ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR VI. Aplikace qRT-PCR Aplikace 1. Detekce DNA - Diagnóza infekčních onemocnění (přítomnost patogenů v krvi, séru, plazmě ...) - Sledování minimální reziduálni nemoci - Detekce patogenů v potravinách a v životním prostředí - Detekce GMO - Autenticita potravin 2. Detekce RNA - Minimální reziduálni onemocnění (Her2 - karcinom prsu, Bcr-Abl - CML, ELAVL-4 - neuroblastom) - Detekce RNA virů - Diagnóza nádorových onemocnění (PSA - karcinom prostaty) - Validace microarray experimentů 3. Detekce SNP 4. High Resolution Melting Analysis 5. Kvantifikace množství (konkrétních) proteinů Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Diagnóza - rychlá, citlivá a přesná determinace patogenů Klasické kultivační metody - časově náročné (24-48hod), nízká citlivost, omezené spektrum druhů qRT-PCR - např. geny kódující 23S rRNA nebo 16S rRNA Rutinní diagnostika - Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Streptococcus pneumonieae Monitoring zneužitelných druhů - biodefense - Yersinia pestis, Bacillus anthracis Výzkum - testování antibiotik - multidrug resistant strains (analýza bodových mutací v genech zodpovědných za metablismus ATB) - Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus Houbová a parazitární onemocnění - Aspergillus fumigatus, Candida sp. - Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum Aplikace Aplikace v klinické mikrobiologii Příklad protokolu: Detekce Prevotella intermedia Stěr z úst Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, cfg. 20min/15 OOOg Izolovat bakteriální DNA ze supernatantu Návrh primerů (Primer Express) - oblast 16S rDNA Např.: Forward: 5'-AATACCCGATGTTGTCCACA-3' Reverse: 5'-TTAGCCGGTCCTTATTCGAA-3' Reakční směs PCR 2x SYBR green Master Mix (Applied Biosystems) 26,0jllI 95°C 1min Forward primer (10|Jv1) 2,0\i\ Reverse primer (10jaM) 2,0\i\ 95°C 15s PCR grade H20 1 5,0jliI 60°C 1min Vzorek DNA nebo standard 5,0|al f 40X ) Disociační křivka - 60-95°C Aplikace Aplikace v klinické virológii Typizace virů (např. chřipka) nepřítomnost signálu - variabilita v sekvencích/falešně negativní výsledky Hydrolyzační (TaqMan) i hybridizační sondy Kvantifikace - virový titr např. hepatitída B/C, HIV, EB, cytomegalovirus atd. Transplantace Detekční limity - genomové ekvivalenty (ge) End-point analýza - detekční limit 5x101 ge; dynamický rozsah 101-104ge Hybridizační analýzy - detekční limit 2x101 ge; dynamický rozsah 101-104 ge Inter- a intra assay variabilita >40% qRT-PCR - detekční limit 1x101 ge; dynamický rozsah 101-108 ge Inter- a intra assay variabilita <5-10% Interní amplifikační kontrola - Paralelní PCR známého standardu - Tzv „Spiking" vzorků známými sekvencemi - Paralelní analýza příbuzného viru (např. pro lidský HSV - tulení PhHV) Aplikace Aplikace v klinické virologii Příklad protokolu: Detekce viru chřipky (Influenza A) - 5' nukleázová assay Stěr z nosohltanu Resupendovat stěr v 1xPBS Vortex 30s, Izolovat virovou RNA ze supernatantu Návrh primerů a sondy (Primer Express) - oblast M1 (influeznaA matrix gene) Např.: Forward: 5'-CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3' Reverse: 5'-GGTGACAGGATTGGTCTTGTCTTTA-3' Sonda: Fam-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAG-BHQ+ Reakční směs - One Step PCR (Qiagen) PCR Qiagen One Step RT-PCR Enzyme Mix 1,0^1 50°C 20min (Reverzní transkripce) Qiagen One Step RT-PCR Buffer (5x) 5,0|al Qiagen One Step RT-PCR dNTP mix (10mM) 1,0|al 95°C 15min (Aktivace polymerázy) Forward primer (10|uM) 2,0|Lil Reverse primer (10jaM) 2,0jal 95°C15s r 45X \ Sonda (20|aM) 0,2|al 60°C1min PCR grade H20 8,8^1 Vzorek DNA nebo standard 5,0fil Aplikace http://www.idahotec.com/BioDefense/ Terénní qRT-PCR - Detekce patogenů mimo laboratoř - Komerční specializovaná řešení http://www.rapidcycler.com/GSA/index.html Aplikace Jednonukleotidové polymorfismy SNP DNA sekvence lišící se v jediném nukleotidu Kódující i nekódující oblasti Záměna nukleotidu nemusí nutně vést k záměně AA Variabilita v odpovědi k patogenům, léčivům, atd. Senzitivita k onemocněním http ://www. n cb i. n I m. n i h. g o v/p roj ects/S N PI NCBI PubMed Nucleoid Single Nucleotide Polymorphism JK?^ ? Protein Genome Structure PopSet Taxonomy OMIM Books SNP Search for SNP on NCBI Reference Assembly Search Entrez SNP ▼ for Go Aplikace SNP genotypizace • TaqMan • Invader assay (Flap endonukleaza) • SNP microarray Invader assay in which probe complements the SNP resulting in fluroescene Invader assay in which probe mismatches at the SNP location preventing cleavage from occuring no FEN cleavage site PCR amplification of location of NaOH wash and attachment interest with biotinylated primer to streptavldin Hybridization of PCR product with an allele specific probe in the presences of a DNA duplex binding fluorescence molecule The temperature at which the DNA hybrid denatures and fluorescence is lost is recorded and compared between assays with different probes Reference: Based on Olivier M. 2005.The Invader assay for SNP genotyping. Aplikace SNP genotypizace APEX (Arrayed primer extension) - 2D matice, oligonukleotidy imobilizované 5'koncem - PCR produkt je hybridiziován a prodloužen DNA polymerázou - Fluorescenčně značené terminátorové nukleotidy Tetra-primer based PCR pi DNA: G allele pi DNA: A allele PCR product Not allele specific Ci allele specific A allele specific P3 A PS •C (' ►A -A -T ■ P4 P2 P4 P2 PCR Gel electrophoresis PCR product (;/(; homozygote G/A heterozygote AM homozygote Nol allele specific ^^^^ ^^^b ^^^^ G allele specific A allele specific Aplikace SNP genotypizace pomocí real-time PCR Zejména molekulární majáky a TaqMan sondy End-point analýza Forward Primer ľ ■ Probe Q ■ S1 í1 Re verse Filme r Allele rrK>.TTTTTT* mO, >n Match "■" l-^l— E-ll-.—I fllieie mOíTT m c ^ natch Mismatch Legend v Fluorescent probe 0 Reporter © Fluorescent Probe OŇcfĹ; mí nor Groove Binder Quencher | Tag DNA FAil/merase Molecu la r Probe Ta rg et Sequ ence Emission of Fluorescence X Undetermined CM jí CL (ň >■ V Allele X Fäníh AlleleY NTC Allele X [SNP Allele 1) A V ■ í < ■é ■h 4 —^-i— H tí •ŕ* \ H >* ■ ■ Aplikace Analýza křivek teplot tání = High resolution melting analysis Analýza komplexních sekvencí PostPCR analýza Snadná analýza neznámých sekvencí Sledování disociace řetězců DNA v závislosti na teplotě B. Normalized Melting Curves 100 15 75 50 - 25 DoiAle-stranded DNA Singlejstranded DNA m DNA) ^ (random coils) V «f 76 79 82 Tm 88 91 Temperature [°C] ■ oo 80 I 60 S 20 25 20 15 C [i c 7 (< /ild Typ: ^allel« Muk ST j-M II jnts — i „ \ (I all 3le) H( steroz1 /gote; \ R1 JF 1 Heterozygotes 82 82.! 83 33.! 84 84.Í 85 8S 30 30.! Aplikace Analýza křivek teplot tání = High resolution melting analysis Výhody: - Univerzální primery pro oblast nesoucí hledaný polymorfismus - Jediný fluorofor (SYBR Green) - „High throughput", automatizace Aplikace: - SNP, mutace - genotypizace - Typizace mikroorganismů Time (hours) 3 VÝHODA: CAS 1 1 l A B C j D E F G DNA prep PCR scan analysis cycle sequencing capillary electrophoresis analysis No variants detected ► Report within 3 hrs T Variants identified ► Report within 6 hrs Erali M. et al. 2010. Methods 50(4):250-261 Aplikace Příklad: Screening X-linked chronic granulomatous disease (OMIM 300481) Location of CYBBand amelogenin primer;; on X linked chronic uranulomjlouh, di^ej^e primer plates. Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5 Sample 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A EX EX Ex EX EX EX Ex Ex Ex Ex EX Ex 1 8 I 8 I S 1 8 1 8 1 8 B Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 2 9 C Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex 3 10 3 10 3 10 3 10 3 10 3 10 D Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex 4 11 4 11 4 11 4 11 4 11 4 11 E Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex 5 12 5 12 5 12 5 12 5 12 5 12 F Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex Ex E 13 S 13 6 13 6 13 6 13 6 13 C Ex 7 Ex 7 Ex 7 Ex 7 Ex 7 Ex 7 H XY XY XY XY XY XY 13 exonů + amelogenin alternativa: sekvenovänf 82 84 86 Temperature (°C) 88 90 92 Aplikace Wild Type sequence Variant bequence j_i_i_i_i_ _i_i_i_i_i_i_i -0.04 J-1-1-1-1-1-1-'— _l_I_1_I_J_I_j_l_ &5 ae :T as as so 91 9? as ae in sa <;;; 90 v S2 Temperature (°C) Aplikace miRNA detekce MikroRNA (miRNAs) -Malé molekuly RNA - rostliny i živočichové - konzervativní sekvence - 21 mery - regulují expresi genů vazbou na 3' nepřekládaný region mRNA (3'UTR) miRNA genes Pre-miRNA Nucleus Cytoplasm Juicer Jj2rjnĽ>'RNA duplex I i jfinmr jCnnr One strand incorporated into Rlz C r ^ RlzC_ T Target Mtllh.l mRNA mRNA Translation cleavage inhibition Tumor suppressor gene ;Tumor suppressor gene expression tOncogene expression Aplikace 75 ng/ul Thymus Total RNA 40 60 Fig. 1A. Image of a typical electropherogram for small RNA analysis performed with the Small RNA Assay on the 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) (http:// www.chem.agilent.com/Library/technicaloverviews/Public/5989-7002EN.pdf). Becker C. et al. 2010. Methods 50(4):237-243 Aplikace miRNA detekce • Specifický primer pro RT • 5' nuclease assay (TaqMan) PCR Endogenní kontrola: malá jaderná RNA(snRNA) nimw o i iiiiniiiii TTfT II II IIIIIIIIIIII IIIIII Aplikace Analýza DNA metylací • Více než 70% C lidského genomu v sekvenci CpG je metylováno • Významná modifikace, regulující např. architekturu chromozomu i řadu dějů na buněčné úrovni • regulační úseky genů - promotory C + bisulfit = U mC intaktní nu, Sulphonation nh, HS03 »HNx^ > OH *SO,- N H Cytosine N H Cytosine sulphonate Endonukleázy citlivé metylovaným sekvencím BsoFI, Hpall, Mspl and Hhal H 20 MIH STEP 2 HS03 OH ÍŠTĚP31 ^ Alkali Uracil Desulphonation Uracil Hydrolytic Deamination SO, The two main components of the epigenetic code DNA methylation Methyl marks added to certain DNA bases repress gene activity. Histone modification A combination of different molecules can attach to the 'tails' of proteins called histones. These alter the activity of the DNA wrapped around them. Aplikace Kvantitativní analýza DNA metylací pomocí real-time PCR Nemetylováné cytosiny jsou konvertovány na U bisulfitovou metodou 1. Pro každou sekvenci dva páry primerů nebo 111 P __m_ 2. Jsou použity oligonukleotidy hybridizující k nemetylovaným sekvencím a blokující PCR Aplikace ImunoPCR - Vazba specifického oligonukleotidu k monoklonální protilátce - Protein (Antigen) je imobilizován jinou monoklonální protilátkou - Vzniká sendvič (assemblage) - podobně jako ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) -tzv. PCR- ELOSA (Enzyme-Linked Oligonucleotide Sorbent Assay - Množství oligonukleotidu imobilizovaného prostřednictvím mAb je kvantifikováno PCR 14J 16 J en Z 18 ■ 0 1 20 E | 22 * 24 26 J 5 6 T 7 T 8 9 10 1 22 - 2.0 - 1.8 - 1.6 at - 1.4 o - 1.2 £ o - 1.0 JS < - 0.8 <" - 0.6 □ LU - 0.4 - 0.2 - 0.0 11 log (molecules of PSA) Fig. 5. Real-time immuno-PCR (assemblage 11) (■} and EL1SA (A) readouts of standard samples (logarithmic scale). Aplikace ImunoPCR - stanovení PSA v laser-mikrodisekovaných buňkách Human Pathology (2008) 39, 1474-1482 ELSEVIER Original contribution Human PATHOLOGY ww w. elsevier.c om/1 ocatc/humpatt Prostate-specific antigen mRNA and protein levels in laser microdissected cells of human prostate measured by real-time reverse transcriptase-quantitative polymerase chain reaction and immuno-quantitative polymerase chain reaction Pamela Pinzarri PhDa, Kristina Lind PhDbd, Francesca Malentacchi Gabriella Nesi MDC, Francesca Salvianti PhD3, Donata Villari MDf, Mikael Kubista PhDde, Mario Pazzagli PhDa, Claudio Orlando PhDa _ 1 000 000- ¥ -v a T n mRNA □ FKjrblN -1-1-1-1-1-1-1 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 R-0 6BO: p<0.001 o iooooo 200000 oooooo «00000 500000 sooooo PSA Protein (moletuleskell) Aplikace A Single cell profiling tion > B Total number of ^ transcripts = 6 Total number of ^ transcripts = 6 Total number of ^ transcripts = 7 Total number of \ transcripts = 6 Total number of ^ transcripts ■ 7 Total number of ^ transcripts = 6 Cell collection > Cell lysis Reverse transcription Real-time PCR Data analysis glass capillaries flow cytometry laser capture purification * reverse * mastermix detergents transcriptase * priming heat * priming * temperature osmotic * temperature profile mechanic profile * detection chemistry 1 pre-amplificalion * pre-amp I ifi cation normalization ■ quality assessment ■ statistics Stahlberg A. and Bengtsson M. 2010. Methods 50(4):282-288 Aplikace Circulating tumor cells (CTCs) Alluni-Fabbroni. 2010. Methods 50(4):289-297 Aplikace Amplifikace DNA bez PCR? Helicase-dependent isothermal DNA amplification 1. dsDNAje denaturovaná pomocí helikáz a SSB proteinů 2. Primery hybridizují ke komplemntární sekvenci 3. Polymeráza doplní ssDNA na dsDNA, která slouží jako substrát helikázám o — o 0 B 1 a Ľ ■ / 2 ■ / CL- y \ --1 I— I— I—I I—I -—-i I—I I—1—1 i—i— i—i i—i i—i o 1—1—1 1—1 '-■ 1-1 1-1 l—l—i 10 20 30 40 50 60 70 Time (min) 80 90 100 110 Helicases unwind DNA duplexes in the presence of SSB and accessory protein y v. Primers anneal to ssDNA 3' DNA polymerases extend ▼ the primers; one duplex is amplified to two duplexes dsDNA are separated by helicases and this chain reaction repeats itself Droplet digital PCR • Precizní sensitivní stanovení NK • Kombinuje klasické PCR postupy s fluorescenčním stanovením produktu • Rozdělení PCR reakce na stovky až tisíce subreakcí- někde dojde k replikace, někde ne - přítomnost/nepřítomnost hledané sekvence • Subreakce individuálně analyzovány • Ratio pozitivních a negativních reakcí - počáteční množství molekul templátu • Absolutní kvantifikace bez externích standard ddPCR-využití • Kvantifikace virů a patogenů • Genové exprese - pokud rozdíly menší než dva krát • Copy number variations • Single cell analysis • Rare mutations.... ddPCR b 1 Buffer Enzyme PCR Pnnsrs DaiBciiuri sysi*m