Sekvenace DNA Vývoj sekvenačních technik za posledních 35 let Maxam-Gilbertova sekvenační metoda (1977) Princip metody - specifická chemická degradace purinových a pyrimidinových bazí • puriny jsou modifikovány pomocí dimethylsulfátu • pyrimidiny pomocí hydrazinu • následně je pomocí 1M piperidinu při 90oC štěpena cukr-fosfátová kostra v místě příslušné modifikované báze Místo štěpení piperidinem Atak hydrazinem Atak dimethylsulfátem Modifikova ná báze Specifická modifikace G Methylace guaninu pomocí dimethylsulfátu při pH 8.0 - guanin se stává náchylný k odstranění při alkalickém pH. A + G Přidání piperidinu v kyselině mravenčí při pH 2.0 vede k odtranění purinových bazí C + T Přidání hydrazinu vede k otevření pyrimidinového kruhu a jeho odtranění z DNA C Při vysoké iontové síle (1.5 M NaCl) reaguje s hydrazinem jenom cytosin Maxam-Gilbertova sekvenační metoda Maxam-Gilbertova sekvenační metoda Schéma sekvenace: DNA Označení konců pomocí radioaktivní značky Alkalická fosfatasa/polynukletid kinasa Terminální transferasa Štěpení restrikčním enzymem Denaturace (detekovatelný je pouze značený fragment) Odstranění Rozdělení vzorků do čtyř chemických reakcí, které vedou ke specifickému štěpení Maxam-Gilbertova sekvenační metoda • Fragmenty jsou separovány na přibližně 6% polyakrylamidovém gelu G A C C + + G T • Touto metodou jsme schopni sekvenonat přibližně 250-300 bp dlouhé fragmenty • Musíme pracovat s velkým množstvím DNA • Velká pracnost metody (několik purifikačních kroků), nemožnost plné automatizace, práce s mutagenními chemikáliemi • Používá se stále pro “footprinting“ Sekvenační metoda dle Sangera (1980) • Syntéza DNA in-vitro za použití “terminátorů“ – dideoxynukleotidů zabraňujících po svém začlenění do DNA její další elongaci. Deoxyribosa Dideoxyribosa • Vyžaduje použití iniciálního primeru, DNA polymerasy a směs dNTPs se značenými ddNTPs • Nasyntetizované řetězce jsou poté separovány pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy nebo kapilární elektroforézy • Možnost plně automatizované seprace za použití fluorescenčně značených ddNTPs Sekvenační metoda dle Sangera (1980) Automatická analýza a vyhodnocení • kapilární elektroforéza spojená s fluorescenční detekcí produktů (BigDye barevný set) • Genetic analyzer 3000 series (ABI) • Megabase (GE Healthcare) Ruční sekvenace Automatická sekvenace Throughput/Performance by Run Module XLRseq: 768 samples per day (690 Kbases) LongSeq: 1152 samples/day (980 Kbases) StdSeq: 2304 samples/day (1550 Kbases) FastSeq: 2304 samples/day (1600 Kbases) RapidSeq: 3840 samples per day (2100 Kbases) Sekvenační metoda dle Sangera Human Genome Project (HGP) - započat v roce 1990 za účasti DOE and NIH - sekvenace prováděna pomocí BACs - prvotní plán počítal s dobou trvání 15 let - nakonec sekvenace téměř dokončena již v roce 2000 - výsledná sekvenční mapa publikována 14. dubna 2003, 99.99% přesnost (National Human Genome Research Institute) - celkové náklady projektu 3 miliardy dolarů - v roce 2000 prezident Bill Clinton ujistil o nepatentovatelnosti lidské DNA https://https://www.genome.gov/25019885/online-education-kit-how-to-sequence-a-human-genome// Celera Genomics Project - založena vědcem Craig Venterem a v roce 1998 započala sekvenační projekt - celkové náklady 300 mil. dolarů byly hrazeny plně s privátních zdrojů - poprvé použita metoda „whole genome shotgun sequencing“ - k analýze sekvenačních dat použit přístup vyvinutý Gene Myersem - tento přístup však vyžadoval extrémní výpočtové požadavky - finální výpočet prováděn na 7000 procesorech k získání 1000 násobné rychlosti oproti Pentium počítačům - tento inovativní přístup dovolil dokončit sekvenaci již za 9 měsíců Pyrosekvenování (1990) • umožňuje rychlou sekvenaci krátkých úseků DNA - sekvenace 30 až 50 bazí trvá přibližně 30 až 45 minut. • Jedná se o bio-luminometrické sekvenování DNA založené na detekci anorganického pyrofosfátu (PPi) uvolněného během inkorporace nukleotidů. Pyrosekvenování Metoda pyrosekvenování je použitá v některých sekvenátorech “druhé generace“ (Roche) Průchodnost 1 miliarda bazí za den Doba analýza 10.0 hodin Délka čtení 400 Počet čtení/analýzu 1 000.000 Správnost >99.0% správnost jednoho čtení na 400 bazích Potřebné množství DNA Méně než 100 ng DNA Multiplexování Až 192 vzorků/běh http://454.com/products-solutions/multimedia-presentations.asp Pyrosekvenování Průchodnost 35 bazí/běh Doba analýza 10 hodin sekvenování 2 hodiny zpracování dat Délka čtení 400 bazí Přesnost 99% přesnost při 400 bazí Počet čtená/běh 100,000 shotgun, 70,000 amplikon Vzorky gDNA, amplikony, cDNA GS Junior System Sekvenátor II generace – Solexa Tvorba klastrů Sekvenace Párování Analýza dat Sekvenátor II generace – MiniSeq, MiSeq, NextSeq, HiSeq Sekvenátor II generace - princip Náhodná fragmentace DNA, na fragmenty jsou poté ligovány adaptéry Fragmenty DNA se náhodně naváží na vnitřní povrch průtočných kanálků Po přidání nukleotidů a enzymů sjede k tzv. můstkové PCR Enzym inkorporuje nukleotidy a vytváří dvouřetězcový můstek Po následné denaturaci zůstávají na povrchu přichycené jednořetězcové templáty. V každém kanále jsou tak vytvořeny miliony klastrů dvou-řetězcové DNA Sekvenátor II generace - princip Sekvenátor II generace - princip První cyklus: přidání čtyř fluorescenčně značených reverzibilních terminátorů a enzymů Excitace laserem a zaznamenání fluorescenčního signálu každého klastru Druhý cyklus: přidání čtyř fluorescenčně značených reverzibilních terminátorů a enzymů Sekvenátor II generace - princip Excitace laserem a zaznamenání fluorescenčního signálu každého klastru Několikanásobné opakování celého procesu Srovnání získaných dat s referenční sekvencí, identifikace rozdílů Sekvenátor II generace Příprava DNA knihovny Vzorek DNA – fragmentace (Covaris, fragmentáza) Začištění konců (DNA polymeráza) Ligace adapterů (ligáza) Výběr fragmentů dle velkosti (SPRI) Amplifikace fragmentů Sekvenace (Illumina, IonTorrent) Sekvenátor II generace Sekvenace amplikonů Sekvenátor II generace - Single read Sekvenátor II generace – Pair end read Sekvenátor II generace – SOLiD Sekvenátor II generace – SOLiD SOLiD – základní parametry čtení • Pro detekci polymorfismů nutno opakovat minimálně 20x • Pro detekci somatických mutací 30x Kvalita Přesnost Robustnost Sekvenátor II generace – SOLiD Vytvoření tzv. Sekvenační knihovny Sekvenátor II generace – SOLiD Namnožení Sekvenační knihovny (em-PCR) Sekvenátor II generace – SOLiD Sekvenace pomocí ligační reakce Sekvenátor II generace – Ion Torrent Ion 314™ Chip v2: 30–100 Mb sekvenčních dat s dobou čtení 2–4 hodiny Ion 316™ Chip v2: 300 Mb–1.0 Gb sekvenčních dat s dobou čtení 3–5 hodin Ion 318™ Chip v2: 600 Mb–2.0 Gb sekvenčních dat s dobou čtení 4–7 hodin Sekvenátor II generace – Ion Torrent Postup práce Aplikace (Sekvenace) Cílená Exomu Transkriptomu Genomu Sequel System PacBio RS II Sekvenátor III generace – PacBio Sekvenátor III generace – PacBio • Sekvenace založena na Single Molecule, Real-Time (SMRT®) technologii • Vyžívá tzv. Zero-Mode Waveguides (ZMWs) umožňujcící osvícení pouze spodní části jamky, ve které je dole imobilizována DNA polymeráza • Hlavní výhoda je možnost dlouhého čtění (až 20 kb) • Další výhoda je možnost přímé detekce methylovaných bazí (epigenom) Sekvenátor III generace – PacBio Příprava knihovny https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI