Bi8920 Fluorescenční mikroskopieBi8920 Fluorescenční mikroskopie
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
Princip fluorescencePrincip fluorescence
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
• definice a princip fluorescence
• fluorochromy
• definice a princip fluorescence
• fluorochromy
Program přednášky:Program přednášky:
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
„Viditelné“ světlo
elektromagnetické vlnění o vlnové délce 400-700 nm
duální povaha - vlnová i částicová
frekvence (f) – počet kmitů za sekundu (4-8*1014 s-1 [Hz])
vlnová délka (λ) – délka jednoho kmitu (400-700 nm)
rychlost světla (c) = konstantní ve vakuu (300.000 km*s-1)
Planckova konstanta h = 6,626*10-34 J*s
platí vztahy:
c =  * f
E = h * f
„Viditelné“ světlo
elektromagnetické vlnění o vlnové délce 400-700 nm
duální povaha - vlnová i částicová
frekvence (f) – počet kmitů za sekundu (4-8*1014 s-1 [Hz])
vlnová délka (λ) – délka jednoho kmitu (400-700 nm)
rychlost světla (c) = konstantní ve vakuu (300.000 km*s-1)
Planckova konstanta h = 6,626*10-34 J*s
platí vztahy:
c =  * f
E = h * f
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
vlnová délka – barva světla
http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/wavebasics/index.html
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
LUMINISCENCE
jev při kterém vysílá látka do prostoru světlo
dělení dle indukce
– chemiluminiscence : vyvoláno chemickou reakcí
např. oxidace luciferinu luciferázou u světlušky, ECL
LUMINISCENCE
jev při kterém vysílá látka do prostoru světlo
dělení dle indukce
– chemiluminiscence : vyvoláno chemickou reakcí
např. oxidace luciferinu luciferázou u světlušky, ECL
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
-Fotoluminiscence
záření je vyvoláno jiným zářením
a) fluorescence
b) fosforescence
-Fotoluminiscence
záření je vyvoláno jiným zářením
a) fluorescence
b) fosforescence
fluorochrom =
fluorofor
látka schopná
fluorescence
excitační záření
luminiscenci vyvolává
emisní záření
vysílané látkou
fluorochrom =
fluorofor
látka schopná
fluorescence
excitační záření
luminiscenci vyvolává
emisní záření
vysílané látkou
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Podstata fluorescence
Jablonskiho diagram
Podstata fluorescence
Jablonskiho diagram
vyšší energetické hladinyvyšší energetické hladiny
základní energetická hladinazákladní energetická hladina
excitační
záření
excitační
záření
emisní
záření
emisní
záření
http://olympus.magnet.fsu.
edu/primer/java/fluorescen
ce/exciteemit/index.html
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Průběh fluorescence
1. excitace elektronů fotony ze základní energetické
hladiny do excitovaného stavu
trvání 10-15 s
2. excitovaný stav
pokles na nejnižší hladinu excitace (relaxace)
ztráta energie ve formě tepla
trvání 10-14 – 10-11 s
3. emise světla => fluorescence
trvání 10-7 – 10-9 s = doba dohasínání
Průběh fluorescence
1. excitace elektronů fotony ze základní energetické
hladiny do excitovaného stavu
trvání 10-15 s
2. excitovaný stav
pokles na nejnižší hladinu excitace (relaxace)
ztráta energie ve formě tepla
trvání 10-14 – 10-11 s
3. emise světla => fluorescence
trvání 10-7 – 10-9 s = doba dohasínání
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
recyklace photobleachingrecyklace photobleaching
http://www.olympusmicro.com/primer/java/fluorescence/photobleaching/index.html
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Princip fluorescence
http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/tuto
rials/1Intro/player.html
Princip fluorescence
http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/tuto
rials/1Intro/player.html
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
fosforescence
doba dohasínání
10-3 – 102 s
fosforescence
doba dohasínání
10-3 – 102 s
Podstata fluorescence a fosforescence
Jablonského diagram
Podstata fluorescence a fosforescence
Jablonského diagram
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Jablonského diagram- zjednodušený
http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/jablonski/lightandcolor/index.html
Jablonského diagram
http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/jablonski/jabintro/index.html
Jablonského diagram- zjednodušený
http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/jablonski/lightandcolor/index.html
Jablonského diagram
http://olympus.magnet.fsu.edu/primer/java/jablonski/jabintro/index.html
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Spin je kvantová vlastnost elementárních částic - vnitřní moment hybnosti částice.
Spiny částic přispívají k celkovémumomentu hybnosti soustavy.
Spin je kvantová vlastnost elementárních částic - vnitřní moment hybnosti částice.
Spiny částic přispívají k celkovémumomentu hybnosti soustavy.
↑
↓
↑↓
↑
↓
↓
↓
S0
S1
S2
T1
excitovaný singletový stav
- elektrony obsazují vyšší
energ. hladiny
-porušuje se párování elektronů
na jednotlivých hladinách
- spin se při excitaci nemění
základní singletový stav
-všechny elektrony jsou spárovány
-mají opačný spin
-velikost+1/2, -1/2
excitovaný singletový stav
- elektrony obsazují vyšší
energ. hladiny
-porušuje se párování elektronů
na jednotlivých hladinách
- spin se při excitaci nemění
základní singletový stav
-všechny elektrony jsou spárovány
-mají opačný spin
-velikost+1/2, -1/2
tripletový stav (zakázaný)
-méně pravděpodobný
-elektrony mají stejný spin
tripletový stav (zakázaný)
-méně pravděpodobný
-elektrony mají stejný spin
E
fluorescencefluorescence
fosforescencefosforescence
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Stokesův posun
• V rámci relaxace v excitovaných stavech docházíke ztrátě energie
• Energie excitujícíhosvětla je větší než emitovaného (Eex> Eem)
• Vlnová délka excitujícího světla je menší než emitovaného (ex< em)
Stokesův posun
• V rámci relaxace v excitovaných stavech docházíke ztrátě energie
• Energie excitujícíhosvětla je větší než emitovaného (Eex> Eem)
• Vlnová délka excitujícího světla je menší než emitovaného (ex< em)
Sir G.G. StokesSir G.G. Stokes
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Absorbční (excitační ) spektrum
závislost intenzity fluorescence na excitační vlnové délce
(měřeno při konstatní emisní vlnové délce)
Emisní spektrum
závislost intenzity fluorescence na vlnové délce při
konstantní vlnové délce excitace
Absorbční (excitační ) spektrum
závislost intenzity fluorescence na excitační vlnové délce
(měřeno při konstatní emisní vlnové délce)
Emisní spektrum
závislost intenzity fluorescence na vlnové délce při
konstantní vlnové délce excitace
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
• obě spektra mají své maxima
• excitační maximum
• emisní maximum
• vzdálenost mezi nimi – Stokesův posun
• obě spektra mají své maxima
• excitační maximum
• emisní maximum
• vzdálenost mezi nimi – Stokesův posun
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Emisní spektrum určitého fluorochromu
• je nezávislé na vlnové délce excitace
• emise z nejnižšího excitovaného stavu (S1)
• mění se pouze intenzita fluorescence
Emisní spektrum určitého fluorochromu
• je nezávislé na vlnové délce excitace
• emise z nejnižšího excitovaného stavu (S1)
• mění se pouze intenzita fluorescence
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Symetrie mezi absorpčním a emisním spektrem
• struktura vibračních hladin základního i excitovaných stavů je
stejná
• absorpce (excitace) a emise do odpovídajících hladin nastává
se stejnou pravděpodobností
• absorpční a emisní spektra zrcadlově symetrická
Symetrie mezi absorpčním a emisním spektrem
• struktura vibračních hladin základního i excitovaných stavů je
stejná
• absorpce (excitace) a emise do odpovídajících hladin nastává
se stejnou pravděpodobností
• absorpční a emisní spektra zrcadlově symetrická
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Excitační a emisní spektrum
http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/tutorials
/2Spectra/player.html
Excitační a emisní spektrum
http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/tutorials
/2Spectra/player.html
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Molární extinkční koeficient
(molární absorptivita)
• vyjadřuje míru schopnosti látky absorbovat světlo
Lambert-Beerův zákon
A = ɛ · c · l
• A – absorbance (bez jednotek)
• ɛ – molární extinkční koeficient (l·mol-1·cm-1)
• c – molární koncentrace (mol·l-1)
• l – dráha (cm)
Molární extinkční koeficient
(molární absorptivita)
• vyjadřuje míru schopnosti látky absorbovat světlo
Lambert-Beerův zákon
A = ɛ · c · l
• A – absorbance (bez jednotek)
• ɛ – molární extinkční koeficient (l·mol-1·cm-1)
• c – molární koncentrace (mol·l-1)
• l – dráha (cm)
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Kvantový výtěžek fluorescence
(Qantum Yield = QY)
QY = počet emitovaných fotonů
počet absorbovaných fotonů
• vyjadřuje míru schopnosti excitačního vlnění
vyvolat fluorescenci
• maximálně = 1 (teoreticky; energetické ztráty)
Kvantový výtěžek fluorescence
(Qantum Yield = QY)
QY = počet emitovaných fotonů
počet absorbovaných fotonů
• vyjadřuje míru schopnosti excitačního vlnění
vyvolat fluorescenci
• maximálně = 1 (teoreticky; energetické ztráty)
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Standardy pro určení kvantového
výtěžku fluorescence
Standardy pro určení kvantového
výtěžku fluorescence
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
fluorochrom = fluorofor
látka schopná fluorescence
• často obsahuje polycyklické nenasycené sloučeniny a atomy
(s více elektrony – např. P, S)
• čím více benzenových jader, tím více roste absopční
maximum
benzen naftalen antracen tetracen pentacen
262 nm 272 nm 375nm 475nm 580nm
fluorochrom = fluorofor
látka schopná fluorescence
• často obsahuje polycyklické nenasycené sloučeniny a atomy
(s více elektrony – např. P, S)
• čím více benzenových jader, tím více roste absopční
maximum
benzen naftalen antracen tetracen pentacen
262 nm 272 nm 375nm 475nm 580nm
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Skupiny fluoroforů
Vlastní (vnitřní) fluorescence
Přirozeně se vyskytující fluorofory
aminokyseliny, kofaktory enzymů, chlorofyl,
green fluorescent protein..
Nevlastní (vnější) fluorescence
Přímá vazba fluorochromu na molekuly nebo buněčné
struktury - sondy
DNA, buněčná stěna, plazmatická membrána…
mitochondriální aktivita - respirační vzplanutí, pH indikátory,
membránový potenciál..
Nepřímá vazba fluorochromu – značky
navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové
kyseliny, phalloidin..
Skupiny fluoroforů
Vlastní (vnitřní) fluorescence
Přirozeně se vyskytující fluorofory
aminokyseliny, kofaktory enzymů, chlorofyl,
green fluorescent protein..
Nevlastní (vnější) fluorescence
Přímá vazba fluorochromu na molekuly nebo buněčné
struktury - sondy
DNA, buněčná stěna, plazmatická membrána…
mitochondriální aktivita - respirační vzplanutí, pH indikátory,
membránový potenciál..
Nepřímá vazba fluorochromu – značky
navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové
kyseliny, phalloidin..
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
hlavní zdroj fluorescence proteinů v UV spektru
-indolová skupina Trp
Trp v sekvencích jen 1%
metabolicky náročná syntéza
hlavní zdroj fluorescence proteinů v UV spektru
-indolová skupina Trp
Trp v sekvencích jen 1%
metabolicky náročná syntéza
Přirozeně se vyskytující fluorofory - aminokyselinyPřirozeně se vyskytující fluorofory - aminokyseliny
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Přirozeně se vyskytující fluorofory - kofaktoryPřirozeně se vyskytující fluorofory - kofaktory
Nikotinamidadenin Flavin adenin
dinukleotid (NADH) dinukleotid (FAD)
Nikotinamidadenin Flavin adenin
dinukleotid (NADH) dinukleotid (FAD)
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Přirozeně se vyskytující fluorofory - kofaktoryPřirozeně se vyskytující fluorofory - kofaktory
• NAD+ není fluorescenční
• fluorochrom = redukovaný
nikotinamidovýring
• NAD+ není fluorescenční
• fluorochrom = redukovaný
nikotinamidovýring
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Přirozeně se vyskytující fluorofory - chlorofylPřirozeně se vyskytující fluorofory - chlorofyl
Stokesův posun až 200nmStokesův posun až 200nm
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Přirozeně se vyskytující fluorofory – chlorofyl
využití:
• hodnocení výskytu fytoplanktonu ve vodě
• studium fotosyntézy
• fyziologický stav rostlin - stres
Přirozeně se vyskytující fluorofory – chlorofyl
využití:
• hodnocení výskytu fytoplanktonu ve vodě
• studium fotosyntézy
• fyziologický stav rostlin - stres
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Nevlastní (vnější) fluorescence
Nepřímá vazba fluorochromu – ZNAČKY
značky jsou vázány k molekulám (proteiny, peptidy,
oligonukleotidy..) kovalentní vazbou
proteiny – vazba na aminové (NH2-), thiolové (SH-) skupiny
nebo histidinové řetězce
požadavky
• vysoká intenzita fluorescence
• stabilita při ozařování
• minimální vliv na biologické vlastnosti vzorku
Nevlastní (vnější) fluorescence
Nepřímá vazba fluorochromu – ZNAČKY
značky jsou vázány k molekulám (proteiny, peptidy,
oligonukleotidy..) kovalentní vazbou
proteiny – vazba na aminové (NH2-), thiolové (SH-) skupiny
nebo histidinové řetězce
požadavky
• vysoká intenzita fluorescence
• stabilita při ozařování
• minimální vliv na biologické vlastnosti vzorku
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Fluorescein , Rhodaminy
• historicky nejpoužívanější fluorescenční značky
• převážně na protilátky
• ve formě derivátů
• vysoký kvantový výtěžek 0,3-0,8
• photobleaching
tetramethylrhodamineisothiocyanate (TRITC)
ex. – 541nm, em. – 572nm
Fluorescein , Rhodaminy
• historicky nejpoužívanější fluorescenční značky
• převážně na protilátky
• ve formě derivátů
• vysoký kvantový výtěžek 0,3-0,8
• photobleaching
tetramethylrhodamineisothiocyanate (TRITC)
ex. – 541nm, em. – 572nm
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Chicago river
St. Patrick's Day
fluorescein
Chicago river
St. Patrick's Day
fluorescein
Fluorescein isothiocyanate (FITC)
ex. - 495 nm, em. - 521 nm
Fluorescein isothiocyanate (FITC)
ex. - 495 nm, em. - 521 nm
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Cy značky (Cyanine dyes)
• zástupci Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7
• částečně nasycené heterocykly + další aromatická jádra
• ex. a em. spektra podobná klasickým fluoroforům
• kratší Stokesův posun (30nm)
• fotostabilní
• vyšší kvantový výtěžek
Cy značky (Cyanine dyes)
• zástupci Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7
• částečně nasycené heterocykly + další aromatická jádra
• ex. a em. spektra podobná klasickým fluoroforům
• kratší Stokesův posun (30nm)
• fotostabilní
• vyšší kvantový výtěžek
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Alexa Fluor Dyes (Molecular Probes)
• sulfonovaný derivát rhodaminu
• vyšší kvantový výtěžek  svítivost
• zesílená fotostabilita (↓photobleaching)
• pH stabilita
• dlouhodobě stabilní
• využití – živé buňky, tkáňové řezy, fixované preparáty
• velký výběr rozsahu ex. a em. maxim
• od UV po near-infrared oblast
• označení podle vlnové délky zdroje excitačního záření
Alexa Fluor Dyes (Molecular Probes)
• sulfonovaný derivát rhodaminu
• vyšší kvantový výtěžek  svítivost
• zesílená fotostabilita (↓photobleaching)
• pH stabilita
• dlouhodobě stabilní
• využití – živé buňky, tkáňové řezy, fixované preparáty
• velký výběr rozsahu ex. a em. maxim
• od UV po near-infrared oblast
• označení podle vlnové délky zdroje excitačního záření
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Fotostabilita fluorochromů
• každý fluorofor podléhá vysvícení v průběhu souvislého
osvětlení
• ve FM silná intenzita dopadajícího záření
• nejstabilnější – značky Alexa
• není znám princip předpovědi stability dle struktury
Fotostabilita fluorochromů
• každý fluorofor podléhá vysvícení v průběhu souvislého
osvětlení
• ve FM silná intenzita dopadajícího záření
• nejstabilnější – značky Alexa
• není znám princip předpovědi stability dle struktury
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Quantum dots
• fluorofory (značky) = po absorbci fotonů emitují světlo o větší vlnové
délce
• anorganické nanokrystaly
• velikost 10-20nm (GFP 4,2 x 2,4 nm)
složení:
jádro: několik 100-1000 molekul
polovodičovéhomateriálu (Cd, Se, Te)
obal: polovodič (ZnS), stabilizuje jádro,
zlepšuje optické a fyzikální vlastnosti
plášť: amfifilní polymer, umožňuje vazbu
dalších molekul
vnější plášť: polyethylene glycol (PEG) –
snižuje nespecifickou vazbu
Quantum dots
• fluorofory (značky) = po absorbci fotonů emitují světlo o větší vlnové
délce
• anorganické nanokrystaly
• velikost 10-20nm (GFP 4,2 x 2,4 nm)
složení:
jádro: několik 100-1000 molekul
polovodičovéhomateriálu (Cd, Se, Te)
obal: polovodič (ZnS), stabilizuje jádro,
zlepšuje optické a fyzikální vlastnosti
plášť: amfifilní polymer, umožňuje vazbu
dalších molekul
vnější plášť: polyethylene glycol (PEG) –
snižuje nespecifickou vazbu
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Quantum dots
Vlastnosti:
• vlnová délka emise závisí na velikosti částice
• umožňují vícebarevnou detekci jedním excitačním zdrojem
• možnost konjugace s primárními i sekundárními protilátkami nebo
streptavidinem
• více molekul IgG na jednu částici
• vyšší jas než klasické fluorofory
• násobně vyšší stabilita
• velký Stokesův shift
Quantum dots
Vlastnosti:
• vlnová délka emise závisí na velikosti částice
• umožňují vícebarevnou detekci jedním excitačním zdrojem
• možnost konjugace s primárními i sekundárními protilátkami nebo
streptavidinem
• více molekul IgG na jednu částici
• vyšší jas než klasické fluorofory
• násobně vyšší stabilita
• velký Stokesův shift
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Quantum dots
• vazba na protilátku – srovnání s „klasickým“ konjugátem
Quantum dots
• vazba na protilátku – srovnání s „klasickým“ konjugátem
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Nevlastní (vnější) fluorescence
Přímá vazba fluorochromu na molekuly nebo buněčné
struktury – SONDY
• ke struktuře se váží nekovalentně
• po vazbě často mění fluorescenční vlastnosti
• zesílení fluorescence
nějčastější použití
• buněčné membrány
• nukleové kyseliny
• buněčná stěna (calcofluor, primulin)
• Fluorescenční indikátory
změna fluorescence (spektra nebo intenzity) v závislosti na
určité látce – prvek, pH, ROS…
Nevlastní (vnější) fluorescence
Přímá vazba fluorochromu na molekuly nebo buněčné
struktury – SONDY
• ke struktuře se váží nekovalentně
• po vazbě často mění fluorescenční vlastnosti
• zesílení fluorescence
nějčastější použití
• buněčné membrány
• nukleové kyseliny
• buněčná stěna (calcofluor, primulin)
• Fluorescenční indikátory
změna fluorescence (spektra nebo intenzity) v závislosti na
určité látce – prvek, pH, ROS…
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Mebránové fluorescenční sondy
• membrány nejsou samy o sobě fluorescenční
• vazba sond na nepolární uhlovodíkové řetězce MK
• studium - transportu přes membránu
- transport lipidů v buňkách
- přenos signálů zprostředkovaný lipidy
- interakce léčiv s membránou
• rozdělení
a) fluorescenční analogy přirozených lipidů
a) malé amfifilní a lipofilní organické fluorofory
Mebránové fluorescenční sondy
• membrány nejsou samy o sobě fluorescenční
• vazba sond na nepolární uhlovodíkové řetězce MK
• studium - transportu přes membránu
- transport lipidů v buňkách
- přenos signálů zprostředkovaný lipidy
- interakce léčiv s membránou
• rozdělení
a) fluorescenční analogy přirozených lipidů
a) malé amfifilní a lipofilní organické fluorofory
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Příklady a umístění fluorescenčních lipidových sond v membráněPříklady a umístění fluorescenčních lipidových sond v membráně
Mebránové fluorescenční sondyMebránové fluorescenční sondy
bis-pyren-PC NBD-C6-HPC DPHbis-pyren-PC NBD-C6-HPC DPH
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Fluorescenční sondy pro nukleové kyseliny
• nukleotidy ani NK nemají schopnost fluorescence
• vazba sond na různá místa
Fluorescenční sondy pro nukleové kyseliny
• nukleotidy ani NK nemají schopnost fluorescence
• vazba sond na různá místa
ethidium bromide
Hoechst 33258
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
• interkalační sondy - ethidium bromide, propidium iodide,
7-AAD (aminoactinomycin D)
• vazba do malého žlábku – DAPI, Hoechst dyes (33342, 33258)
• ostatní – akridinová oranž (DNA) akridinová oranž (RNA)
• interkalační sondy - ethidium bromide, propidium iodide,
7-AAD (aminoactinomycin D)
• vazba do malého žlábku – DAPI, Hoechst dyes (33342, 33258)
• ostatní – akridinová oranž (DNA) akridinová oranž (RNA)
Normalizovaná fluorescenční
emisní spektra DNA sond
1) Hoechst 33258 (DAPI)
2) acridine orange
3) ethidium bromide
4) 7-aminoactinomycin D
Normalizovaná fluorescenční
emisní spektra DNA sond
1) Hoechst 33258 (DAPI)
2) acridine orange
3) ethidium bromide
4) 7-aminoactinomycin D
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
Fluorescenční sondy pro nukleové kyselinyFluorescenční sondy pro nukleové kyseliny
DAPIDAPI PIPI AOAO
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
cyaninové sondy (Molecular Probes)
• nízká vnitřní fluorescence (QY=0,01) bez vazby na NK
• po vazbě na NK 1000x zvýšená intenzita (QY=0,9)
• vysoká afinita pro NK
• minimální vazba na ostatní biopolymery
• široký rozsah emisních maxim
• dělení dle propustnosti pl. membrány
• neprostupující: TOTO family, TO-PRO family, SYTOX
• prostupující : SYTO (RNA i DNA specificita)
cyaninové sondy (Molecular Probes)
• nízká vnitřní fluorescence (QY=0,01) bez vazby na NK
• po vazbě na NK 1000x zvýšená intenzita (QY=0,9)
• vysoká afinita pro NK
• minimální vazba na ostatní biopolymery
• široký rozsah emisních maxim
• dělení dle propustnosti pl. membrány
• neprostupující: TOTO family, TO-PRO family, SYTOX
• prostupující : SYTO (RNA i DNA specificita)
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
lidský neutrofil, DNA,
SYTO® 13
lidský neutrofil, DNA,
SYTO® 13
směs živých a mrtvých bakterií,
DNA, SYTOX® Blue
směs živých a mrtvých bakterií,
DNA, SYTOX® Blue
linie MRC-5, RNA
SYTO® RNASelect™
linie MRC-5, RNA
SYTO® RNASelect™
emisní spektra skupiny TOTOemisní spektra skupiny TOTO
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.Bi8920 Fluorescenčnímikroskopie - jaro 2015 - 01 / 24.2.
You created this PDF from an application that is not licensed to print to novaPDF printer (http://www.novapdf.com)