ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ
REAL-TIME PCR
2. Kvantifikační strategie
Repeatability (Opakovatelnost)
Intra-assay variabilita (stejná analýza v jedné laboratoři)
Reproducibility (Reproducibilita)
Inter-assay variabilita (stejná analýza v různých laboratořích)
Kvantifikační strategie
Precision (Přesnost)
Shoda mezi experimenty („jak přesně pipetujeme“)
Přesná kvantifikace závisí na:
Accuracy (Správnost)
Shoda mezi experimentálně zjištěnou hodnotou a realitou
Kvantifikační strategie Faktory ovlivňující PCR
Templát – Izolace RNA
- Volba zdroje (charakter tkáně, biopsie, mikrodisekce…)
- Integrita (RNA Integrity Number – RIN) výpočet na základě 28S a 18S rRNA
- Čistota (A260/280; A260/230), přítomnost PCR inhibitorů
- Přesné určení koncentrace RNA
- Celková RNA nebo mRNA?
- Vhodnost metody, automatizace, výtěžek…
Reverzní transkripce
- Významný zdroj variability v qRT-PCR
- Metoda izolace RNA může významně ovlivnit proces reverzní transkripce
- Volba primerů, enzymu, teplotního profilu
- One step vs. Two step PCR
- Výtěžek cDNA
- sekvence směrem 5’konci signifikantně nižší výtěžek než 3’
- RNáza H
Kvantifikační strategie
Kvantifikační strategie
End-point vs. Real-Time PCR
– Vztah mezi vstupním množstvím templátu a výsledným množstvím amplikonu je úměrný pouze
v exponenciální fázi reakce
– Klasická PCR proto musí být zastavena ještě před dosažením plateau fáze
– Intra-assay variabilita klasické PCR (30-40%); Inter-assay variabilita (50-70%)
Plateau
fáze
Exponenciální amplifikace
pod úrovní pozadí -
background
Exponenciální lineární
fáze
end point
real-time
Kvantifikační strategie
Zpracování dat A data přímo z přístroje
B vyhlazení dat
C normalizace pozadí (na základě nespecifické fluorescence)
D normalizace amplitudy signálu (na základě plateau)
stanovení Ct
Množství polymerázy
Koncentrace primerů
Tvar mikrozkumavek
PCR efficiency (účinnost)
• Measure of rate at which polymerase
converts the reagents to amplicon
• Maximum increase per cycle is 2-fold – 100%
efficiency
• 100% efficiency may not happen repeatedly
• It is necessary to create standard dilution
curve – need slope of the reaction
Standard curve
• 10-fold dilution – 8 points
• Will define dynamic range of reaction
• For each point- in triplicates, get Ct values
• Need tight technical replicates
• Reproducibility- replicates (no more than 0.5 Ct
difference)
• R values- how well data fit on curve
• R2- how well data points lie on line (linearity of
PCR)
• R2<0.95 – not pipetted correctly or inhibitors
• R2>0.985 OK
PCR efficiency
slope
PCR efficiency
• Efficiency= (10(-1/slope)-1) * 100
• If slope -3.32, then PCR 100% efficient
• If slope lower (-3.9) – less than 100% E
• If slope higher (-2.5) – sample quality or
pipetting errors
• every 3.32 cycles - 10 fold increase in
amplicon
• Efficiency between 90-100% OK
PCR efficiency
• Length of amplicon
• GC content of amplicon
• Secondary structures in primers, probes, amplicon
• Concentration of reagents
• Low efficiency
o inhibitors of polymerase
o high or suboptimal annealing temperature
o old/inactive Taq
o poorly designed primers
o secondary structures
100%
Účinnost PCR je 100% jen výjimečně, dokonce i v případě opakovaných
PCR identických templátů
Y=N 2n
Y=N (1+E)n
Amplifikace Y
N počet molekul templátu
n počet cyklů PCR
Účinnost PCR
Kvantifikační strategie
Otázka:
Provádíte PCR alikvotu templátové DNA obsahujícího 3×105 kopií. V předchozích experimentech
jste určili efektivitu reakce 85%. Kolik cyklů musíte provést, abyste dosáhli výsledného počtu kopií
2 ×1010 ?
n
K amplifikaci z 3×105 na 2 ×1010 s účinností 85% je nutných minimálně 18 cyklů.
Odpověď:
Y= N(1+E)n
Y = 2 ×1010
N = 3×105
E = 0,85
n = ?
2 ×1010 = 3×105 (1+0,85)
2 ×1010
3 ×105
=log log (1+0,85)n ×
2 ×1010
3 ×105
=log log (1+0,85)
n =
0,67 ×105log
n ×
log 1,85
n = 18,5
Kvantifikační strategie
1. Absolutní kvantifikace
• srovnání Ct jednotlivých vzorků s externím standardem (kalibrační křivkou)
• Exaktní výsledek – zvolená jednotka (např. počet kopií/ng RNA/ml krve/
genom/buňku/hmotnost tkáně… atd.)
• Vysoká reprodukovatelnost, specifita a přesnost kalibračních křivek
• Velký dynamický rozsah – 101-1010 molekul templátu
• Validace
• Volba externího standardu (recDNA, gDNA, RT-PCR produkt, recRNA, syntetické
oligonukleotidy…)
• Reprodukovatelnost výsledků
Kvantifikační strategie
Externí standardy
DNA
− Plazmidová DNA, genomová DNA, cDNA, syntetické oligonukleotidy
− Velmi stabilní, odolné vůči náhodnému štěpení
− Úseky DNA cca 2kb mají podobné vlastnosti jako mRNA/cDNA
− Reprodukovatelné výsledky
− Snadné stanovení koncentrace
− Kalibrační křivky založené na DNA nereflektují RT krok
− Externí standardy nezohledňují přítomnost PCR inhibitorů
Výsledek absolutní kvantifikace závisí na
1.Volbě standardu
2.Good laboboratory practice
Kvantifikační strategie
Externí standardy
Kvantifikační strategie
RNA
• RecRNA (rekombinantní RNA)
– syntetizována přímo nebo in vitro z plazmidové DNA, obsahující klonovaný RTPCR
fragment
• Reverzní transkripce
- Odlišná kinetika reakce než u nativní RNA
- Neodráží zastoupení jednotlivých RNA frakcí (rRNA 80%, tRNA 10-15% a další)
• Externí standardy nezohledňují přítomnost PCR inhibitorů
• Stabilita a citlivost k nukleázám
• Komerčně dodávaná celková RNA nebo její frakce (polyA, tRNA) jako tzv.
background RNA – zvýšení účinnosti RT RecRNA
Externí standardy
Kvantifikační strategie
Je nutné vytvářet pokaždé novou kalibrační křivku? Jaká je její reproducibilita?
Předpokládáme stejnou instrumentaci, reagencie i templát (opakujeme stejnou kalibrační křivku)
variabilita
2-3% směrnice (k)
10% posun (q)
- Některé přístroje (např. Roche Lightcycler) umožňují ukládání standardních křivek a jejich
kalibraci (korekce q) prostřednictvím jediného datového budu v každé analýze (za předpokladu
konzistentního designu analýzy)
y= k x + q
α
Kvantifikační strategie
Efekt počátečního počtu kopií
Odhady množství templátu nad 1000 kopií jsou relativně přesné (chyba 1%)
Ale - malý vstupní počet templátových molekul – chyba narůstá
Např. účinnost PCR 80% → v každém cyklu pravděpodobnost 20%, že nedojde ke
zdvojnásobení počtu molekul
Monte Carlo effect
závisí na množství templátu – čím je menší množství
templátu, tím je i menší pravděpodobnost, že množství
amplikonu bude odrážet skutečné množství templátu (nárůst
variability)
Monte Carlo effect
100ng 10ng 1ng 0,1ng 0,01ng 0,001ng
Přesto, lze úspěšně kvantifikovat i extrémně malá
množství templátu:
Stanovení 10 kopií genomu viru hepatitidy C v plazmě
Intra-assay variabilita (CV) 3,1%
Inter-assay CV 4,4% (4,15% CV pro 100000 kopií)
2. Relativní kvantifikace
• Nevyžaduje externí standardy
• Srovnání Ct jednotlivých vzorků (genů) (např. u pacienta po léčbě) s expresí
referenčního genu (housekeeping gene) a vůči biologické kontrole
• (např. pacient před léčbou, zdravý člověk…)
• Kontrola = kalibrátor
• Určení poměru exprese
- ∆∆Ct
- Korekce účinnosti PCR
- Hodnocení skupin vzorků – software REST/REST XL
Kvantifikační strategie
2. Relativní kvantifikace ∆∆Ct
Kvantifikační strategie
Bez zahrnutí efektivity jednotlivých reakcí
Předpokládáme 100%
R= 2-[∆Ct sample-∆Ct control]
R=2-∆∆Ct
A
A
B
B
c-fos
GAPDH
vzorek c-fos GAPDH ∆Ct ∆∆Ct R
A 22,00 18,18 3,82 0 1
B 22,34 15,76 6,58 2,76 1,15
Kvantifikační strategie
Korekce relativní kvantifikace zahrnující účinnost PCR
Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen(kontrola-vzorek)
(Ereferenční gen)∆Ct referenční gen (kontrola-vzorek)
Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen (PRŮMĚR kontrola - PRŮMĚR vzorek)
(Ereferenční gen)∆Ct referenční gen (PRŮMĚR kontrola - PRŮMĚR vzorek)
Ratio = (Ereferenční gen) Ct vzorek (Ereferenční gen) Ct kalibrátor
(Ecílový gen) Ct vzorek (Ecílový gen) Ct kalibrátor
÷
Účinnost PCR
I malý rozdíl v účinnosti PCR mezi stanovovaným genem a referenční kontrolou může
dramaticky změnit výsledný poměr
Např. rozdíl v účinnosti (∆E) = 3%
E cílový gen > E referenční gen po 25 cyklech poměr 47%
E referenční gen > Ecílový gen po 25 cyklech poměr 209%
E cílový gen > E referenční gen po 25 cyklech poměr 28%
E referenční gen > Ecílový gen po 25 cyklech poměr 338%
E cílový gen > E referenční gen po 25 cyklech poměr 7,2%
E referenční gen > Ecílový gen po 25 cyklech poměr 1083%
Kvantifikační strategie
= 5%
= 10%
Experiment: Srovnání exprese klinicky významného genu (YFG) u
pacientů a zdravých dobrovolníků. Normalizace vůči GAPDH.
Pacienti: Ct (YFG) 32; Ct (GAPDH) 26
Kontrola: Ct (YFG) 35; Ct (GAPDH) 27
Jak se liší exprese YFG u pacientů a zdravých dobrovolníků?
Pacienti: dCt=32-26 = 6
Kontrola: dCt=35-27 = 8
ddCt: 6-8 = -2
Poměr exprese: 2-ddCt = 4
Experiment: Srovnání exprese klinicky významného genu (YFG) u
pacientů a zdravých dobrovolníků. Normalizace vůči GAPDH.
Pacienti: Ct (YFG) 32; Ct (GAPDH) 26
Kontrola: Ct (YFG) 35; Ct (GAPDH) 27
Efektivita PCR (YFG) 80%; (GAPDH) 90%
Jak se liší exprese YFG u pacientů a zdravých dobrovolníků?
Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen(kontrola-vzorek)
(Ereferenční gen)∆Ct referenční gen (kontrola-vzorek)
Ratio = 1,83 = 5,832 = 3,07
1,91 1,9
Experiment: Srovnání exprese klinicky významného genu (YFG) u
pacientů a zdravých dobrovolníků. Normalizace vůči GAPDH.
Pacienti: Ct (YFG) 32; Ct (GAPDH) 26
Kontrola: Ct (YFG) 35; Ct (GAPDH) 27
Efektivita PCR (YFG) 60%; (GAPDH) 105%
Jak se liší exprese YFG u pacientů a zdravých dobrovolníků?
Ratio = (Ecílový gen)∆Ct cílový gen(kontrola-vzorek)
(Ereferenční gen)∆Ct referenční gen (kontrola-vzorek)
Ratio = 1,63 = 4,096 = 1,998
2,051 2,05
!
Kvantifikační strategie
Normalizace v relativní kvantifikaci
Sample-to-sample variation
Run-to-run variation
Korekce variability mezi jednotlivými vzorky, způsobené
• Charakterem vzorků
• Integritou RNA
• Efektivitou RT
• Pipetovací chybou
Normalizace vůči
• Neregulovanému endogennímu referenčnímu genu
• Celkové buněčné RNA/DNA
Kvantifikační strategie
Referenční geny
Kvantifikační strategie
GAPDH
Kvantifikační strategie
Referenční geny
Kvantifikační strategie
GAPDH
Albumin
Aktin
Histon H3
Tubulin
Cyklofilin
Mikroglobuliny (B2M)
Ubiquitin
18SrRNA
28SrRNA
GAPDH je regulovaná za nejrůznějších experimentálních i
fyziologických podmínek
Experimentální
podmínky
Tkáň Extracelulární
faktory
Onemocnění
Věk
Apoptóza
Buněčný cyklus
Vývojové stádium
Hladovění
Hypoxie
Oxidativní stres
Těhotenství
Sérum
Leukocyty
Erytrocyty
Střevní biopsie
Endothelie
T-lymfocyty
Thyrocyty
UV
IL2
NO
TPA
Dexamethason
Cholinergní agonisté
Kreatin
Inzulín
Retinová kyselina
Růstový hormon
Vitamin D
MnII+
Karcinom
- prsu
- cervixu
- kolorekta
- plic
- jater
- prostaty
- slinivky
Neurodegenerativní
onemocnění
Kvantifikační strategie
Referenční geny
Programy geNorm a BestKeeper (freeware)
Určení expresních profilů více housekepingových genů,
zhodnocení jejich variability (pairwise correlation),
geometrický průměr více opakování
Vyhodnocení nejstabilnějšího housekeepingového genu za definovaných podmínek.
Jak na to?
Tkáňové kultury
– normalizace vůči počtu buněk, referenčnímu genu, RNA…
– replikáty
Mononukleární krevní buňky
– heterogenní populace
– FACS – normalizace vůči počtu buněk definovaného typu
– kvantifikace vůči expresi genu pro příslušný CD (CD-19 B-lymf.)
– totální RNA
Kvantifikační strategie
Jak na to?
Biopsie solidních tkání
- Nádorová tkáň
- Heterogenita
- Otázkou je, zda-li je vůbec objektivně možné relativně kvantifikovat klasické biopsie
(problémy s referenčním genem a jeho expresí v daném místě, počtem buněk…)
Laser Capture Microdissection
- Normalizace exprese vůči referenčnímu genu
- Výhodou je histologická informace a znalost počtu buněk
Celková RNA
- Nutné přesné určení koncentrace RNA
- Nereflektuje RT a PCR krok
rRNA
- Jiný charakter exprese, jiné polymerázy, atd.
- Její hladina je ale ovlivněna méně než v případě mRNA
(s výjimkou krevních buněk)
- Otázka volby subpopulace (28S, 18SrRNA)
D'Souza et al. BMC Neuroscience 2008 9:66 doi:10.1186/1471-2202-9-66
Shrnutí
Kvantifikační strategie
Umíte odpovědět na následující otázky?
– design experimentu, např. je vzorek tkáně reprezentativní? Jaké
biologické kontrolní vzorky musím použít?
– volba metody, jaký templát bude vstupovat do mých reakcí?
mám použít pouze poly-A RNA nebo celkovou RNA? Má
dostatečnou kvalitu? One step nebo two step PCR?
– s jakou účinností běží moje PCR?
– absolutní nebo relativní kvantifikace?
– je zvolený housekeepingový gen vhodný?
– proběhla má real-time PCR správně? Jsou Ct stanoveny správně?