Bi8920 Fluorescenční mikroskopie RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Fluorescenční zobrazení živých buněk Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. • GFP a fluorescenční proteiny • tracking metody • fluorescence v reálném čase • mikroskopování živých buněk Program přednášky: Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. The Nobel Prize in Chemistry 2008 "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP". http://www.youtube.com/watch?v=90wpvSp4l_0 Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. O. Shimomura 60. -70. léta: izolace fluoreskujících proteinů z medůzy Aequorea victoria, kolem klobouku bioluminiscenční orgány Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Princip luminiscence Aequorea victoria za přítomnosti Ca+2, bioluminiscence aequorinu (apoaequorin + luciferin) -> modré světlo -> excitace GFP -> zelené světlo Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. struktura GFP: -barel (11 antiparalelních řetězců) , uvnitř α-helix s chromoforem, 238 AMK, 27kDa, aktivní místo: Ser65-Tyr66-Gly67 přestavba a vznik fluoroforu Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. imidazolinový kruh http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/fluorescentproteins/egfpchroma/indexflash.html Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Excitace: 390-470 nm – wtGFP dva píky, emise cca 509 nm redukovaná forma – ex. 390 nm oxidovaná forma – ex. 470 nm Využití: označení genů, vznik fúzního proteinu, lokalizace a dynamika proteinu v živých buňkách bez nutnosti fixace, možnost užití inducibilních promotorů a tedy indukovat tvorbu fúzních proteinů jen v určitém čase Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. možnost umístění fluorescenčního proteinu v plasmidu Exprese : • přechodná z plazmidu (vysoká hladina proteinu) • stabilně - integrace do chromozomové DNA Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Výhody GFP • relativně malý protein (27kDa) – snadná difuze • funkční jako monomer • není třeba kofaktoru • stabilní, vysoký kvantový výtěžek (0,8) • v živých organismech – dědičná exprese • neinvazivní vizualizace • „neinterferuje“ s buněčnými procesy nevýhody wtGFP • pomalejší proces fluorescence in vivo • horší funkčnost při 37°C • renaturace fluoroforu, oxidace (2-4 hodiny) • méně stabilní při nízkém pH • dvoukrokový proces Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. mutace GFP • zesílení signálu • delší životnost • posun emisního spektra deriváty GFP • EGFP - enhanced green FP • EBFP – enhaced blue FP • ECFP – enhanced cyan FP • EYFP – enhanced yellow FP Wt: Ser65-Tyr66-Gly67 Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Ds Red fluorescenční protein a jeho deriváty • snaha o získání FP s delší excitační vlnovou délkou • izolovány z korálu Discoma striata • tetramerický protein • vylepšený derivát, snížená Mr (monomer) • další mutanty – mFruits proteiny Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Ds Red fluorescenční protein a jeho deriváty wt Ds Red: podobná struktura proteinu jako GFP excitace: 558 nm emise: 583 nm Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Ds Red fluorescenční protein a jeho deriváty Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Speciální vlastnosti fluorescenčních proteinů Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Zavedení fúzního genu do buňky ve formě plazmidu Mikroinjekce – přímý přenos mikrojehlou do cytoplasmy nebo jádra pomocí mikromanipulátoru, není vhodný pro velké množství b. linií, ideální pro protoplasty, lze si vybírat jednotlivé b. Lipofectaminová transfekce – jednoduchá a nejčastější metoda u živočišných buněk, není toxický, komplex lipidů a DNA fúzuje s plasmatickou membránou, lze i do jádra Precipitace fosforečnanem vápenatým – fosforečnan vápenatý společně s DNA precipituje, poté je fagocytován do buněk, jednoduchá metoda, část DNA i do jádra Elektroporace – elektrický puls vyvolá tvorbu pórů v plasmatické membráně, přechod do buňky Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Zavedení fúzního genu do buňky Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Mikroinjekce Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Lipofectaminová transfekce Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Elektroporace Cíle: • b. kultura • tkáně • orgány • embryo • embryo in utero Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. GFP exprese v rybím embryu zebřička (Danio rerio) Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. • Fluorescenční indikátory změna fluorescence (spektra nebo intenzity) v závislosti na určité látce – prvek, pH, ROS... Iontové indikátory: kationty: H+, Ca2+, Li+, K+, Mg2+, Zn2+, Pb2+, ... anionty: Cl-, PO4 2-, citrát, ATP... měření: změna intenzity v závislosti na koncentraci nebo posun emisního spektra Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Indikátory Ca2+ FURA-2 excitace při dvou vl. délkách měření poměru 340/380nm při konstantní emisní vlnové délce 510nm CalciumGreen-5N měření intenzity fluorescence při konstantní excitační vlnové délce 488nm Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. kombinace indikátorů Ca2+ • dva indikátory s neměnící se vl. délkou emise • jeden snižuje fluorescenci (Fura Red) • druhý zvyšuje fluorescenci (Fluo-3) v závislosti na Ca2+ • měření poměru fluorescence v jednotlivých emisních maximech Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Organelové sondy - próby označení specifické membránové organely: • mitochondrie • Golgiho aparát • endoplasmatické retikulum • lysosomy složení: fluorochrom + vazebná doména (zajišťuje specificitu vazby) • schopnost průniku přes pl. membránu bez poškození • navázání na cílovou organelu studium: transport, buněčná respirace, mitóza, apoptóza, degradace proteinů, sekreční dráhy rozdělení: na stálé a nestálé Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Mitochondrie studium buněčné respirace dříve Rhodamin 123 (po fixáži slábne), nyní MitoTracker, Mito Fluor (lze fixovat) JC-1 indikátor membránového potenciálu - v aktivních mitochondriích mění emisi ze zelené na červenou Neonatální kardiomyocyty : rhodamin123, (A) kontrola, (B) ovlivněno mitochondriálním uncouplerem Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. mitochondrie – bovinní endotel : MitoTracker® Deep Red FM dye býčí spermie : MitoTracker® Green FM, Hoechst 33342 mitochondrie – fibroblasty norka : JC-1 vysoký membránový potenciál – červená nízký membránový potenciál - zelená Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Golgiho aparát • CellLight™ Golgi-GFP , enzym specifický pro GA, fúzovaný s GFP ve vektoru • konjugované lektiny – vazba na glykosylované proteiny GA GA a mitochondrie – linie lidské hladké svaloviny: CellLight Golgi-GFP a CellLight Mitochondria-RFP Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Endoplasmatické retikulum prostupují přes membránu, selektivní pro ER, dříve DiOC6,- není tak specifický, vykazuje fotodynamickou toxicitu nyní ER-Tracker + Blue-White, Red , Green - menší toxicita, lze i fixovat ER - bovinní endotel : ER-Tracker Blue-White DPX Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Lysozómy LysoTracker, LysoSensor obsahují ve struktuře heterocyklické dusíkaté skupiny které napomáhají transportu do lysozomů živých buněk, vysoká senzitivita pro organely s nízkým pH, možnost fixace (LysoTracker), pouze živé b. (LysoSensor) – vzrůstá intenzita fluorescence v nízkém (pH indikátor) lysozómy a mitochondrie – bovinní endotel : LysoTracker® Red, dihydrorhodamine 123 a Hoechst 33258 Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. BacMam Reagents • připravené virové konstrukty • baculovirus – hmyzí, aktivně neinfikují savčí buňky, nereplikují se konstrukt: 1) savčí promotor: zaručuje expresi v savčích buňkách 2) funkční část: protein nebo peptid cílený na strukturu (cytoskelet, organely aj.) nebo funkci (buněčný cyklus, autofagie, tok Ca2+) 3) fluorescenční protein: CFP, GFP, RFP; na C- nebo N- konci peptidu • jednoduchá aplikace • lze sledovat v reálném čase • lze koexprimovat více prób • lze fixovat Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Princip metody • vstup do b. endocytózou • přechod DNA do jádra • exprese genů jen se savčím promotorem • virové geny se nereplikují a nepůsobí buněčnou smrt • reálná exprese po 4-6 h • maximum signálu 24-48 h • vyhasnutí 4 dny až 2 týdny v závislosti na proliferační aktivitě Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Sledování fází buněčného cyklu • FUCCI- fluorescence ubiquitination cell cycle indicator • Geminin-GFP -> S/G2/M • Cdt1-RFP -> G1 • regulace ubiquitin-ligázami, exprimovanými v určitých fázích cyklu • lze spojit s BacMam systémem transfekce (LifeTechnologies) Sakaue-Sawano et al . Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 2008 Feb 8;132(3):487-98. Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Testování viability/cytotoxicity měření podílu živých a mrtvých buněk na základě rozdílných vlastností 1. fluorogenní substráty esteráz • pronikají do buněk, zde metabolizovány - vznik aktivního fluoroforu • ověření soudržnosti membrány – fluorofor zadržován v cytoplasmě • fluoresceindiacetát (FDA), calcein AM (CAM) 2. sondy pro nukleové kyseliny • neprostupují přes membránu živých buněk • EtBr, PI, ethidium homodimer, SYTOX Green... lze společně kombinovat Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. linie krysích buněk: živé: substrát esterázy calcein AM zelené mrtvé: ethidium homodimer-1 červené býčí spermie : živé : SYBR® 14  zelené mrtvé: propidium iodide  oranžové. Micrococcus luteus a Bacillus cereus: živé : zelené mrtvé : červené Princip obarvení mrtvých buněk membránu neprostupující DNA sondou Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Annexin V + PI: detekce buněčné smrti Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. TUNEL: Detekce štěpení DNA v apoptóze TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling TUNEL DAPI Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. FRAP – Fluorescence Recovery after Photobleaching • studium mobility a molekulární dynamiky proteinů v živých b. • narušení rovnoměrné fluorescence preparátu vysvícením (photobleaching) daného regionu • použití excitačního laseru o vyšší intenzitě –trvalé poškození fluoroforu • v místě postupné zvyšování intenzity fluorescence – přesun fluorescenčních a odbarvených molekul • různé metody v závislosti na velikosti odbarveného regionu, počtu odbarvovacích procesů a způsobu analýzy fluorescence Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Princip FRAP Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. FRAP- malý region 1x odbarvení obnovení signálu, informace o mobilitě molekul FLIP – fluorescence loss in photobleaching – opakované odbarvení stejného regionu, informace o propojení mezi různými kompartmenty, studium migrace molekul iFRAP (inverzní) – celý preparát kromě 1 regionu odbarven – postupné vymizení fluorescence fotoaktivace – analýza rychlých difúzních procesů Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. FRET: Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer • studium fluorescenčně značených molekul • měření nanometrových vzdáleností a jejich změn mezi molekulami (1- 10nm) • 2 fluorofory: donorový + akceptorový • podmínky: a) překryv emisní spektra donoru s excitačním spektrem akceptoru, b) vzdálenost do 10nm, c) orientace Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Princip přenosu energie mezi fluorofory Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Princip FRET interakce receptor-ligand Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Další aplikace FRET Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. aplikace FRET biosenzory- měření koncentrace vápníku http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/spectralimaging/fretbiosensors/index.html Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Podmínky pro mikroskopii živých buněk Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Mikroskopie živých buněk Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Mikroskopie živých buněk Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Inkubační (perfúzní) komůrka Bi8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2016 - 04 / 6.4. Live imaging http://www.youtube.com/watch?f eature=endscreen&NR=1&v=Nrw u0YhGx5o