Jméno: Obor: Datum provedení: Teoretický Úvod Obrázek 1: Struktura TRIS File:Tris.png Tris je zkratkou organické sloučeniny tris(hydroxymetyl)aminometan (Obr. 1), která je velmi často požívána v biochemii a molekulární biologii jako pufrační látka. Z chemického hlediska se jedná o primární amin, který se ve vodném roztoku chová podle disociační rovnováhy (1): Tris-NH[3]^+ = H^+ + Tris-NH[2] (1) Z hlediska Brönstedovy teorie kyselin a zásad lze i na protonizované báze pohlížet jako na kyseliny a lze tudíž definovat následující disociační konstantu: (2)^ Protože hodnoty disociačních konstant mohou být různého řádu, udávají se z praktického hlediska v podobě svých logaritmů (resp . záporných logaritmů) jako pK[A]. Na obrázku 2 je znázorněn průběh acidobazické titrace, kdy pokud je k bazickému roztoku postupně přidávána kyselina, dochází k neutralizaci a pH roztoku se snižuje jen zvolna. Tato části titrační křivky se často označuje jako oblast pufrační, kdy s přídavkem titračního činidla (báze nebo kyseliny) se pH roztoku mění jen pozvolna. Bod, kdy je látkové množství kyseliny rovno látkovému množství báze nazýváme bodem ekvivalence. V oblasti bodu ekvivalence se směrnice titrační křivky významně mění a následně v oblasti velkého nadbytku kyseliny se pH mění opět jen zvolna. Obrázek 2: Titrační křivka slabé zásady silnou kyselinou Dalším velmi často používaným pufrem je poté fosfátový pufr. Kyselina fosforečná je vícesytná kyselina mající tři různé pKa hodnoty a poskytující tak více oblastí s dobrou pufrační kapacitou: H[3]PO[4] H[2]PO[4]^- + H^+ pK[A]1 H[2]PO[4]^- HPO[4]^2- + H^+ pK[A]2 HPO[4]^2- PO[4]^3- + H^+ pK[A]3 Na obrázku 3 je znázorněn průběh acidobazické titrace k. fosforečné, kdy při postupném přídavku hydroxidu můžeme pozorovat tři inflexní body odpovídající příslušným bodům ekvivalence. Obrázek 3: Titrační křivka kyseliny fosforečné hydroxidem sodným PRAKTICKÁ ČÁST A. Stanovení koncentrace HCl titrací roztokem NaOH Při smíchání k. chlorovodíkové a hydroxidu sodného probíhá neutralizační reakce podle rovnice: HCl + NaOH H[2]O + NaCl Během neutralizační reakce reagují ionty H^+ kyseliny přítomné v roztoku s přidávanými OH^- ionty hydroxidu za vzniku molekuly H[2]O. Jakmile je veškerá kyselina zneutralizována, dojde při dalším přídavku hydroxidu ke vzniku nadbytku OH^- iontů v roztoku. Tento stav lze určit pomocí vhodného indikátoru, v našem případě fenolftaleinu. Postup práce: 1. Do titrační baňky odpipetujte 5 ml roztoku HCl a přidejte několik kapek fenolftaleinu. 2. Titrujte 0.1 M roztokem NaOH. Titrace je skončena v okamžiku, když se poslední kapkou přidávaného činidla z byrety zbarví titrovaný roztok HCl dočervena. Barevné změně indikátoru odpovídá pod ekvivalence. 3. Titraci opakujte třikrát a na základě průměrné hodnoty ze tří titrací vypočítejte přesnou koncentraci roztoku HCl. Výsledky: V[NaOH ](ml) V[prům] (ml) c[HCl] (M) B. Stanovení disociační konstanty TRIS (tris(hydroxymetyl)aminometan) Postup práce: Kalibrace pH metru 1. Otevřete menu pro kalibraci zmáčknutím tlačítka 2. Pomocí tlačítka zvolte typ kalibrace [ConCal]. Na displeji se objeví nápis „ASY“. 3. Důkladně opláchněte elektrodu destilovanou vodou a ponořte ji do prvního pufru o pH 7.0. 4. Spusťte měření zmáčknutím tlačítka . 5. Počkejte na stabilizaci hodnoty a nastavte pomocí šipek nahoru/dolů hodnotu na 7.0. 6. Ukončete zmáčknutím tlačítka . 7. Na displeji se objeví nápis „SLO“. 8. Důkladně opláchněte elektrodu destilovanou vodou a ponořte ji do druhého pufru o pH 4.0. 9. Spusťte měření zmáčknutím tlačítka . 10. Počkejte na stabilizaci hodnoty a nastavte pomocí šipek nahoru/dolů hodnotu na 4.0. 11. Ukončete měření zmáčknutím tlačítka . 12. Objeví se zobrazení směrnice kalibrační přímky (mV/pH) a poté zmáčkněte opět . 13. Objeví se asymetrie (mV), měření spusťte zmáčknutím tlačítka . Vlastní měření 1. Do 75 ml kádinky napipetujte přesně 1,0 ml roztoku TRIS a nařeďte jej 29 ml vody. 2. Do kádinky vložte magnetické míchadlo, kádinku postavte na magnetickou míchačku a spusťte míchání. 3. Zkalibrovanou elektrodu opláchněte vodou, osušte kouskem buničité vaty a ponořte do naředěného roztoku TRIS v kádince. Při ponoření elektrody do roztoku si dejte pozor, aby elektroda nebyla v kontaktu s míchadlem a aby byla ponořena frita elektrody. 4. Odečtěte hodnotu pH. 5. Do titrovaného roztoku přidejte pipetou 1,0 ml odměrného roztoku kyseliny chlorovodíkové a po ustálení hodnoty pH metru odečtěte pH. 6. Tento postup opakujte až do konečné spotřeby 24,0 ml. 7. Vyneste v programu Excel titrační křivku (závislost pH na objemu přidané kyseliny chlorovodíkové) a proložením bodů určete bod ekvivalence (inflexe titrační křivky). 8. Vypočítejte koncentraci předloženého roztoku TRIS a v polovině spotřeby k bodu ekvivalence poté odečtěte pK[A] TRIS. 9. Zhodnoťte, v jakém rozsahu pH se dá TRIS používat jako pufr. Výsledky: c[HCl ](mM) V[ekv] (ml) c[TRIS] (mM) pK[A] TRIS Titrační křivka (závislost pH na objemu přidané kyseliny chlorovodíkové) Zhodnocení, v jakém rozsahu pH se dá TRIS používat jako pufr C. Stanovení disociačních konstanty kyseliny fosforečné Vlastní měření 1. Do 75 ml kádinky napipetujte přesně 1,0 ml 0,3 M roztoku kyseliny fosforečné a nařeďte jej 29 ml vody. 2. Do kádinky vložte magnetické míchadlo, kádinku postavte na magnetickou míchačku a spusťte míchání. 3. Zkalibrovanou elektrodu opláchněte vodou, osušte kouskem buničité vaty a ponořte do naředěného roztoku kyseliny fosforečné v kádince. Při ponoření elektrody do roztoku si dejte pozor, aby elektroda nebyla v kontaktu s míchadlem a aby byla ponořena frita elektrody. 4. Odečtěte hodnotu pH. 5. Do titrovaného roztoku přidejte pipetou 0,5 ml 0.1M roztoku hydroxidu sodného a po ustálení hodnoty pH metru odečtěte pH. 6. Tento postup opakujte až do konečné spotřeby 15,0 ml. 7. Vyneste v programu Excel titrační křivku (závislost pH na objemu přidaného hydroxidu sodného) a proložením bodů určete body ekvivalence (inflexe titrační křivky) poté odečtěte jedotlivé hodnoty pK[A] kyseliny fosforečné. 8. Zhodnoťte, v jakém rozsahu pH se dá používat fosfátový pufr. Titrační křivka (závislost pH na objemu přidaného hydroxidu sodného) Zhodnocení, v jakém rozsahu pH se dá používat fosfátový pufr