ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ
REAL-TIME PCR
III. Instrumentace
Instrumentace
PCR – termocykler
qRT-PCR – termocykler kombinovaný s fluorimetrem
Excitačnífiltr
Emisní filtr
Detektor
Halogenová lampa
- Všechny vlnové délky viditelného světla (320nm – 2600nm)
- Uniformní excitace
- př. ABI 7300, 7500, Stratagene Mx4000/Mx3000p, BioRad iCycler
- Normalizace fluorescence (Rox)
Laser
- Specifická vlnová délka
- Není nutný excitační filtr
- Omezený výběr fluoroforů
- př. ABI PRISM 7700/7900
LED
- Úzké pásmo vlnové délky (30-40nm)
- Běžné LED emitují na 430, 450, 505, 592, 612 a 637 nm
- nově i modrá a UV část spektra
- př. Corbett Rotor-Gene, Roche Light Cycler
Instrumentace
Zdroje excitačního záření
Filtry
Instrumentace
Excitační/emisní – selekce excitační/emisní vlnové délky
Optická kvalita filtru často určuje výkonnost přístroje
Bandpass a Long Pass Filtry
Volba fluoroforu
http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/imagingsystems.
Monochromátor
Volba libovolné vlnové délky
Difrakční mřížka
Instrumentace
Fotodetektory
Snímací zařízení (CCD )
Instrumentace
wincobiz.com/qpcr.htm.
Teplotní uniformita
Instrumentace
Parametry RT cykleru
Citlivost – minimální kvantifikovatelné množství templátu – fluorescence, kterou
je přístroj schopný odlišit od úrovně pozadí (šum)
Dynamický rozsah – rozsah koncentrací – rozsah intenzity fluorescence
Linearita – intenzita fluorescence je ideálně lineární
ale:
- koncentrace:
- vysoká koncentrace vzorku – nemusí dojít k excitaci
- i u „normálních“ koncentrací, může dojít k preferenčnímu absorbování
světla povrchovými vrstvami vzorku, vzdálenější část vzorku už není
excitována světlem o stejné intenzitě
- optická dráha
- laboratorní plastik
- homogenita vzorku
Fluorescenční standardy – kalibrace přístroje
Instrumentace
Kalibrace
Instrumentace
Tvorba „droplets“
1 droplet = 1 PCR
Fluorescenční analýza
Andrew deMello
http://www3.imperial.ac.uk/people/a.demello/research
High-throughput droplet PCR
Droplet Digital PCR (dd-PCR)
• determination of absolute values
• high accuracy, sensitivity
• better reproducibility even for very small amounts of starting
material
MM specific
IgH sequence
in total DNA
Sample partition
20 000 droplets
random distribution
of target DNA
PCR amplification
each droplet provides
positive or negative
fluorescent signal
indicating presence or
absence of target DNA