50 u.1 buněk ke každému vzorku DNA, opatrně promíchat pipetou. Inkubace vzorků při pokojové teplotě/30 minut.
• Připravit pro každý vzorek 1 ml BHI média a 0,2 cm kyvety (vše při pokojové teplotě).
• Nastavení přístroje Gene Pulser Xcell:
1. Zapnout přístroj, připojit modul pro kyvety.
2. Otevřít „Pre-Set protocol"; Bacteria protocol screen (zmáčknout 4; potom dvakrát Enter); pro výběr protokolu pro buňky S. aureus zmáčknout 6; potom šipkami vybrat S. aureus; zmáčknout Enter.
• Přenést směs kompetentních buněk a DNA do 0,2 cm kyvety a uzavřít kyvetu víčkem.
• Umístit kyvetu do modulu pro kyvety.
• Zmáčknout červené tlačítko „Pulse".
• Následně přidat do kyvety 1 ml BHI média a opatrně přepipetovat směs do sterilní mikrozkumavky vhodného objemu.
• Inkubovat 1 h./37°C/250 rpm.
• Vyset příslušné objemy elektroporovaných buněk (50 u.1,100 u.1, 200 u.1 v triplikátech) na TSA misky s příslušnou selekční látkou (ATB, těžké kovy apod.).
• lnkubace36-48h./37°C.
III. Média
TSB (Trypton Soya Broth)
Rozpustit 30 g TSB v II H20, pH)7,4
LB
Trypton ...lOg Yeast extract...5g NaCL.lOg
Směs rozpustit v II H20, pH)7
BHI (Brain heart infusion broth)
37g BHI rozpustit v II H20, pH)= 7*
Úloha: ELEKTROPORACE PENICILINÁZOVÉHO PLAZMIDU pUSA300_HOUMR-like DO RECIPIENTNÍHO KMENE 5. aureus RN4220
(II.skupina)
I. Příprava kompetentních buněk
Nastavení přístroje Gene Pulser Xcell: C = 25 \if; PC = 100 ohm; V = 2,9 kV.
Pozn. Všechny média před použitím sterilizovat. Výsledná selekce transformant se provádí na 1,5% TSA agaru s příslušnou selekční látkou. Předem je nutné ověřit, na jakých minimálních koncentracích rostou buňky obsahující přenášený plazmid a zda na stejné koncentraci neroste recipientní kmen bez plazmidu.
• Zaočkovaní kultury z TSA misky do 3 ml B2 bujónu. Inkubace 37°C/přes noc za mírného třepání (250 rpm).
• Zaočkovaní 1,5 ml noční kultury do 150 ml B2 bujónu v II baňce. Inkubace 37°C, třepání 250 rpm, do hustoty OD60o = 0,8-0,85. Nárůst do požadované hustoty trvá přibližně 4 h.
• Ochladit buňky v ledové lázni (15 minut). Přenést buňky do 4x50 ml centrifugační zkumavky (BECKMAN). Centrifugace 12 000xg/l5 minut/4°C. Opatrně slít supernatant. Udržovat buněčný pelet na ledu.
• Resuspendovat pelety v 5 ml sterilní, vychlazené vodě. Sloučit pelety do jedné centrifugační zkumavky, opět provést centrifugaci a promytí. Centrifugace 12 000xg/l5 minut/4°C. Opatrně slít supernatant. Opakujeme dvakrát.
• Resuspendovat buněčný pelet v 25 ml sterilního a vychlazeného roztoku 10% glycerolu. Přenést do 30-50 ml centrifugační zkumavky (BECKMAN). Centrifugace 12 000xg/l5 minut/4°C. Opatrně slít supernatant.
• Resuspendovat buňky v 20 ml 10% glycerolu. Inkubace 15 minut/20°C. Centrifugace 12000xg/l5 minut/4°C. Opatrně slít supernatant.
• Resuspendovat buněčný pelet ve 2ml 10% glycerolu. Konečná koncentrace buněk by měla být lxl010CFU.
• Rozdělit buňky po 250 u.1 do sterilních 1,5 ml mikrozkumavek. Takto připravené buňky jsou ihned k použití, do vlastní elektroporace udržujeme na ledu.
• Skladujeme při -70°C. Buňky můžeme takto skladovat několik měsíců.
II. Elektroporace
• Připravit DNA pro elektroporaci do sterilních 1,5 ml mikrozkumavek (5 ng - 2 u.g ne ve větším objemu než 20 u.1). Je možno vyzkoušet různé koncentrace/objemy elektroporované DNA (5uJ, lOu.1 a 20uJ).
• Rozmrazit kompetentní buňky při pokojové teplotě. Přidat 50 u.1 buněk ke každému vzorku DNA, opatrně promíchat pipetou. Inkubace vzorků při pokojové teplotě/30 minut.
• Připravit pro každý vzorek 1 ml BHI média a 0,2 cm kyvety (vše při pokojové teplotě).
• Nastavení přístroje Gene Pulser Xcell:
1. Zapnout přístroj, připojit modul pro kyvety.
2. Otevřít „Pre-Set protocol"; Bacteria protocol screen (zmáčknout 4; potom dvakrát Enter); pro výběr protokolu pro buňky S. aureus zmáčknout 6; potom šipkami vybrat S. aureus; zmáčknout Enter.
• Přenést směs kompetentních buněk a DNA do 0,2 cm kyvety a uzavřít kyvetu víčkem.
• Umístit kyvetu do modulu pro kyvety.
• Zmáčknout červené tlačítko „Pulse".
• Následně přidat do kyvety 1 ml BHI média a opatrně přepipetovat směs do sterilní mikrozkumavky vhodného objemu.
• Inkubovat 1 h./37°C/250 rpm.
• Vyset příslušné objemy elektroporovaných buněk (50 u.1, 100 u.1, 200 u.1 v triplikátech) na TSA misky s příslušnou selekční látkou (ATB, těžké kovy apod.).
• lnkubace36-48 h./37°C.
III. Roztoky a média:
1. Trypton soya agar (TSA): rozpustit 40 g TSA (Becton Dickinson nebo Oxoid) v 11 vody.
Autoklávovat.
Složení v II vody:
Pancreatic digest of casein	15,0
Enzymatic digest of soya bean	5,0
NaCI	5,0
Agar	15,0
pH 7.3 ±0.2	
2. B2 médium: 10 g hydrolyzovaný kasein, 25 g yeast extract, 5 g glukóza, 25 g NaCI, 1 g K2HP04, rozpustit v 900 ml vody a upravit pH na 7,5; doplnit do 11 vodou. Autoklávovat.
3. BHI (Brain heart infusion broth); 37g BHI rozpustit v II H20, pH)=7,4.
4.10% glycerol: 12,6g glycerolu (hustota = 1,26) do 90 ml vody. Autoklávovat nebo sterilizovat filtrací.