Analýza a separace nukleových kyselin Literatura PCR Mullis 1983 NC 1993 figure 13-11 part 1 Templátová DNA, primery, NTP, Taq polymeráza (75-80oC) thermocykler figure 13-11 part 2 PCR Mullis figure 13-11 part 3 http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/images/PCR-principe.jpg Nastartování reakce Průběh reakce Analýza produktů reakce http://img.directindustry.com/images_di/photo-g/pcr-thermal-cycler-polymerase-chain-reaction-22548- 2303833.jpg Thermocycler Real time PCR Försterova vzdálenost 1 – 10 mm Real time PCR Real time PCR Real time PCR proteinů Graphical abstract: The real-time PCR for sensitive protein detection by target-induced intermolecular hybridization Real time PCR proteinů Stanovení sekvence DNA uRestrikční enzymy u uChemické štěpení – Maxam Gilbertovo metoda u uEnzymová metoda u uPyrosekvenování u u u u Restrikční enzymy Restrikční enzymy F05-37.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: Restrikční enzymy F05-41.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: Restrikční enzymy Maxam Gilbertova metoda Maxam Gilbertova metoda Maxam Gilbertova metoda dimetylsulfát a piperidin hydrazin a piperidin kyselina a piperidin kyselina, NaCl a piperidin Maxam Gilbertova metoda Enzymová metoda figure 11-30 figure 11-29 2003 - Projekt lidského genomu Pyrosekvenování •První reakcí je DNA polymerace pomocí DNA polymerázy, kdy dochází k zařazení příslušného deoxynukleotid trifosfátu (dNTPs) za uvolnění pyrofosfátu. • • (DNA)n + dNTP → (DNA)n+1 + PPi (polymeráza) • •Vzniklý pyrofosfát je uvolněn z polymerázy a může sloužit jako substrát pro ATP sulfurylázu. Při této reakci dojde ke kvantitativnímu převedení pyrofosfátu na ATP. • • PPi + APS → ATP + SO42- (ATP sulfuryláza) Pyrosekvenování Pyrosekvenování •První reakcí je DNA polymerace pomocí DNA polymerázy, kdy dochází k zařazení příslušného deoxynukleotid trifosfátu (dNTPs) za uvolnění pyrofosfátu. • • (DNA)n + dNTP → (DNA)n+1 + PPi (polymeráza) • •Vzniklý pyrofosfát je uvolněn z polymerázy a může sloužit jako substrát pro ATP sulfurylázu. Při této reakci dojde ke kvantitativnímu převedení pyrofosfátu na ATP. • • PPi + APS → ATP + SO42- (ATP sulfuryláza) Pyrosekvenování > Pyrosekvenování •Během třetí a čtvrté reakce je ATP převedeno na světelný signál pomocí enzymu luciferázy a následně je světelný signál detekován a vyhodnocen programem. • •Luciferáza + D-luciferin + ATP → Luciferáza-luciferin-AMP + PPi • •Luciferáza-luciferin-AMP + PPi + O2 → Luciferáza + Oxyluceferin + AMP + CO2 + světlo • Pyrosekvenování > Pyrosekvenování •Poslední enzymatickou reakcí je reakce apyrázy, která odstraní nezainkorpované nukleotidy a ATP, aby následně mohlo dojít k zopakování celého výše popsaného procesu a mohlo být analyzováno zařazení dalšího nukleotidu. Tato degradace je nezbytná, aby bylo zajištěna synchronizace mezi syntézou a detekcí světelného signálu. • •ATP→AMP + 2Pi (apyráza) • •dNTP→dNMP + 2 Pi (apyráza) Pyrosekvenování > Pyrosekvenování 454 pyrosekvenování Sekvenování Genetická daktyloskopie http://science.kennesaw.edu/~rrascati/images/PCRProcess.jpg Použití restrikčních enzymů - RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Short tandem repeats Short tandem repeats http://science.kennesaw.edu/~rrascati/images/powerplex.gif Short tandem repeats http://science.kennesaw.edu/~rrascati/images/genescan.jpg Testy paternity uZjednodušené testy u uSTR na Y chromosomu – mužských potomků srovnání s otcem u uMitochondriální DNA – dědí se po matce – matroklinní dedičnost DNA chipy DNA chipy DNA chipy F07-39.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: DNA chipy DNA chipy - barva skvrn • • • • • • • • • • DNA chipy - vybavení DNA chipy software F07-40.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Proteinové chipy C:\My Documents\upstream.jpg Proteinové chipy – typy interakcí • • • • • • • • • • Protilátka Antigen Ligand •Detekce: SELDI MS, fluorescence, SPR, electrochemická, radioaktivity, •Lecture 1.1 •57 Anti-GST Probe Fig2ab Blotting uSouthern – DNA u uNothern – RNA u uWestern - bílkoviny Izolace nukleových kyselin Důraz kladen na čistotu nikoliv množství - PCR Cíl izolace uOdstranění proteinů u uDNA vs RNA u uizolace specifického typu NK u Typy NK ugenomická (chromosomalní) u uorganelová (mitochondrie, chloroplasty) u uplasmidy (extra-chromosomalní) u uvirová (ds nebo ss) u ukomplementární (mRNA) u Nejpoužívanější metody una základě rozdílné rozpustnosti – extrakce, srážení u una základě vlastností - chromatografie – polarita- adsorpční, náboj-ionexová u usedimentace - gradientová ultracentrifugace Postup u1. Rozbití buněk a membrán pro uvolnění NK u u2. Inaktivace DNA- nebo RNA-degradujících enzymů (DNasy, RNasy). u u3. Separace NK od dalších komponent uvolněných z buňky. •Extrakce/Precipitace •Chromatografie •Ultracentrifugace u Extrakce/Precipitace •Organic extraction Brown p.28 Izolace genomické DNA Typická procedura 1.Sklizení buněk 2.Lyse buněk 0.5% SDS + proteinase K (55o několik hodin) 3.Fenolová extrakce Jemné třepání několik hodin 4.Ethanolová precipitace 5.Působení RNAsy a proteinasy K 6.Opakování kroku 3 a 4. • Hrubý lyzát obsahující NK a další součásti buňky Smíchání vzorku s organickou fází ve stejném poměru. e.g. phenol, chloroform, or phenol:chloroform Centrifugace Vodná fáze obsahuje NK, organická fáze bílkoviny a lipidy. Nerozpustné složky přítomné v interfázi. Opakovaná extrakce pro zvýšení čistoty Použití vodné fáze Extrakce/Precipitace Krok 3: Organická extrakce Organická fáze Vodná fáze Interfáze Přidání EtOH a soli Supernatant Pelet 70% EtOH Rozpuštění (H2O, TE, etc.) Krok 4: Precipitace NK Extrakce/Precipitace Před Po Centrifugace Promytí Centrifugace 2-2,5 objem EtOH -20o C Vysoká I pH 5-5.5 • • Chromatografie Adsorpční chromatografie Adsorpční chromatografie • Eluce zvýšením pH nebo vysokou I Ionexová chromatografie Vazba při nízkém pH nízké I Gradientová centrifugace • Diferenciální versus gradientová centrifugace Gradientová centrifugace DNA CsCl cesium_chloride • •Plasmid DNA Brown p.44 Izolace RNA - speciální přístupy nutno použít inhibitory RNAsy extrakce guanidium chloridem fenolová extrakce při pH < 4 (pH 8 pro DNA) působení RNase-free Dnase selektivní precipitace rRNA, mRNA s LiCl oligo-dT afinitní chromatografie - mRNA Kontrola čistoty a kvantifikace NK •genomická •DNA • •DNA •(degradovaná) Kontrola degradace: DNA Kontrola degradace: RNA •25S •18S