Metody makromolekulární strukturní analýzy Jaromír MAREK, Centrum strukturní biologie, CEITEC MU Obsah •Předmět studia •Sekundární struktura a CD •Metody na určování terciární struktury •RTG krystalografie •NMR •Kryoelektronová mikroskopie (Bio)makromolekulární strukturní analýza Man-Leonardo-da-Vinci arabidopsis-thaliana5 447-ziva_bunka Plant_cell_structure Summary Organismy Buňky Buněčné struktury collaboration SSBs polymerase Molekulární komplexy helicase primase ribosom 3-D struktury Centrální dogma molekulární biologie 732px-Centraldogma_nodetails Central_Dogma_of_Molecular_Biochemistry_with_Enzymes Francis Crick Centrální dogma strukturní biologie dogma-struct-biol Počet struktur k určení Počet Rozpustné/ globulární proteiny Membránové proteiny Sekvence 107 106 Exp. určené struktury 105 103 Proteinové sklady 103 102 Strukturní biologie v „postgenomické“ éře biologie DNA-proteiny DNA sekvence Proteiny pdb-all Počet proteinových struktur v PDB pdb-count Membránové proteiny membran-proteiny_structures_2012 Úrovně popisu (bio)struktur levels_of_protein_structure Primární struktura – přímé určení •MS - hmotnostní spektroskopie (mass spectrometry) •Techniky typu MALDI, Matrix-assisted laser desorption/ /ionization •Detaily - přednáška doc. Zdráhala Sekundární struktura – definice •Určující interakce –strukturu stabilizující vodíkové můstky reverse-tun bete-AP ss-alpha Sekundární struktura – nepřímé určení •Úhly φ a ψ •Vazby zapojené v a a b strukturách rama1 b-struktury a-struktury Sekundární struktura a CD spektra •cirkulární dichroismus – různá absorpce levotočivého a pravotočivého kruhově polarizovaného světla •spektrálně závislé změny - UV oblast - 170 - 260 nm •Aditivní signál (množství, délka dráhy, složky) • • CD2_960723_AFrame_63 CD-7 CD - fyzikální principy •Lineárně polarizované světlo: http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo2.htm •Lin. polarizované světlo+absorpce:http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo10.htm •Superpozice záření: http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo4.htm • http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo5.htm •Kruhově polarizované světlo: http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo7.htm •Lineárně vs kruhově polarizované světlo: http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo8.htm • •Kruhově polarizované světlo a absorpce: http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo11.htm •Kruhově polarizované světlo a cirkulární dichroismus (=rozdílná absorpce L a P složky): http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo14.htm • cd 1 CD - instrumentace cd5 CD - instrumentace • Výrobce – např. JASCO • Zdroj světla: Xe lampa • Dráha světla ve vzorku: ~ 1 mm CD_Photo_2_DB • Maximálně přečištěný vzorek • Žádné dodatečné UV absorbenty • Filtrace (parazitní rozptyl na mikronečistotách) • • Roztok – podmínky blízké fyziologickým CD – příklad aplikace – prion PrPc prion-normal_ro model RTG experiment prion CD spektrum CD – výhody a nevýhody Výhody: • nedestruktivní metoda • malé množství vzorku (200 ul @ 0.5 mg/ml) • citlivost na fyziololog. změny ovlivňující sekundární strukturu • relativně rychlá a „levná“ metoda • Nevýhody: • nejde používat koncentrované absorbující pufry • relativně nízká přesnost num. analýzy podílu a/b/ struktur • Hlavní oblast použití: Informace o stavu „sbalení“ (tzv. foldu), resp. sekundární struktuře makromolekulárního vzorku za podmínek blízkých fyziologickým pdb-all Počet proteinových struktur v PDB pdb-count (Strukturní) biologie – exp. techniky 1 nm 1 µm 1 mm buňky organely biomolekuly Protein. „stroje“ NMR, RTG kryoEM elektronová mikroskopie AFM konvenční mikroskopie Oblasti rozlišení metod a velikostní škály objektů NMR, RTG Studium 3D struktur: sonda + vzorek Sonda: • (viditelné světlo ?) • RTG záření • vlny/částice: elektrony • radiofrekvenční vlny Vzorek: • (bio)molekuly v roztoku - NMR • (bio)molekuly zmražené v ledu -kryoEM • (bio)molekuly uspořádané v krystalu - RTG • Studium 3D struktur proteinů Z roztoků PDB NMR 2001 : 2 a ¼ tisíce 2008 : 7 a ½ tisíce 2015 : 11 a ¼ tisíce Krystaly RTG difrakční techniky Přes 12 tisíc 44 a ½ tisíce Přes 100 tisíc Odhad: většina struktur přinejmenším globulárních proteinů (proteinů s dobře určenou terciární strukturou = výsledky CD) bude určována difrakcí RTG záření i v budoucnu. Studium 3D struktur: RTG+NMR RTG RTG Difrakční obraz Krystal: shodně orientované molekuly NMR RF RF Resonance H0 V roztoku RTG krystalografie - postup (0.) Příprava rekombinantního proteinu, čištění, zahušťování… 1.Krystalizace 2.Difrakční experiment 3.Fázový problém, příprava modelu 4.Zpřesňování modelu • 373px-X_ray_diffraction Krystaly •Krystal – periodicky uspořádaná látka •Opakování motivu: •posun •rotace • • • •Krystal (bio)polymeru •oblast polymeru •oblast rozpouštědla • •Čistota + stabilita vzorku FIG18_1 FIG18_3 Krystalizace proteinů •Difůzní techniky • • • • •Fázový graf • • nfgz004 gr0693fig1 Krystalizace proteinů •Problém: •Jak „rychle“ vypěstovat •„použitelný“ krystal? • • • •Empirie – sady roztoků •Souběžné experimenty •Malé (nanolitrové) objemy • •=> nasazeni robotiky • FIG18_4 crystal-gryphon-system Difrakční experiment: principy FIG18_5 FIG18_7 Interference = difrakce: 2d . sin q = n λ Difrakční experiment-schéma sch_ma_diffraction__M Difrakční experiment: zdroj RTG f47 3D_model_of_the_machine Corel-Capt Difrakční experiment: goniometr+detektor f29bd ccd-principles Difrakční experiment: instrumentace na MU DSC_2382 actor Kryokrystalografie – mj. eliminace radiačního aj. rozpadu vzorku Difrakční experiment: interpretace dat Nabitá částice je v poli rovinného monochromatického záření sekundárním zdrojem elektromagnetického pole Rozptyl na protonech je nevýznamný (je 18372x slabší), difrakcí RTG záření studujeme elektronovou strukturu látky Krystalová elektronová hustota je obráceným Fourierovým obrazem strukturních amplitud F(r) je komplexní veličina přímo neměřitelná, měříme jen její velikost => Fázový problém krystalografie Difrakční experiment: vlnění, amplituda+fáze FIG18_8 Difrakční experiment: limitované rozlišení geometrické limity na počet naměřených dat rychlé + přesné měření => co nejintenzivnější zdroj RTG „šum“ detektoru dif-image Fázový problém •cíl krystalografie– zjistit 3-D model studované (makro)molekuly •prostředek – určit při difrakčním experimentu ztracenou informaci o fázích strukturních amplitud, pak Fourierovou transformací získat mapy elektronových hustot • •nejjednodušší metoda – fázový problém vůbec neřešit, využít podobnost studovaného sytému se systémem s již známou 3-D strukturou (MR, molecular replacement). •nutná je poměrně velmi vysoká podobnost mezi modelem a studovaným systémem (AA identita cca 30% a lépe, AA podobnost 50% a lépe) sir •kanály rozpouštědla (krystalograficky neuspořádané vody) •relativní stabilita terciální struktury globulárních proteinů při interakci jejich interakci s „malými“ molekulami • •nutnost opakovaných měření s různými dobře difraktujícími izomorfními deriváty • •podobnost struktur proteinů s jejich Se-Met analogy Fázový problém: SeMet proteiny + kovové deriváty proteinů Strukturní model: vliv rozlišení FIG18_11 Nebezpečí: hlavní nebo vedlejší řetězec => chybně postavený model Strukturní model: zpřesňování FIG18_12 FIG18_12 Nelineární problém – iterativnost, konvergence Kritérium správnosti : R-faktory RTG krystalografie: výstupy monokrystal – velikost ~10-4 m, V ~10-10-10-12 m3 krystalová mřížka - mřížkové parametry ~10-8 - 10-9m - V ~10-24-10-27 m3 - typicky 2-8 „molekul“ v buňce strukturní model – „průměrná“, rovnovážná struktura (ze souboru 1012-1018 molekul) Teplotní aj. pohyby –„teplotní faktory“ (B, ev. U) teplotní elipsoidy (ORTEP) – pravděpodobnost výskytu NMR spektroskopie NMR – nukleární magnetická rezonance „nukleární: jádra izotopů s nevykompenzovanými spiny 1H, 13C, 15N •„magnetická“: externí (silné) magnetické pole •„rezonance“: pohlcování (+ vyzařování) záření (RF pásmo) je zesilováno na rezonančních frekvencích figure 3-48 NMR spektroskopie: instrumentace NMR-schema NMR1 Proteinový vzorek: objem cca 300-600 ml, mM koncentrace, čistota + stabilita figure 3-49b NMR spektroskopie: chemický posuv Chemický posuv (chemical shift) – posun resonanční frekvence (vůči standardu) Modifikace signálu: změny magnetického pole + „chemického prostředí“ figure 3-49a NMR spektroskopie: multi D experimenty Korelační ovlivňování se blízkých magnetických momentů Experiment: COSY + NOE spektroskopie FIG18_18 FIG18_18 COSY – korelační spektroskopie – korelují momenty vazebně blízkých jader (např. z jednotlivých AA) - 1D FIG18_18 NOESY - „nuclear Overhauser effect“ spektroskopie – zdroj 2D a 3D informací o „blízkých“ (d ≤ 5 Å) jádrech NMR spektroskopie: multi D experimenty FT NMR: NMR s Fourierovou analýzou Multi D experiment: několik budících pulsů 2dexp_1 figure 3-51 NMR spektroskopie: „nepřímá“ 3-D data Korelační experimenty – „přiřazení“/indentifikace píků vůči primární struktuře NOE experimenty – distanční informace o blízkých jádrech figure 3-52 figure 3-52 32ens Výsledek: ansámbl možných řešení Komplementarita experimentálních technik • • NMR RTG krystalografie • • • Výpočetní • metody + metodiky „budoucnosti“ : kryoEM, … Limitace technik: velikost studovaného systému, rychlost, možné „slepé” uličky, ... KryoEM: transmisní elektronová mikroskopie • elektronová mikroskopie –> vakuum • transmisní –> tenký vzorek • vzorek za „přirozených“ podmínek • -> Vzorek (monovrstva náhodně umístěných a náhodně orientovaných vzorků) je zmražený v (amorfním) ledu fixovaným v podpůrné mřížce msotw9_temp0 CryoEM KryoEM: počítačová rekonstrukce obrazu pohledy na „různé“ vzorky „náhodným“ směrem • • • • • • • slabý/zašuměný signál TM1 TM2 KryoEM: počítačová rekonstrukce obrazu 3D obraz : počítačová rekonstrukce z (mnoha) 2D pohledů Common_liine_proj_2 Strukturní informace: integrovaný přístup CHIK-p62E1_fit_MEsindbis Povrchová obálka alfaviru působícího „Chikungunya“ horečku. Mr = 25 MDa Červená+žlutá – 240 dimerů protein. heterokomplexu E1/E2 - výsledek RTG Virion. obálka – šedá – výsledek kryoEM