Ukázka CellPACK-UNITY Osnova – charakteristika proteinových komplexů – proteiny jako adaptéry a lešení – protein-proteinové interakce – vliv post-translačních modifikací na PPI – inhibice PPI … přerušení protein-proteinové interakce je relativně snadné u slabých dimerů – větší komplexy jsou většinou stabilizovány více interakcemi a je tedy obtížnější je narušit NSE1 Nse3 M AG EG 1 NSE4 NSE2 SMC6 SMC5 Stabilita komplexu je zpravidla větší než pouhý součet jednotlivých protein-proteinových interakcí mezi podjednotkami (větší povrch, efekt přiblížení a zorientování partnera …) Nse4 Pull-down kvasinkový 2 a 3-hybridní systém wt mut A B E D C F Proteinový komplex … ale (záleží na typu komplexu – viz adaptory) pokud schází podjednotka, tak nefunguje celý komplex (nebo jeho specifická funkce) – komplex se nesestaví/rozpadá TaylorE.M.etal.,MCB,2008 NSE2 NSE1 Nse3 MAGEG1 NSE4 SMC6 SMC5 Delece kterékoli podjednotky je pro kvasinkovou buňku letální - Mutace mají relativně podobný fenotyp, ale … Deplece kterékoli podjednotky lidského komplexu má za následek pokles hladiny ostatních proteinů Sergeant et al., MCB, 2005 Figure 3-79 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Některé komplexy jsou modulární – např. SCF (Skp-cullin-Fbox) různé cullin nebo Fbox (adaptor) molekuly - různé komplexy rozeznávají různé substráty (ubikvitinace) - delece jednoho F-box proteinu/genu eliminuje pouze subset substratu - delece jednoho cullin proteinu/genu eliminuje větší spektrum substratů - delece jednoho RBX (RING-finger) proteinu/genu eliminuje většinu substratů (je i více RBX podjednotek) Network/interaktom SCF komplexů a jejich substrátů Figure 3-82 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Protein-proteinové interakce modulují velmi často GDP-GTP konverze – konformační změna (doc. Marek) – „přenáší“ signál Mnoho proteinů obsahuje pouze interakční domény a mají jediný úkol: nukleace multiproteinových komplexů – scaffold (lešení, STE5) Uetz and Finley, FEBS Lett. 2005 Fanconi anemia „komplementační skupiny“ – geny/proteiny jejichž mutace způsobují FA syndrom – ukázalo se, že většina z nich tvoří jádro FANC komplexu Jones, CMLS, 2012 Co mohou způsobit mutace: genetická analýza A B E D C F Proteinový komplex Syntetická letalita Suprese Stabilní proteinové komplexy jsou složené z jednotlivých proteinů/podjednotek které spolu interagují - pokud schází podjednotka, tak nefunguje celý komplex – komplex se nesestaví/rozpadá TaylorE.M.etal.,MCB,2008 NSE2 NSE1 Nse3 MAGEG1 NSE4 SMC6 SMC5 Deplece kterékoli podjednotky lidského komplexu má za následek pokles hladiny ostatních proteinů Sergeant et al., MCB, 2005 Podjednotky komplexů koexprimovány (ko-translace) Proteiny s nimiž ko-purifikovala jiná než jenom vlastní mRNA Duncan & Mata, PLoS Genetics, 2011 (S. pombe) = Arp4 Duncan & Mata, PLoS Genetics, 2011 (S. pombe) Proteiny se skládají hned po translaci, nebo za pomoci chaperonů, nebo až v určitém místě (např. v mitochondrii po odštěpení signální sekvence …) - často jsou podjednotky komplexů koexprimovány (podobná regulace transkripce + ko-translace) samostatně by se neposkládaly, byly by nestabilní, toxické nebo by agregovaly (filamenta; protein-proteinové interakce často přes hydrofobní povrchy a je třeba je vytvořit co nejdřív) - koexprese a kopurifikace proteinů (kdo purifikuje proteiny?) nebo se proteiny skládají a interagují již při translaci Komplexy se utvářejí (převážně) prostřednictvím protein-proteinových interakcí • Polypeptidový řetězec má tendenci vytvářet sekundární struktury -> terciární struktury -> quarterní tj. komplexy (stejné typy nekovalentních vazeb, kritérium minimální energie) (šroubovice a listy se k sobě skládají podobným způsobem) • iontové, vodíkové, hydrofobní síly (kovalentní vazby disulfidické můstky především u extracelularních proteinů) • vodíkové můstky především u b-listů Komplexy se utvářejí (převážně) prostřednictvím hydrofobních protein-proteinových interakcí - hydrofobní zbytky jsou tlačeny dovnitř proteinu (nikoli do solventu) nebo do interakce (nejčastější způsob vazby) – součet hydrofobních sil je značný (převažuje u většiny interakcí) – hydrofobní povrchy se podílí na vytváření coiled-coil vláken fa d e b f c g ad c g f e b Coiled-coil doména je častým dimerizačním modulem proteinů - Ostatní domény/moduly lze definovat pouze obecně: proteiny musí mít komplementární tvar i charakter - Variabilita je velká – nelze je jednoduše definovat obtížná predikce (založená na struktuře „vyřešených“ komplexů, v roce 2010 pouze 300 struktur s partnery z celkem desítek tisíc PDB dat) Dva příklady „vyřešených“ komplexů Baderetal,FEBSLett,2008 - Interakční plocha/oblast 1150-10000A2 (vs pro ligandy 100-600A2) - vazba na fosfo-, acetyl-peptidy … - z analýzy protein-proteinových interakcí lze usuzovat na potenciální stabilní komplexy vs přechodné interakce - variabilita interakčních povrchů je velká => variabilita PPI (nelze je jednoduše definovat) S jakými partnery a jak silně interagují vaše proteiny? Jaké domény obsahují? Baderetal,FEBSLett,2008 interaktom Post-translační modifikace značně mění povrch (tvar, náboj) – vytváří specifický nový povrch – mohou interagovat specifické vazebné domény - např. SH2 domény váží fosfopeptidy – dvě vazebná místa (fosfoTyr a peptid – peptid určuje vazebnou specificitu) Modifikace AMK zbytek interakční doména Fosforylace tyrosin SH2, PTB serin/threonin 14-3-3, WD40, WW, BRCT acetylace lysin bromodoména metylace lysin chromodoména hydroxylace prolin VHL b ubiquitinace lysin UIM, UBA, CUE SUMOylace lysin SIM Dr. P. Muller Dr. M. Špirek Např. SH2 domény váží fosfopeptidy – dvě vazebná místa (fosfoTyr a peptid – peptid určuje vazebnou specificitu) – PDB: 2PLD Např. BRCT doména váže fosforylovaný histon – fosforylace v místě poškození DNA – PDB: 3141 Bottomley, EMBO Rep., 2004 Modifikace histonů ovlivňují složení a přístupnost chromatinu – bromodoména GCN5 (HAT) navázaná na acetylovaný H4 lysin – PDB: 1E6I SH2 (a jiné) domény jsou často (jako moduly) součástí proteinů rozmanitých funkcí – provazují proteiny mezi sebou (přechodně, kondicionálně – regulace buněčných procesů) Golemis a Adams - kinása se váže na částečně fosforylovaný substrát a dále ho fosforyluje (MAPKKK signální dráhy) nebo se self-aktivuje JinaPawson,PTRS,2012 Figure3-69MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008) SH2/3 = Src homology SH2 váže fosfopeptid SH3 váže Pro-rich motif (-X-P-p-X-P-) SH3 domény váží prolin-rich peptidy PDB: 4RTV ubiquitinace většinou jsou vlastnosti proteinů/komplexů kontrolovány a modifikovány prostřednictvím jejich interakcí a modifikací se sousedními proteiny a dalšími komponentami buněk (DNA, RNA, fosfolipidy, cukry a sekundárními posly) Replikace Oprava DNA Buněčný cyklus Uetz and Finley, FEBS Lett. 2005 Přeskládáním modulů lze vytvářet komplexní biologické systémy - záměna některé kinásy přesměruje signál do jiného cíle - v průběhu evoluce některé moduly fůzovaly - některé viry využívají buněčné moduly k invazi do buněk (přesměrování ve prospěch viru) - některé onkogeny jsou výsledkem fůze modulů Ivanov et al, TiPS, 2013 Signální dráha (aktivace) - PPI předají Komplexy (degradace supresoru) - některé viry využívají buněčné moduly k invazi do buněk (přesměrování ve prospěch viru) - některé onkogeny jsou výsledkem fůze modulů Problémy inhibice (vývoje léků) … - interakční plocha 1150-10000A2 (větší než kapsy enzymů pro malé ligandy) - ploché bez hlubokých kapes (jako pro ligandy) - hydrofobní charakter PPI (nerozpustnost léku) - nelze vycházet z přirozených ligandů (jako u enzymů) … ale - interakce „peptid ve žlábku“ jsou relativně malé - lze inhibovat interakci i relativně malou molekulou (hot-spot) - vhodné je cílení na interakce regulované post-translační modifikací (viz fosfopeptidy) - mimikování peptidů (a, b) Inhibice PPI Ivanov et al, TiPS, 2013 Whitby a Boger, ACR, 2012 Inhibice PPI: p53-MDM2 Shangary & Wang, Annu Rev Pharm Toxicol, 2009 HP-E6 ubiquitinace p53-MDM2 (dimer, PDB: 1YCQ) - Inhibice interakce MDM2 stabilizuje p53 – podpora nádorové suprese jeden z prvních Inhibice PPI: p53-MDM2 MDM2-nutlin (PDB: 4HG7) Ivanovetal,TiPS,2013 větší komplexy jsou stabilizovány více interakcemi, ale může se rozpadnout i celý komplex nová peptidomimetika peptidomimetika peptidomimetika fosfopeptidová vazba acetyl-peptidová vazba kapsa pro ATP Labbe et al., NAR, 2015 Závěry • Stabilita komplexu je zpravidla větší než pouhý součet jednotlivých protein-proteinových interakcí • funkce celého komplexu je závislá na každé podjednotce (komplex se nesestaví nebo rozpadne bez všech podjednotek) • některé podjednotky mohou plnit funkci adaptérů či lešení (scafold) • proteiny jsou spojeny prostřednictvím interakcí mezi doménami – interakce mohou být modulovány posttranslačními modifikacemi (dynamické komplexy)