Mario TiDÍrek, mspirek(a)med.muni.cz
Oprava DNA, homologní rekombinace
Popkodenie DNA
Zdroje popkodenia:
1. endogénne - chyby pri replikácii DNA
- bukový metabolizmus (kyslíkové radikály)
2. exogénne - UV, rôntgenové a gamma xiarenie
(ionizujúce xiarenie, rádioterapia)
Wavelength
[meters}
10*
ío-5
.5 x 10"6
10"8
10-10
^^Ay\AA/VWWli
- mutagenně chemikálie (chemoterapia)
- vírusy
Dôsledky neopravenej DNA
O
Metabolism
healthy cell rare or ona damage = rara or rapatf
Damage
nuclear
DNA. \
[
upta Eíd.aaa
DNA madiľicaJtton events per cell per day
nnlLDGhoriti rial □HA
Pathology
cancer
diseased ceil rsts <tf ONA damage > raía of ropau
seneserce
apoptosis
Damage
Pyrimidine dinners UV
I T
Single and double J^rays strand breaks
Alkylation -
Base damage ——-
DNA-protein crosslinks (P)7"" ~~
A
DNA-DNA crosslinks:
intrastrand--
interstrand
DNA intercalation
Deputation
Repair enzymes
Photolyase Ligase
Aikyrtransferase Insertase
Excision repair enzyme complex:
Mismatch repair defects (e.g., HNPCC)
▲
Glycosylases (base excision repair)
Exonucleases
Endonucleases
Topoisomerases
Polymerases
Helicases (nucleotide excision repair)
Xeroderma pigmentosum Bloom syndrome Cockayne syndrome
AP endonuclease
Mutácie ako zdroj rakoviny
V prostredí bez mutagénov je pravdepodobnosuvzniku mutácie na bunkové delenie a gén 10-6, za xivot je to 1010 mutácií na gén
ľvDV mutácií:
Génové (bodové) mutácie Chromozómové (ptruktúrne aberácie) Genómové (numerické aberáce chromozómov)
	180	
		
	160	Výskyt
	140	rakoviny /
c CO		jako funkce /
O p	120	vaku /
p		/
03 C >■	100	/
i— > o CO	80	/
i_ ■4—' >"		/
T CO	60	1
t>		
	40	1
		/
	20	/
		
	0 10	20    30    40    50    60    70 80
		_Věk v rocích
© Espero Publishing, s.r.o.
DNA opravné dráhy
Direct reversals
Excision repair
- Base Excision Repair (BER)
- Nucleotide Excision Repair (NER)
Mismatch repair (MMR)
- replication errors
Recombinational repair (HR and NHEJ)
- multiple pathways
- double strand breaks and interstrand cross-links
Tolerance mechanisms
- lesion bypass (TLS)
- recombination
DNA-opravné proteínové komplexy
a opravu sú potrebné súTasne rôzne enzymatické aktivity
Vzájomnou väzbou enzymaticky aktívnych a adaptorových proteínov vznikajú DNA-opravné komplexy ppecifické k danému popkodeniu DNA
Katalytické domény obsiahnuté v opravných komplexoch vedú k zvráteniu DNA popkodení
Po oprave sa komplex opäijrozpadá na podjednotky
Pri regulácii reverzibilnej formácie komplexov sú dôlexité post-translaTné modifikácie proteínov (fosforylácia, sumoylácia, ubikvitinácia,...).
Enzýmy opravujúce DNA
Glykozylázy
ntiepia N-glykozidickú väzbu - odstraKujú popkodené bázy Nukleázy " exo / endo
ntiepia fosfodiesterové väzby medzi nukleotidmi DNA. Helikázy
Odbblujú dve komplementárne vlákna DNA. Polymerázy
DNA-dependentné nucleotidyltransferázy - Syntetizujú rei_pzec DNA z nukleotidov.
Ligázy
Katalyzujú tvorbu fosfodiesterových väzieb " spájajú dokopy dve vlákna DNA.
Pyrimídine dimer in UV-exposed DNA
Direct reversal priama oprava: fotoreaktivácia
Oprava pyrimidínových dimérov enzýmom fotolyázou s vyuíitím energie svetla
light-harvesting kofaktory: FADHB (Tltý) and 8-HDF (modrá)
Complex of DNA with photoreactivating enzyme
Release of enzyme to restore native DNA
Base Excision Repair (BER)
Opravuje menpie popkodenia jednej bázy (oxidácia, alkylácia, deaminácia).
1. Rozoznanie a odstránenie chybného
miesta
2. Vyplnenie medzery
3. Spojenie retazcov DNA
Kroky 2-3 sú takmer rovnaké u rôznych typov opráv, ale pri prvom kroku sa zúTastKujú ppecifické protínové komplexy pre danú opravnú dráhu
OXOX03
damage to top strand
n - n n n n "i
EXCISION OF ' DAMAGED REGION
* o * a t U [] u u
n n n n n n n n
step 2
DNA POLYMERASE MAKES NEW TOP STRAND USING BOTTOM STRAND AS I A TEMPLATE
n n u Lf n n □ n
step 3
dna ligase seals nick
<?  & Q  Q  ŕ 0 U MU UMU U I]
J1 " n ň H n n □
net result: repaired dna
Nucleotide Excision Repair
1. Rozpoznanie proteínovými faktormi
2. Vystrihnutie popkodeného miesta aj s okolím v oboch smeroch (nukleáza).
3. Rozmotanie DNA (DNA-helikáza)
4. Syntéza na základe komplementárneho vlákna
5. Spojenie DNA ligázou
Opravuje väTpie jednorei_pzcové popkodenia
(pyrimidínové diméry, 6,4 fotoprodukty, crosslinky v DNA helixe)
Transcription
RNA Pol II
Damage recognition
Damage recognition
Helix opening, lesion verification, 5'-3' dual incision
Gap-filling DNA synthesis
Oligonucleotide excision
Ligation
A, globálna genomická (GG-NER)
B, TranskripTne-spriahnutá (TC-NER).
1. Rozpoznanie popkodenia GG |d TC
2. TFIIH rozpletie DNA (helikáza)
3. Rad2 (XPG) ptiepi DNA na 3 ' konci popkodenia, 5 ' koniec rozptiepi Rad1-Rad10 (XPF-ERCC1) komplex (endonukleázy)." Dvojité ptiepenie uvoaní krátky jednovláknový úsek (25-30 nt) DNA na ktorom sa popkodenie nachádza
4. DNA polymeráza ( alebo ) dosyntetizuje chýbajúcu sekvenciu
5. DNA ligáza Cdc9 (Ligase-I) spojí DNA.
Upravené z Tatum & Li, 2011
Xeroderma Pigmentosum
6Výskyt: 1-4 na milión
öGenetika: autozomalne recesívne (XPA-G)
öNemoc: nemoci koie; malignancia koie; neurologické a
abnormality oTí
Cockayne s Syndrome
1 na milión
autozomalne recesívne, gény (XPA, B, D & G) Zastavený rast, mentálne retardácia, dwarfism, hluchota, atrofie oTí, intracranial calcifications; (bez zvýpenia vzniku rakovin)
Trichothiodystrophy
1-2 na milión
autozomalne recesívne, (TTDA, XPB a D)
sulfur deficient brittle hair, mental and spomalenie rastu,
peculiar face with receding chin, ichthyosis;
(bez zvýpenia vzniku rakovin)
Oprava chybného zaradenia báz
Mismatch repair (MMR)
Opravuje nesprávne zaradené bázy pri chybách DNA replikácie a rekombinácie
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^H a novo
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^H nasyntetyzované vlákno DNA a ppecificky ^^^^^^^^S^^^^S^^^^^^^^I    opravuje chyby v dcérskom vlákne.
1. MutS homology (Msh2/Msh3, Msh2/Msh6) rozoznávajú nesprávne zaradené bázy a ohýbajú DNA v mieste popkodenia
2. MutL homology (Mlh1/Pms2) sa viaiu na MutS homology a ptiepia dcérske vlákno (endonukleáza)
3. DNA helikáza rozpletie vlákna
4. Exonukleáza (Exo1, ... ?) rozptiepi dcérske vlákno
5. Vyptiepená DNA je znovu nasyntetizovaná DNA polymerázou a pripojená DNA ligázou.
Upravené z Martin & Scharff, Nat. Rev. Imm., 2002
Oprava dvojreupzcových zlomov
Vznik: Indukované radiáciou a chemikáliami PoTas replikácie popkodenej DNA Slúii k iniciácii meiotickejrekombinácie SúTasi^imunitnej odpovedi
Dvojrei_pzcové zlomy DNA sú ve/jni závainým druhom popkodenia - jediný DSB môie viesi^k smrti bunky alebo preusporiadaniu genómu.
Základné DSB-opravné dráhy:
Homologická rekombinácia (HR)
VäTpinou nevedie k chybám a na opravu pouiíva homologickú sekvenciu ako templát.
Je dominantná v S a G2 fáze (sesterská chromatída), u diploidov (homologický chromozóm).
Nehomologické spájanie koncov (NHEJ)
Priamo spája zlomené konce dokopy, Tasto vedie k strate genetickej informácie. Dôlexitá hlavne v G1 fáze u haploidov.
Nehomologické spájanie koncov
Non-homologous end joining (NHEJ)
1. Väzba MRX (Mre11-Rad50-Xrs2) komplexu, Ku heterodiméru (Yku70-Yku80) na zlomené konce DNA
2. Privolanie DNA ligázy IV (Dnl4) a jej pomocných proteínov Lif1 a Nej1.
3. H/pdanie komplementarity medzi prevismi dvoch koncov DNA.
4. Úprava koncov - syntéza DNA (Pol4 DNA polymeráza) Religácia koncov
oprave nekompatibilných koncov väTpinou dochádza k deléciám alebo inzerciám, vznikajú chyby " error prone
Mrel 1 -Rad50-Xrs2(Nbs1) komplex
rozdielna väzba na DNA v závislosti od väzby ATP
Homologická rekombinácia
1. MRX sa viaie na zlomené konce DNA.
2. Nukleolytická degradácii 5wrei_pzcov.
3. Väzba RPA na 3~jednovláknové konce
4. Rad52 nakladá Rad51 rekombinázu na ssDNA (Srs2 helikáza odstraKuje Rad51).
5. Rad51 -filament h/pdá homologickú DNA (Rad54).
6. Tvorba D-loopu
7. PredEenie 3 ' konca filamentu (DNA polymeráza
ô SDSA (synthesis dependent strand annealing)- novo nasyntetizované 3 ' vlákno je vytlaTené z D-loopu (Srs2 a Mph1 helikázy) a nasadne naspäi_ma druhý koniec dvojvláknového zlomu (Rad52). Nasleduje syntéza DNA (Pol ) a ligácia.
ô DSBR (double strand break repair) " tvorba double Holliday Junction - rozrupený Sgs1-Top3-Rmi alebo rozptiepený endonukleázami (Mus81-Mms4, Slx1-Slx4, Radi-Radio, Yen1).
DSB
£Rad52) (RadKi)
ecBCD komolex - baktérie
5" channel RccD
RacEi-! r::i v.\ cavity
3" chsnnsl to nuclease
Singleton etal., Nature, 2004
ô Ô Ô
■
ý u baktérií spracováva konce
dvojvláknového zlomu v DNA Helikázovou aktivitou rozplieta dvojvláknovú DNA Nukleázovou aktivitou vlákna ptiepi
Stimuluje väzbu RecA rekombinázy na 3 ' jednovláknovú DNA
Popkodenie DNA indukuje sumoyláciu DNA-opravných proteínov
Sumoylation Targets among Proteins Involved in DNA Replication. Repair, and the DNA Damage Response That Were Identified in This Study	
Process	Sumoylated Proteins
Replication	Dpbll, Mcm2, Mcm4, Mcm5, Mcm6. Mpsl, Orel, Orc4, Orc6, Pifl. Poll, Pol2, Poll2, Polil. Pril, Pri2, Rad27. Rfc2. Rfc3. RttlOZ Slx4 fAbfl, Orc3, PobJ. Rfcl, Tof2, Topi, Topi)
Re combinational repair	.Well. Pso2. Rad50, Sae2, SawL Sine6, Xrs2. Yeul (Rad52, Rsd59, Rfal, R&Z Sqsl, Smc5. Srs2]
NHEJ	Li/1 (Yku70, YkuSU)
Postreplicative repair	Rad5 (Pol30)
Base excision repair	Apttl, Magi, Oggl (Ntgl)
Nucleotide excision repair	Radl} Rnd2, Rad3, Rad4, RadZ Rad25, SslL Tfb2(Radio)
Mismatch repair	MMiL MsliS, Msh6, Pmsl
Checkpoint signaling	Ddcl, Bmil
Proteins that were previously found to be sumoylated are in parentheses. Italic: sumoylation is induced by MMS. Bold: human komologs are sumoylated (Golebiowski et aL 2009). Underlme: phosphorylated by checkpornt kinases (See Table SI). Note that several proteins function in multiple processes but are assigned to one category for sunplicity.	
Cremona etal., Mol. Cell., 2012
SUMO stabilizuje DNA-opravné komplexy (HR)
Chromatin-a&soc iated SUMOylation m ach i nery
Prote i n-g nou p S UMQy latio n fbstere compJexfomnstionand DNA repair
Jentsch & Psakhye, Annu. Rev. Genet, 2013
Následný rozpad komplexov stabilizovaných pomocou SUMO-SIM interakcií
Single strand annealing
ô Single-strand annealing (SSA) prebieha ak dôjde k zlomu v mieste dlhpích repetícií DNA(rDNA)
1. Resekcia 5wvlákna na koncoch zlomenej DNA ako u HR.
2. Priame nasadnutie jednovláknových 3W reLpzcov, (Rad52 a Rad59)
3. Nehomologické sekvencie na koncoch sú odstránené Rad1-Rad10 endonukleázou -NER. ntiepenie je stimulované MMR proteínmi Msh2-Msh3.
4. Syntéza DNA a ligácia.
ö SSA vidy vedie k delécii DNA sekvencie ohraniTenej repetíciou - je mutagénna.
Upravené z Altmannová et ai, Biomolecules, 2012
Translézna DNA syntéza
Translesion synthesis (TLS)
ô Proces umoTKujúci toleranciu popkodenej DNA.
ô Postupujúca replikaTná vydlica narazí na neopravite/pé popkodenie DNA
No^áT Replication Proteins
I *< )
allacl at position of damaaetí L
Alternative options í or translesion synthesis:
Rev3/hRť*3 y
Poli]
(^J^icBO (POLH; XPV)
Restored replication fork movement
David Kowalski
1. Dlhodobé zablokovanie replikaTnej vidlice vedie k smrti bunky.
2. Replikácia popkodenej DNA vytvorí sesterskú chromatídu ktorá môie byi4 vyuiitá ako templát pre opravu HR.
ô ntandardné DNA polymerázy ( , ) sú nahradené transléznymi polymerázami, ktoré vedia vloi"ii4bázy aj oproti popkodeným nukleotidom (pyrimidínové diméry, abázické miesto, oxidovaná, deaminovaná báza).
ô Niektoré TLS polymerázy zarabUjú správne bázy oproti ppecifickým popkodeniam (Pol :), inéTasto zarabUjú nesprávne bázy (= Rev ^
ou PTMs
cell
la DNA a proteiny
ve,
o
JJ
Q
4J
t
Lya 1&4
Recruhrnent
Unknown rncchsnisrri ->
LyslC4
RscruHment
TranskaJcri synthesis.
Unkncv-n f setoff)
Emor-frec
Inhibnticn d rtccrnbiníítiori
;rgink & Jentsch, Nat
Metódy ptúdia DNA opravných mechanizmov
Genetická analýza mutantov a ich vzi_phov
Analýza citlivosti mutantov na látky spôsobujúce ppecifické popkodenie DNA
Eseje vyuiívajúce úpravu DNA
FluorescenTná mikroskooia
Mret1-VFP Rrai-CFF
" analýza (ko)lokalizácie DNA opravných proteínov v bunke, ich Tasovej následnosti
Metódy ptúdia DNA opravných mechanizmov
in vitro metódy _
Analýza biochemickej aktivity
Väzba na DNA Nukleázová esej Helikázová esej Polymerázová esej
- 7.5 15  30  60   -   -   -   -   Srs2 (nM)
Rekonptrukcia opravných mechanizmov Elektrónová mikroskopia
_
7.5 15 30 60   SUMO-Srs2 (nM)
PreTo ptudujeme /judske rekombinäzy?
Tahk 2. List of diseases linked to or associated with either recombination mediators or their interacting partners, synthetic lethality interactions are also shown (216,291,292)
Genes
Syndromes/disorders
Cancers
Synthetic lethality
BRCAI
BRCA2
RAD54B
RAD5IB
RAD5JC
BLM
WRN
RECQL4
p53
FAN CM PALB2
Fanconi anaemia (FANCD I)
Fanconi anaemia (FANCO)
Bloom
Werner
R ot h ni und-Th om son Li-Fraumeni
Fanconi anaemia (FANCM) Fanconi anaemia (FANCN)
Potential associations with diseases RAD51
DMCJ Infertility XRCC2 XRCC3 RAD5ID -DSSI
Split hand .'split toot malt'oi-mation
Breast, prostate, ovarian cancer Breast, prostate, ovarian cancer Colon cancer, iioii-llodgkin lymphoma Lipoma, uterine leiomyoma Breast, ovarian cancer
Breast, pancreatic, lung cancer, etc. Breast, pancreatic cancer
Breast cancer in BRCA I and BRCA2 carriers Breast cancer
Basal cell carcinoma, malignant melanoma, bladder cancer, breast cancer Breast cancer
Skin squamous cell carcinoma
PAR PI
PAR PI. RAD52 PARP1, FEN1 PARPI
RAD52
EMSAof RAD-51-ssDNA complexes ± RFS-1-RIP-1
Mg-ATP
Mg-AMPPNP
05	05	<P  <£> <£>	0?	0?	05	(.05    (.05    (.05 (.05 05               t£>     t£> t£>		[RAD-51] (nM)
05	O?			05	05	05      »P <fi	05	[RFS-1 -RIP-1] (nM)
		•	•					
								
								
0	0.4	5   11 13	21	4	0	0.5  34  46  57 85	27	% bound
		Mg-ADP				No nucleotide + EDTA		
05	05	# # #			05	* ####	o?	[RAD-51] (nM)
05				05	05		05	[RFS-1 "RIP-1] (nM)
• ••••
0   0.3   7    9   18   31 11
0   0.3 41   15   11   11   36   % bound
For a fixed concentration of RAD-51 in the presence of nucleotide and magnesium, more molecules of radiolabeled DNA display retarded migration due to the formation of DNA-protein complexes in the presence of RFS-1-RIP-1.
© M. Taylor
RFS-1-RIP-1 stimulates RAD-51 recombinase activity
Preliminary EM data suggest that RFS-1 -RIP-1 complex remodels the Rad51 filaments to shorter ones