CG030 – Struktura (architektura) a
funkce proteinových komplexů
doc. Jan Paleček
jpalecek@sci.muni.cz
(garant)
UKB A2, 214
Osnova kurzu
• úvod – metody analýzy proteinových
komplexů, strukturní biologie
• funkce proteinů (chaperony, PTM, PPI,
signální dráhy …) a komplexů (proteasom)
největší proteinový komplex = chromosom
• DNA-vazebné komplexy
• Komplexy iniciace transkripce
• Komplexy opravující poškozenou DNA
• Komplexy chromatinu
• Evoluce proteinů a komplexů
obecnéchromatin
závěrečná
25.2.2016 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček Úvod, analýza komplexů
3.3.2016 10-11.50hod A2-2.11 doc. Marek Úvod do strukturní biologie
10.3.2016 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček Protein-proteinové interakce, skládání komplexů
17.3.2016 10-11.50hod A2-2.11 Dr. Muller Chaperony
24.3.2016 10-11.50hod A2-2.11 Mgr. Adamus Ubiquitinace, ligasy (cullin, APC), proteasom
31.3.2016 10-11.50hod A2-2.11 doc. Marek Signální dráhy, GPCR
7.4.2016 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček DNA-proteinové interakce, vazebné motivy
14.4.2016 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček DNA-proteinové interakce, transkripční komplexy
21.4.2016 10-11.50hod A2-2.11 Dr. Blažek Cyclin/CDK komplexy v buněčném cyklu a transkripci
28.4.2016 10-11.50hod A2-2.11 Dr. Špirek Oprava DNA, homologní rekombinace
5.5.2016 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček Chromatinové komplexy
12.5.2016 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček Evoluce proteinových komplexů
19.5.2016 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček Zkouška - test
Program přednášek 2015
- Pohled na vybrané procesy probírané v biochemii a molekulární biologii z
hlediska proteomiky a především z hlediska proteinových komplexů
- výběr komplexů majících vztah k tématům studovaným v laboratořích
„chromatinových molekulárních komplexů“, NCBR a dalších skupin z MU
chromatinobecné
- doporučení přednášek: Struktura a funkce eukaryotických
chromozomů (C9041, prof. J. Fajkus) …
Informační zdroje
Alberts a spol: Molecular biology of the Cell
Liljas a spol: Structural biology (2009) …
… nejnovější články z časopisů Cell, Nature, Science, PLoS …
Databáze proteinových struktur: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do,
http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/
Zkouška: - test + přednáška
• Úvod - Analýza proteinu
– Domény
• fold-struktura (ss, PDB)
• v PyMolu připravit 3D strukturu
• Interakce (IntAct)
– Komplexy
• Funkce
• Lokalizace
– evoluce
• Konkrétní nová data – článek (< 5 let)
Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat
poznatky z přednášek …
Primárním zdrojem strukturních informací = PDB
Interaktivní web PDB-101 - relativní velikost komplexů
voda, ATP ATP pumpa
mikrotubuly chromatin
proteasom
TFIIB
Rpb4/7
RNA pol II
TFIIE
TFIIF TFIIH
TBP
TFIIA
enhanceosom
Příklady komplexů o kterých uslyšíte v tomto kurzu
chaperon
RNA polymeráza
nukleosom
RNA polymeráza + TFII…
obecné
chromatin
Molekula měsíce (PDB 101)
~800 komplexů v kvasince Saccharomyces cerevisiae
Bertero et al, Cell, 2010
Nejčastější postup charakterizace
proteinových komplexů
Nový gen/protein – charakterizace funkce a funkčního kontextu =>
1. - identifikace partnerů tzn. PPI respektive izolace komplexu
2. - charakterizace komplexu
- vzájemné PPI podjednotek - architektura/struktura komplexu
- funkce podjednotek (genetická analýza, lokalizace v buňce …)
3. - rekonstituce a analýza aktivit celého komplexu in vitro
Prolínají se analytické a izolační:
- ultracentrifugace, gelová filtrace
- TAP-tag (a jiné tagy) purifikace a MS analýza
- ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace …
- crosslink MS, (cryo) elektronová mikroskopie …
(Prolínají se i metody pro komplexy a PPI - viz MGP – 3.5.2016)
… visualizační metody
Metody izolace a analýzy
proteinových komplexů
viz MGP – 3.5.2016
Metody analýzy a izolace PKxů
Ultracentrifugace – analytická (preparativní – malé objemy)
Cukerný/hustotní gradient
Čím hustší je roztok tím více „brzdí“ částice => těžší částice projdou dál
přesně vyvážit!
Cukerný/hustotní gradient
A. Hrubší pouze rozdělí na
kompartmenty/organely
B. Jemný - cukerný gradient
Lee et al, Plant Cell Phys, 2004
T – total
S – soluble
M – membranové
frakce (… jaderná
…)
Metody analýzy a izolace PKxů
Čím hustší je roztok tím více „brzdí“ částice => těžší částice projdou dál
Ultracentrifugace – analytická (preparativní – malé objemy)
- Gelová filtrace (size exclusion chromatography)
- Za nativních podmínek (komplexy zůstávají pohromadě)
Lze poznat zda proteiny tvoří oligomery, agregáty
Metody izolace a analýzy PKxů
Tayloretal,MCB,2008
GF: frakce lyzátu
lidských buněk –
podjednotky SMC5-6
komplexu identifikovány
pomocí protilátek
Příklad: SMC5/6 komplex – v buněčném lyzátu (nebo
purifikované proteiny viz dále)
- TAP-tag („Tandem-affinity purification“,
jiné tagy a protilátky)
Tandem-affinity purification
(vícestupňové – vyšší čistota)
1. Protein A (váže IgG beads)
2. TEV-proteasové místo (tobacco
etch virus) – uvolnění z matrice
3. calmodulin-binding
(CBP) – eluce EDTA
Zaintegrované v genomu (přirozená
hladina proteinu, přirozený výskyt
partnerů/komplexu …)
Protein CBP A
Puig et al, Methods, 2001
I jiné kombinace
(HBH – His-biotin-His)
Metody izolace a analýzy PKxů
známe jeden protein – hledáme další
podjednotky
Velmi vhodný HALO tag pro izolaci komplexů: kovalentně vázaný ligand (silnější
vazba, více oplachů)
Metody izolace a analýzy PKxů
Uvolnit lze pouze proteolytickým štepením (nevýhoda) – vs štěpení specificky uvolní
pouze komplex z matrice (nespecificky navázané proteiny zůstanou na matrici)
Jednoduché tagy/značky:
Myc, FLAG, V5, S-tag, GFP (vazba přes protilátky)
GST, Streptactin (biotin-streptavidin), MBP … (vazba přes ligandy)
Známe-li více podjednotek - značky na různé
podjednotky komplexu (vs TAP na jedné
podjednotce) – postupná purifikace => kompletní
komplex (vychytaný přes různé podjednotky)
Metody izolace a analýzy PKxů
MS analýza SDS-PAGE
nebo roztoku
Pozor na kontaminace
(např. chaperony)
SDS-PAGE
blot
Sergeantetal,MCB,2005
protilátky
Kompetičníeluce(peptidyneboligandy)
Gavin et al., Nature, 2006
Izolace komplexů z kvasinky Saccharomyces cerevisiae
2
Lambertetal,JProt,2015
Různé přístupy izolace komplexů
Biotinylace na
vzdálenost
<20nm
MS identifikace
biotinylovaných
proteinů
klasický alternativní
Metoda BioID
Roux, CMLS, 2013
BirA biotin ligása (fusovaná k proteinu)
Biotinylované proteiny jsou purifikovány pomocí streptavidinu
Přidání biotinu v
určitém čase (rychlé
připojení) – pulsechase
– lze sledovat
interakce v čase
(např. buněčný
cyklus)
Např. chromatinasociované
komplexy
jsou hůř rozpustné –
izolace za
denaturačních
podmínek
Citlivá metoda
(kovalentní značka
zústává i po oddálení
interakčního partnera
– slabé/transientní
interakce (ne celý
komplex – pouze
„sousedící“ proteiny
<20nm)
Lambert et al, J Prot, 2015
Přidání biotinu v
určitém čase (rychlé
připojení) – pulsechase
– lze sledovat
interakce v čase
(např. buněčný
cyklus)
Např. chromatinasociované
komplexy
jsou hůř rozpustné –
izolace za
denaturačních
podmínek
Citlivá metoda
(kovalentní značka
zústává i po oddálení
interakčního partnera
– slabé/transientní
interakce (ne celý
komplex – pouze
„sousedící“ proteiny
<20nm)
Histon chaperony
(5.5.2016)
Roux, CMLS, 2013
Sinz, MS Reviews, 2006
Identifikace
podjednotek
komplexu
Mapování
interakcí
podjednotek
Mapování komplexů - crosslinking
crosslink propojí podjednotky - stabilizuje komplex
Po crosslinku komplexu lze provádět purifikaci za denaturačních podmínek (tag-ligand
interakce musí být odolná vůči denaturačnímu činidlu – např. 6xHis-tag váže Ni-kuličky
i v 8M močovině)
- estery reagují s Lys (e-amin) a aminokoncem
(homofunkční - spojí proteiny
dohromady v jednom kroku;
heterofunkčních - postupná aktivace)
- s tagem – přečistit (vzorek není tak
komplexní pro MS analýzu)
Mapování interakcí mezi podjednotkami
pomocí crosslinking
Veld et al., Science, 2014
Příklad jednoduchého komplexu
Nguyen et al., Cell, 2013
příklad velkého komplexu
(zjednodušené schéma – jak
jsou podjednotky
„prosíťovány“ – jak jsou v
prostoru blízko sebe)
Integrace dalších dat:
- krystalové struktury
- cryoEM data
Analýza architektury komplexů (SWR = remodelovací)
- (ko-)purifikované komplexy lze dále analyzovat pomocí elektronové
mikroskopie (cryoEM)
- srovnat tvar různých komplexů (bez spec. podjednotky nebo s protilátkou
proti specifické podjednotce) Nguyen et al., Cell, 2013
Nguyen et al., Cell, 2013
Analýza architektury
proteinových komplexů
- krystalové (a NMR) struktury
lze následně „dokovat“ do tvarů
z EM
Nejlepší cryoEM mají rozlišení až 4A
Bai et al, eLife, 2013
Gallego et al, EMBO J, 2016
Konfokální mikroskopie vs
super-resolution
mikroskopie
(STED=stimulated emission
depletion microscopy –
rozlišení 60nm)
+ AFM (atomic force
microscopy)
Lokalizace
proteinových
komplexů
Gallego et al, EMBO J, 2016
Bax protein vytváří póry v
mitochondriální membráně
(apoptósa)
Lokalizace
proteinových
komplexů
Visualizace proteinových komplexů
Existuje mnoho
nástrojů na
visualizaci
komplexů
od PyMOL pro
přímou visualizaci
krystalových
struktur … 3D tisk
Johnson et al., Nat Meth, 2015; Iwasa, CO in SB, 2015
Visualizace proteinových komplexů
Existuje mnoho
nástrojů na
visualizaci
komplexů (i v
buněčném
prostředí)
od PyMOL pro
přímou visualizaci
krystalových
struktur
… až po CellPACK
pro interaktivní
náhled do buňky a
jejích procesů
…vychází z herních
a animačních
algoritmu …
Pro lepší představu (virové částice) se integrují …
(nakopírované) struktury, data z molekulární dynamiky
(simulací), koordináty pohybu „objektu“ ve světelném
mikroskopu … animovat i buněčný kontext – namíchat v
„reálných“ poměrech do „organel“ a na „membrány“ –
CellPack …
Lze použít k testování modelů …
Visualizace proteinových komplexů - CellPACK
CellPACK poskytuje vhled do
buněčných procesů – použit
na simulaci distribuce proteinů
virové částice (např. R-noMa:
random-bez interakcí)
Env clusterGag-Env náhodné Gag-Env intetragují
Speranzini et al, EMBO J, 2016
Analýza proteinových komplexů
více doc. Marek více Metody GP
více C7230 doc. Hofr
Ozeretal,COinSB,2015
Analýza proteinových komplexů