Zkouška: - test + přednáška
• Úvod - Analýza proteinu
– Domény
• fold-struktura (ss, PDB)
• v PyMolu připravit 3D strukturu
• Interakce (IntAct)
– Komplexy
• Funkce
• Lokalizace
– evoluce
• Konkrétní nová data – článek (< 5 let)
Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat
poznatky z přednášek …
- komplexy podílející se na replikaci DNA
- komplexy účastnící se přepisu informace
- komplexy opravující poškozenou DNA
- komplexy vytvářející strukturu chromosomu
- samotný chromosom je obrovským dynamickým
nukleoproteinovým komplexem (nikoli holá DNA)
TRANSKRIPCE
OPRAVA DNA
Co zde schází??
Chromatin = histony …
- Samotný chromosom je obrovským dynamickým
nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi
- DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými
komplexy – (lidský genom 3x109bp – natažený řetězec 1chromosomu cca 4cm!!)
Average human chromosome:
DNA molecule: ~4 cm
Mitotic chromosome ~4 µm
10 000x
Genome sizes:
human 3 billion bp 2 m
field bean 13 billion bp 9 m
trumpet lily 90 billion bp 60 m
salamander <120 billion bp 80 m
- Samotný chromosom je obrovským dynamickým
nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi
- DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými
komplexy – (lidský genom 3x109bp – natažený řetězec 1chromosomu cca 4cm!!)
- komplexy vytvářející strukturu chromosomu
- vytváří základní strukturu
- nukleosomy (histonový oktamer) a histony (H1)
- HMG, HP proteiny
- vytváří specializované domény
- centromery, telomery
- podílí se na dynamice struktury
- kohesin, kondensin a SMC5-6 komplex
přednášky prof. Fajkuse:
Struktura a funkce eukaryotických chromozomů (C9041)
Nukleosom
oktamer histonů
H2A, H2B, H3, H4
histon fold
komplexy vytvářející strukturu chromosomu
- 146bp – histon fold - centrální část DNA váže tetramer H3-H4
- okraje DNA vážou dimery H2A-H2B
- 10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice H3 (acetylovaný K56)
Skládání histonů do nukleosomu
(komplexu)
- 146bp - centrální část DNA váže tetramer H3-H4
- H3 dimerizuje přes postraní šroubovici
- okraje DNA vážou dimery H2A-H2B
- 10bp konce DNA vážou šroubovice H3
(acetylovaný K56)
Ransom et al, Cell, 2010
H3-H4
Figure 4-26 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Sestavování nukleozomu:
- Silnější je interakce mezi H3-H4
- H3 dimerizuje přes postraní šroubovici a
vytváří tetramer který asociuje s DNA
- dimery H2A-H2B se vážou následně z obou
stran tetrameru (H3-H4)2
- při uvolňování odpadají nejdříve dimery H2A-
H2B
- H2A a H3 existují ve více variantách, které
mohou být zaměněny v nukleosomu
Ransom et al, Cell, 2010
Nabalování a rozbalování histonů
- H3-H3 interakce = dimer
- dimery H2A-H2B (H2A – váže H3)
Histonové H3-H4 chaperony
Ransometal,Cell,2010
- Postupné sestavování (a uvolňování) histonů je zprostředkováno různými
chaperony (+ ATP-dependent remodeling “stroji”) – „chaperony pro komplexy“
- ASF1 (antisilencing function, tetramerizace) => CAF1 (chromatin assambly factor, vazba k DNA)
Ransom et al, Cell, 2010
Histon chaperony - replikace
- na ssDNA nukleosomy nejsou: replikace, transkripce, oprava DNA ...
- před těmito procesy se musí histony odstranit a poté zase nabalit …
(feedback: inhibice chromatin assembly inhibuje disassembly nukleosomů)
- 1. ASF1 (váže MCM a PCNA) a 2. CAF1 (assembly) pro H3-H4
disassembly a assembly
250-300bp – cca nukleosom
H3K56Ac
- histon chaperon komplex FACT (facilitates chromatin transcription) je
složen ze 2 podjednotek (Spt16 a Pob3/SSRP1)
- dimerizační část také interaguje s DNA-polymerásou (spojení s
replikací)
- rozeznává histon H2A-H2B heterodimer
(interferuje s vazbou na DNA
tzn. rozrušení vazby H2A-H2B s DNA)
FACT komplex
Hondele et al., Nature, 2013
disassembly a assembly
Histon chaperony
- nově syntetizované H3 (replikace) jsou acetylované na K56 – jsou specificky
rozeznávány a zainkorporovávány CAF-1 komplexem
- acetylace K56 (šroubovice) interferuje s vazbou na DNA (cca 8x slabší)
- pozice nukleosomu je náhodná a následně je „upravená“ pomocí
remodelačních komplexů (a teprve poté je H3 K56 deacetylován a stabilizován)
- pozdější acetylace (Gcn5-HAT) rozvolňuje nukleosomy v místech transkripce
Figure 4-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Histonové varianty
(u kvasinek gH2A
fosforylovaný H2A)
Mattiroli et al., EMBO Rep, 2015
Mattiroli et al., EMBO Rep, 2015
Variantní histony mohou vyznačovat hranice chromozomálních domén.
(A) Typický chromozom vykazující doménové členění. (B) V kvasinkách
brání H2A.Z šíření umlčeného chromatinu do sousedních oblastí…
(D) Centromerické nucleozómy obsahují centromerickou variantu H3.
Variantní histony
- CenH3/CENP-A … specificky v centromerách
- H2A.Z - v regulaci transkripce, opravě DNA, hranice chromatinu
(integrita centromer a telomer)
- možnost nově zabudovat histonové varianty pomocí chaperonů
a remodelačních komplexů
- nejznámější: CenH3/CENP-A (specificky v centromerách –
ukotvení kinetochor – klíčový pro segregaci chromosomu)
- H2A.X klíčový v opravě DNA
- H2A.Z v regulaci transkripce, opravě DNA, hranice chromatinu
Figure 4-48 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
specifický chromatin s CENP-A histonem kotví kinetochory tah
mikrotubulů (a kohesiny) zajišťují správnou segregaci v
anafázi
Repetitivní sekvence vytvářející
specifický chromatin – CENP-A
histon, který kotví kinetochoru
(kolem je pericentromerický
heterochromatin a SMC
komplexy)
tah mikrotubulů a kohesiny
zajišťují správnou segregaci v
anafázi
Centromery
Ransom et al, Cell, 2010
- poškozená DNA signalizuje/spouští
„DNA damage checkpoint“ - kinasy
- H2A.X varianta je fosforylována (v
okolí poškození ~50kb během 15min;
H2A u kvasinek)
- po opravě poškození je gH2A.X
vyměněn FACT komplexem za
nefosforylovaný H2A.X (a H2A)
- nefosforylovaný H2A.X je chráněn
před FACT ribosylací (PARP1)
- H2A.Z varianta je zainkorporována v
okolí poškození (SWR a Chz1) a
pomáhá resekci DNA
- ukončení opravy je signalizováno až
dokončením chromatinového vlákna
Oprava poškozené DNA – H2A histony
Tsabar & Haber, CO in GD, 2013
H3K56Ac - positioning
Oprava poškozené DNA - chromatin
Upravené z Tatum & Li, 2011
- na ssDNA nukleosomy nejsou … oprava DNA
- před těmito procesy se musí histony odstranit a poté zase nabalit …
- pro malá poškození (NER, BER) postačí menší změny chromatinu zatímco
pro větší (DSB - resekce DNA tj. vznik ssDNA) musí nukleosomy odstranit
- NER (BER) doprovázeno acetylací histonů a remodelací (posuvem)
- při DSB musí být odstraněny nukleosomy pomocí ASF1 a CAF-1, aby
mohlo dojít k účinné resekci (patrně fyzicky spojené procesy)
- po opravě poškozené DNA jsou nukleosomy uloženy zpět (díky interakci
PCNA s ASF1 a CAF-1 – i zde je H3 K56 acetylován)
- Sgs1/BLM interaguje s CAF-1 a reguluje jeho funkci
- až kompletní reassembly chromatinu signalizuje dokončení opravy!
Sabarinathan et al, Nature, 2016
- pro malá poškození (NER, BER) postačí menší změny chromatinu zatímco
pro větší (DSB - resekce DNA tj. vznik ssDNA) musí nukleosomy odstranit
- NER (BER) doprovázeno acetylací histonů a remodelací (posuvem)
- nová studie ukazuje, že NER je méně účinný (DNA je méně přístupná) v
místech okupovaných nukleosomy (a transkripčními faktory)
Billon a Cote, BBA, 2012 Bao a Shen, Snapshot in Cell, 2010
Remodelovací komplexy
- ATP-dependentní remodelace (SWI2/SNF superrodina)
- „sklouznutí“, rozložení, odstranění nukleosomu nebo „výměna“ histonových
dimerů
- SWR komplex specificky zaměňuje H2A-H2B dimer za H2A.Z-H2B
bromodoména
- H2A.Z - v regulaci transkripce, opravě DNA, hranice chromatinu
(integrita centromer a telomer)
- „sklouznutí“, rozložení, odstranění nukleosomu nebo „výměna“ histonových
dimerů
Bao a Shen, Snapshot in Cell, 2010
- H2A.Z je důležitý pro aktivaci transkripce
- 1 nukleosom up- a 1 nukl. down-stream TSS
- odstraněn po aktivaci transkripce …
Billon a Cote, BBA, 2012
RSC remodelovací komplexSNAPSHOT,Cell(144),2011
RSC (SWI/SNF) komplexy obklopí nukleosom (rozvolní se vazba s DNA a posouvá se)
Gerhold a Gasser, TiCB, 2014
- RSC (SWI/SNF) komplexy obklopí
nukleosom (rozvolní se vazba s DNA a
posouvá se)
- nukleosom se zavěšen na SWR-C
komplexu – komplex váže ještě dimer,
který je schopen vyměnit
- nukleosom je uchopen INO80
komplexem (přes podobné složení
podjednotek – fungují odlišně)
Yen at al, Cell, 2012
- distribuce nukleosomů
není uniformní – vliv
remodelačních komplexů
NASP chaperon
přidává histon H1
- nukleosom/H1
– další non-histon
proteiny –
chromatinové
vlákno
Vazba H1 uzavírá remodelaci chromatinu
Figure 4-20 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
mitotický interfázní
SMC6 SMC5
- SMC jsou nezbytné pro
vytváření chromatinových
smyček
- podílí se na regulaci
segregace chromosomů a
na opravě DSBs
- složení SMC komplexů
- dlouhá ramena SMC,
dimerizace přes hinge,
ATPase heads
přemostěny ATP a
kleisinovou podjednotkou
- SMC proteiny vytváří
kroužky, které drží DNA
Komplexy SMC
Složení:
SMC dimery (homo- a hetero-) - konzervovanější (starší) než histony
non-SMC podjednotky (2 – 6)
Prokaryota Eukaryota (esenciální)
homodimer 2x
- nejlépe prostudovaný kohesin – objímá
DNA – pojme 2 vlákna (chromatinová
smyčka nebo sesterské chromatidy)
Haering a Gruber, Cell SnapShot, 2015
Bonora et al, CO in GD, 2014
Kohesin interaguje s CTCF …
- CTCF „izoluje“ transkripční
faktory a reguluje trankripci
- interaguje s kohesinem a podílí
se na utváření vyšších
chromatinových struktur
Carlsten et al., TiBS, 2013
… a kohesin interaguje s mediatorem
- mediator interaguje s GTFs a
RNA polymerázou
(zprostředkuje interakce mezi
GTFs a aktivátory transkripce)
- kohesin interaguje s
mediátorem a napomáhá tvorbě
transkripčních smyček
Bodnar & Spector, Cell, 2013
Phillips-Cremins et al, Cell, 2013
- kohesin se podílí na regulaci
„cell-specific“ transkripce a
chromatinové struktury (ukazuje
se jak úzký vztah mezi těmito
úrovněmi existuje)
- kombinace interakcí kohesinu s
CTCF a mediátorem jsou klíčové
pro „buněčnou specificitu“
Merkenschlager, ARGHG, 2016
Struktura chromatinu je utvářena množstvím smyček a hierarchických domén
(struktura interfázního chromatinu)
Maeshima et al, Chromosoma, 2014
Chromatinové domény mají různou strukturu smyček a vláken
– lokalizace domén v prostoru jádra – ukotvení
(heterochromatinu v blízkosti membrány NP)
Dynamika chromatinuDr. Grobsky
Hirano, CSHPB, 2015
- kohesin a kondensin v průběhu buněčného cyklu (viz video) – kohesin
drží sesterské chromatidy při sobě – kondensin I a II vytváří kompaktní
chromosomální struktury
Hirano, CSHPB, 2015kohesin
mikrotubuly
- kohesin a kondensin v průběhu buněčného cyklu (viz video) – kohesin
drží sesterské chromatidy při sobě – kondensin I a II vytváří kompaktní
chromosomální struktury
Kschonsak a Haering, BioEssays, 2015
Kondensin I „zužuje“ zatímco
komplex II kondensuje podélně
(osově)Hirano, CSHPB, 2015
Kondensin tvoří centrální osu (červená) – organizuje
nepravidelné smyčky chromatinových vláken
Woodcock a Ghosh, CSHPB, 2010
Zakari et al., WIREs Dev Biol, 2015
Yen et al., Cell, 2013
- na navlečení kohesinu na DNA a jeho
stabilizaci se podílí mnoho faktorů (loading
faktor NIPBL/MAU2, acetylace ESCO1)
- kohesin je odstraněn z ramen při
kondenzaci, ale na centromerách ho chrání
shugoshin
- v anafázi je otevřen separasou
1. model
segregace
chromosomů
(S. cerevisiae)
APC=anaphase promoting
complex
Uhlmann et al., Nature, 1999
Komplex Mad2/Cdc20
inhibuje APC – po jeho
uvolnění degraduje
(ubiquityluje) sekurin –
uvolní se tak separasa
– štěpí Scc1 kleisin
kohesinového komplexu
Separasa-sekurin
Kohesin a SMC5/6 napomáhají při opravě dvou-řetězcových
zlomů v G2/M fázi (kohesin drží homologní sesterské chromatidy
při sobě – lepší HR)
Haering a Gruber, Cell SnapShot, 2015
Mannini et al, Hum Mut, 2013
Remeseiro & Losada, CO in Cell Biol, 2012
mutace podjednotek kohesinu a jeho
regulačních faktorů způsobují
kohesinopatie (např. Cornelia de Lange
syndrom = transkripční defekt) a různé
typy nádorů (defekt segregační – 95%
nádorů je aneuploidních)
Cuylen & Haering, Cell Stem Cell, 2010
mutace v mediatoru:
mental retardation syndroms
(FGS/Opitz-Kaveggia S.,
Lujan-Fryns S., schizophrenia)
Kim Peek (Rain Man)