1
Analýza obrazu
Gabriela Lochmanová
Studijním
ateriály
2/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
?• Stanovení cíle
experimentu
Definice jasně stanovených otázek – cílů
• potvrzení hypotézy
• soustředění se na úzce vymezený problém
Stanovení počtu a typu replik
• umožňují statistické zpracování experimentálních úda
Způsob detekce
Postup zpracování vzorku,
kontrolní vzorky, standard
Biologické
• Zahrnutí biologické diverzity
- repliky prezentovány různými vzorky téhož typu
X rostlinek Arabidopsis,
X různých pacientů se stejným typem nádoru apod.
Technické
• Zahrnutí chyb metody
(reprodukovatelnost)
- stejný vzorek v několika replikách
Studijním
ateriály
3/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
Biologické repliky Technické repliky
Studijním
ateriály
4/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
?
Experiment
• Stanovení cíle
experimentu
• Příprava vzorku • 2 DE
• Detekce
Studijním
ateriály
5/celkem
• Detekce
Obecné požadavky na vizualizaci proteinů
• široký lineární rozsah závislosti
intenzity barvičky na množství
proteinu v gelu
• kompatibilita s následnými
analýzami
(např. stříbro - glutaraldehyd!)
• vysoká citlivost
Dynamický rozsah
= graf závislosti intenzity barvičky (osa y)
na koncentraci proteinu (osa x)
Barvení stříbrem
– lineární závislost pouze v rozmezí
do 100 ng proteinu.
Při vyšších množstvích odklon od linearity.
• kvantitativní barvení
• end-point
• trvanlivost
(např. zhášení fluorescenčních
barviček!)
Studijním
ateriály
6/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
6
• Detekce Typy detekce
• fosforylace: Pro-Q Diamond (pSer, pThr, pTyr), Pierce
phosphoprotein staining kit (pSer, pThr)
glykosylace: Pro-Q Emerald, Pierce glycoprotein staining kit
• Radioaktivní značení
Značení před analýzou (DIGE – CyDye, radioaktivní značení)
Barvení po analýze
Specifické barvení: post-translační modifikace (PTM)
Nespecifické barvení: všechny proteiny
• Viditelné barvení: Coomassie brilliant blue (R250, G250), stříbro (kyselá x amoniakální varianta)
• Fluorescenční barvení: Sypro Ruby (Ex/Em = 280, 450/610 nm), Lucy (Ex/Em = 506/520 nm),
Flamingo Pink (Ex/Em = 512/535 nm), Oriole (Ex/Em = 270/604 nm), Krypton (Ex/Em = 520/580),
Deep Purple (Ex/Em = 365, 520/610 nm), Lumitein (Ex/Em = 280, 450/610 nm)
Studijním
ateriály
7/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
POZADÍ – 3D náhled
Koloidní CCB
Stříbro
SYPRO Ruby
• Detekce
Studijním
ateriály
8/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
Při analýze obrazu pracujeme s
denzitou barvičky.
• Detekce
Proteinový spot – 3D náhled
Koloidní CCB
Stříbro
SYPRO Ruby
Studijním
ateriály
9/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
?
Experiment
• Stanovení cíle
experimentu
• Příprava vzorku • 2 DE
• Detekce
• Snímání obrazu
Studijním
ateriály
10/celkem
• Snímání obrazu
Signály z biologických vzorků jsou konvertovány do
digitálních dat v odstínech šedé barvy
• formát TIFF, vysoké rozlišení
Přístroje pro snímání obrazu
Volba přístroje dle použitého typu detekce proteinů
• Viditelné barvičky : denzitometry
• Fluorescenční barvičky: fluorescenční skenery, kamery
Ex/Em spektrum se musí shodovat s Ex/Em charakteristikami přístroje
PharosFX™ and PharosFX Plus Systems
Molecular Imager GS-800
Fuji FLA-3000
Typhoon 9200 Imager
Image Scanner III
S. Ruby: Ex/Em: 280, 450/610 nm
Studijním
ateriály
11/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
?
Experiment
• Stanovení cíle
experimentu
• Příprava vzorku • 2 DE
• Barvení
• Snímání obrazu
• Analýza obrazu
Studijním
ateriály
12/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
Analýza pomocí speciálního SW
• Porovnání a vyhodnocení 2D gelů
(vizuální vyhodnocení 2D gelů není možné)
Kvalitativní vyhodnocení
Kvantitativní vyhodnocení
Statistická analýza
Přístup dle předem stanoveného cíle
• Výběr spotů, které se významně liší podle daného „designu“
experimentu (srovnání ovlivněný vzorek x kontrola – detekce „up and down“
regulovaných proteinů)
• Výběr pouze několika velmi významných spotů, které budou případně
použity jako budoucí marker
Studijním
ateriály
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
• Vývoj – kontinuální proces
• Spolehlivost
• Reprodukovatelnost
• Automatizace• Srovnání gelů různých velikostí, tvarů
• Nesmí modifikovat „raw“ data
• Různé typy SW se liší:
filozofií, stupňem možností zasahovat do vyhodnocení,
možnostmi statistických vyhodnocení, cenou.
• Příklady SW: Delta 2D, ImageMaster, Melanie, Progenesis,
PDQuest, Redfin Ludesi
SW
Výsledky analýzy jsou ovlivněny:
• kvalitou a filozofií daného programu
• uživatelem - manuální editace
Studijním
ateriály
14/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
Sejmutí obrazu
Úprava obrazu – velikost, orientace
Identifikace spotů
Přiřazení spotů („matching“) a jejich porovnání
Normalizace
Analýza dat
Report
Studijním
ateriály
15/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
Sejmutí obrazu
Identifikace spotů
Normalizace
Analýza dat
• velké rozlišení (tiff)
• všechny srovnávané gely musí mít stejnou
velikost
Report
Studijním
ateriály
16/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
Sejmutí obrazu
Úprava obrazu – velikost, orientace
Identifikace spotů
Normalizace
Analýza dat
Report
• Spot detection wizard
– průvodce nastavením parametrů pro vyhledání
spotů a odfiltrování pozadí
• Různé gely – různé parametry nastavení
Studijním
ateriály
17/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
Detekce spotů a filtrace pozadí
• Scanset
= soubor obrazů, které vycházejí z jednoho
základního gelu (3 zobrazení každého gelu)
Filtered GaussianRaw 2D image
Studijním
ateriály
18/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
• Kvantita spotu
= celková intenzita definovaného spotu v daném zobrazení gelu
(pro výpočet se používá gaussovské zobrazení)
- koresponduje s množstvím proteinu v aktuálním spotuStudijním
ateriály
19/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
Sejmutí obrazu
Identifikace spotů
Normalizace
Analýza dat
• Matchset = soubor gelů porovnávaných
navzájem v rámci experimentu
• Master gel = uměle vytvořený gel, zahrnuje
spoty ze všech srovnávaných gelů
Report
Studijním
ateriály
20/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
Sejmutí obrazu
Identifikace spotů
Normalizace
Analýza dat
Editace spotů
Report
Studijním
ateriály
21/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
Sejmutí obrazu
Identifikace spotů
Normalizace
Analýza dat
Replikativní skupiny
• máme-li 2 a více gelů od jednoho vzorku (repliky)
• umožňují seskupit kopie gelů daného vzorku a
určit průměrnou kvantitu každého spotu
• analýza gelů v replikách je podmínkou pro aplikaci
statistických nástrojů (např. Student T-test)
Studijním
ateriály
22/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
• Replikativní skupiny
Studijním
ateriály
23/celkem
• Analýza obrazu
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
Sejmutí obrazu
Identifikace spotů
Normalizace
Analýza dat
• Normalizace = kompenzace rozdílů ve velikosti
spotů a intenzitě mezi gely, které nesouvisí s expresí
• nutná podmínka pro správné srovnání
kvantity spotů
• Variace způsobené různými faktory:
- chyby pipetování během přípravy vzorku
- chyby při přípravě a zpracování vzorku
- ztráta vzorku během přenosu na gel (precipitace)
- nekonzistence v barvení/značení
- nekonzistence při snímání obrazu
- …..
• Normalizační faktor (dle zvolené metody)
• Total quantity in analysis set
• Total quantity in valid spots
• Total density in gel image
• Specified value
• Mean of log ratios
• Local regresion model
Studijním
ateriály
24/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
Sejmutí obrazu
Identifikace spotů
Normalizace
Analýza dat
• Analytický set
= soubor spotů vybraných pro studium
- umožňuje vytvářet soubory spotů se statistickou
a biologickou významností
• Kvalitativní
• Kvantitativní
• Statistické (pouze pro replikativní skupiny)
• Booleovy
• Výběrové
• Matching
Studijním
ateriály
25/celkem
• Analýza obrazu
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
• Kvalitativní
• Kvantitativní
• Statistické
• Booleovy
• Výběrové
• Matching
Studijním
ateriály
26/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
Sejmutí obrazu
Identifikace spotů
Normalizace
Analýza dat
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
Studijním
ateriály
27/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
• Analýza obrazu
• Report
Image report Quantity Table report Quantity Graph report
Vyhodnocování pomocí
PDQuest
Studijním
ateriály
28/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
?
Experiment
• Stanovení cíle
experimentu
• Příprava vzorku • 2 DE
• Barvení
• Snímání obrazu
• Analýza obrazu
• Vyřezání spotů
Studijním
ateriály
29/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
Manuálně (skalpel, spot picker)
• viditelné barvičky
• fluorescenční barvičky
- transiluminátor
Automaticky
• Spot cutter
• Vyřezání spotů
OneTouch Plus spot picker
Exquest
UV-transilluminator
(Ex: 302, 365 nm)
Ettan Spot picker
Dark Reader
(Ex: 490 nm)
Xcise
Studijním
ateriály
30/celkem
CZ.1.07/2.3.00/30.0009
Employment of Newly Graduated Doctors of Science for Scientific Excellence
?• Stanovení cíle
experimentu
• Příprava vzorku • 2 DE
• Barvení
• Snímání obrazu
• Analýza obrazu
• Vyřezání spotů • Digesce • Identifikace
• Cíl experimentu
??
Studijním
ateriály
Děkuji za pozornost.
Central European Institute of Technology
c/o Masaryk University
Žerotínovo nám. 9
601 77 Brno, Czech Republic
www.ceitec.eu | info@ceitec.cz
Studijním
ateriály