Marek Adamus Ubikvitony 24.3.2016 Opakování § dědičnost: § autosomální vs. gonosolmání, dominantní vs. recesivní § struktury proteinů § α-šroubovice / α-helix § β-skládaný list / β-sheet § fold – prostorové uspořádání, motiv Post-translační Modifikace Proteinů § (jen) eukaryotické buňky § mnohonásobné zvýšení variability proteinů a jejich komplexů § stabilizace, transport, lokalizace, aktivace... § fosforylace, glykosylace, acetylace, ubikvitinace... § ubique = všudypřítomný § A. Ciechanover, A. Hershko, a I. Rose – Nobelova cena 2004 § malý protein (8,5 kDa, 76 aminokyselin) § nachází se ve všech eukaryotických buňkách § vysoce konzervovaná primární struktura § vlastnosti: § flexibilní C-konec – připojení na ε-aminoskupinu lysinu § lysiny v sekvenci ubikvitinu – isopeptidová vazba Ubikvitin ε § nevzniká samostatně, ale vždy jako fúzní / polyprotein § jsou známy 4 geny pro ubikvitin u lidí § ubikvitin-ribozomální protein (UbL40 a UbS27) § regulace množství ubikvitinu dle translační aktivity § polyubikvitin § odpověď na stresové podmínky Exprese Ubikvitinu Herrmann et al., Circulation Research, 2007 Ubikvitin SUMO-1 NEDD8 Ubikviton § a covalently attachable or genetically built-in ubiquitin superfold Welchman et al., Nature Reviews, 2005 § ubikvitony – proteiny obsahující „β-grasp fold“ Hochstrasser, 2009 Ponder et al., 2007 Ubikvitony Modifier Identity (%) E1a E2a Comments Ubiquitin 100 Uba1& Uba6 many Protein degradation, histone regulation NEDD8 55 Uba3-Ula1 Ubc12 Substrates: cullins, p53 SUMO1–4 18 Uba2-Aos1 Ubc9 Transcriptional regulation, protein localization Urm1 ND Uba4 – Related to MoaD, ThiS; β-grasp fold ISG15 32/37 Ube1L UbcH8 Interferon response UFM1 ND Uba5 Ufc1 β-grasp fold FUBI/MNSFβ 38 – – Derived from ribosomal protein precursor FAT10 32/40 Uba6 – Ubiquitin-independent degradation Ubl-1 40 – – Nematode ribosomal protein precursor BUBL1, 2 variable (up to 80%) – – Putative autoprocessed proteins (ciliates) Woelk et al., 2007 Lidé: § E1 – 2 enzymy (UBA1, UBA6) § E2 – 35 § E3 – 600 - 1000 Konjugace Ubikvitinu § regulace na několika úrovních Konjugace Ubikvitinu – E1 a E2 A: aktivace ubikvitonu B: přesun ubikvitonu na Cys v aktivním místě E1 C: vazba dalšího aktivovaného ubikvitonu D: přesun z Cys E1 na Cys E2 Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 § E3 ubikvitin ligasy specificky rozeznávájí koncové proteiny § vazebná místa pro E2 a protein 2 hlavní třídy: § RING (Really Interesting New Gene) E3 ligasy (až 95%) § HECT (Homologous to E6-AP Carboxy Terminus) E3 ligasy Konjugace Ubikvitinu – E3 E2-Ub → E3-Ub → Protein-Ub E2-Ub → Protein-Ub Rotin & Kumar, 2009 RING E3 Ligasy Deshaies et al., An. Rev. of Biochemistry, 2009 § složené RING E3 ligasy § tvořené několika modulárními podjednotkami § tzv. cullin-RING E3 – RING box protein (RBX1 a 2) + Cullin + substrát rozeznávající proteiny RING E3 Ligasy Deshaies et al., An. Rev. of Biochemistry, 2009 § obsahují RING ( RING finger) doménu § 6 – 7 Cys a 1 – 2 His koordinuje 2 Zn2+ § RING doména se váže s E2 2 velké podskupiny: § jednoduché RING E3 ligasy § RING doména a substrát vazebná doména se nachází na stejném polypetidu Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 Jednoduché RING E3 Ligasy § p53 (TP53) – „strážce genomu“ § odpověď buňky na stres – zastavení buněčného cyklu, indukce apoptosy § přes 50 % známých typů rakovin má defekt ve funkci p53 § MDM2 (Mouse Double Minute 2 homolog) – E3 ligasa § hlavní regulační prvek stresové odpovědi mediované p53 § p53 indukuje expresi MDM2 → MDM2 inhibuje expresi p53 § fyzické nasednutí na DNA a inhibice transkripce § podpora transportu p53 z jádra § ubikvitinace p53 – indukce degradace § Deaktivace MDM2 – cílená léčba aktivací p53 a následně apoptosy § Nutlin, RITA, PRIMA-1 (II. fáze klinických testů – 2012) Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 Cullin-RING E3 Ligasy § E3 ubikvitin ligasovy komplex § Culliny § hydrofóbní proteiny § tvoří lešení pro další podjednotky § je známo 7 cullin proteinů u člověka § RING box protein § RBX1 a RBX2 § substrát specifické proteiny Deshaies et al., An. Rev. of Biochemistry, 2009Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 Cullin-RING E3 Ligasy § APC/C (Anaphase Promoting Complex/Cyclosome) – E3 ligasa § komplex složený z (asi) 12 podjednotek a několika koaktivátorů – 1,5 MDa § obsahuje cullin podjednotku (Apc2) a RING podjednotku (Apc11) § pro vazbu substrátu nezbytné koaktivátory Cdc20 a Cdh1 § nezbytný pro správný průběh buněčného cyklu, rozdělení sesterských chromatid v anafázi… § ubikvitinace securinu → ak vace separasy → štěpení kohezinu → rozdělení sesterských chromatid k opačným pólům buňky Peters, Nature Reviews, 2006 U-Box E3 Ligasy § strukturní motiv podobný RING schopný vázat E2 ligasy § konformace založena na vodíkových můstcích, neváže Zn2+ § CHIP (C terminus of HSC70-Interacting Protein) / STUB1 (STIP1 homology and U-Box containing protein 1) § rozeznává HSP70 a HSC70 § ubikvitinuje nesprávně složené proteiny → degradace § asociace s parkinem – podporuje jeho ubikvitinační aktivitu § disfunkce CHIP spojená s ataxií – porucha koordinace pohybů § Cystická Fibróza – degradace nesprávně složeného CFTR § CFTR – chloridový ABC transportér (česky: transmembránový regulátor vodivosti J ) § U-box (zelená) § RING (fialová) Ohi et al., Nature Structure Biology, 2003 HECT E3 Ligasy § HECT (Homologous to E6-AP Carboxy Terminus) § zhruba 28 HECT E3 u člověka § HECT doména se skládá ze 350 aminokyselin u C-konce prot. § obsahuje katalytický Cys → vazba ubikvitinu E2 ligasa HECT s kat. Cys ohybová doména Rotin & Kumar, 2009 HECT E3 Ligasy § E6-AP ubikvitin ligasa § rakovina děložního čípku § HPV (Human PapillomaVirus) nese gen pro protein E6 § E6 je exprimován v hostitelské buňce a váže se na E6-AP § E6-AP ubikvitinuje p53 a napomáhá vzniku rakoviny § Angelmanův syndrom § exprese E6-AP není rovnocenná – varianta genu zděděná po linii otce je umlčována § v mozku je exprimována převážně matčina alela § mutace genu vedoucí k nefunkčnímu proteinu → syndrom § poruchy vývoje intelektu, epileptické záchvaty, záchvaty smíchu Giovanni Francesco Caroto (1480 – 1555 /1558) Varianty Ubikvitinací § polyubikvitinové řetězce – běžnější oproti monoubikvitinacím § ubikvitin – 7 lysinů a C-konec pro připojení dalšího ubikvitinu Komander, Biochemical Society Transactions, 2009 Varianty Ubikvitinací Komander, 2009 Husnjak & Dikic, Annual Review of Biochemistry, 2012 Varianty Ubikvitinací § Uzavřená konformace § Otevřená konformace Důsledek Připojení Ubikvitinu § připojení ubikvitinu přes flexibilní C-konec § neovlivňuje (většinou) konjugovaný protein přímo → slouží jako povrch pro protein-proteinové interakce § interakční partner obsahuje UBD (Ubiquitin Binding Domain) § je známo 20 rodin s rozdílnou topologií UBD místa § ubikvitin obsahuje hydrofobní místo kolem Ile46 → vazebné místo pro UBD (zvažováno i Ile36, Leu8, Val70) Bishop et al., EMBO J, 2010 Degradace Proteinů v 26S Proteasomu § velký (2 MDa) multiproteinový komplex – až 60 podjednotek) § hlavní dráha pro specifickou degradaci proteinů § odstranění proteinů konjugovaných s Lys48 ubikvitinovým řetězcem § rozeznáván je řetězec 4 a více ubikvitinů § skládá ze 2 subkomplexů: 20S 19S 19S 20S centrální subkomplex § tvar soudku s katalytickým místem uvnitř § Tvořen 4 kroužky ze 7 podjednotek v uspořádání α7β7β7α7 § proteolytické pouze β1,2 a 5 19S regulační subkomplex § skládá se z nejméně 18 podjednotek, které tvoří víko a základnu (bázi) § báze – hexamer ATPáz → rozmotávání 3D struktury peptidu za spotřeby ATP § víko – váže a odštěpuje ubikvitin z proteinu Lasker et al., PNAS, 2012 http://pdb101.rcsb.org/motm/166 víko báze α kroužek β kroužky http://www.bostonbiochem.com/products/proteasome Architektura 26S Proteasomu 20S 19S 19S α kroužek báze víko Průběh Degradace 1. protein určený k degradaci je označen K48 typem ubikvitinace 2. ubikvitinový K48 řetězec je rozeznán proteasomem 26S § jsou rozeznávány řetězce o délce 4 a více ubikvitinů 3. ATPasy v 19S podjednotce postupně rozruší prostorové uspořádání proteinu 4. (částečně) linearizovaný protein vstupuje do 20S podjednotky 5. celkem 6 míst s proteolytickou aktivitou štěpí protein § specifické štěpení za hydrofobní, kyselou a bazickou aminokyselinou § v aktivním místě obsahují Thr (nukleofilní atak) 6. vznikají nejčastěji 7-9 aminokyselin dlouhé peptidy, které jsou po uvolnění dále štěpeny v cytosolu na jednotlivé aminokyseliny 7. ubikvitin je před vstupem do 20S odštěpován a recyklován Bhattacharyya et al., Nature Reviews, 2014 Imunoproteasom § speciální typ proteasomu – odlišný typ proteolytických 20S β podjednotek § výsledkem štěpení jsou delší peptidy vhodné pro imunitní odpověď § peptidy jsou prezentovány na povrchu buňky vázané v rámci MHC třídy I (major histocompatibility complex) § MHC I jsou rozeznávány cytotoxickými T-lymfocyty Miller et al., Current Cancer Drug Targets, 2016 § 11S podjednotka – vazba místo 19S podjednotky (víko) § navození konformační změny, podobná funkce jako imunoproteasom Nemoci Spojené s Proteasomem § Parkinsonova choroba 1. juvenilní typ § autosomálně recesivní forma Parkinsonovy choroby § mutace v genu PARK2 vede k neaktivní formě parkinu (součást E3) → nedochází k degradaci cílových substrátů proteasomem § kumulace těchto proteinů vede k apoptóze neuronů syntetizujících dopamin 2. spojená s Lewyho tělísky § autosomálně dominantní forma PC § mutace / multiplikace genu SNCA pro α-synuclein → nesprávná degradace / zvýšená koncentrace vede k inhibici 26S proteasomu § Lewyho tělíska – shluky konjugovaného α-synucleinu uvnitř neuronů § Lewy Body Dementia § podobné PC, postiženy jsou neurony produkující acetylcholin Přehled K48 Ubikvitinace § degradace proteinů pomocí konjugace s ubikvitinem u člověka KEGG pathways, 2016 Ubikvitinace K63 § nevedou nutně k degradaci proteinu § NF-κB (nuclear factor kappa-B) § regulace odpovědi na buněčný stres, podíl na produkci imunoglobulinů § velmi konzervovaná signalizační dráha § NF-κB se zkládá z podjednotek p50, p65 a inhibiční IκB 1. IκB kinasa (IKK) je ubikvitinována K63 řetězcem 2. na ubikvitin nasedá kinasa a fosforyluje β podjednotku IKK 3. fosforylovaná β IKK je monoubikvitována 4. tím dochází k aktivaci IKK a fosforylaci IκB 5. fosforylovaná IκB je ubikvitinována K48 řetězcem a degradována v proteasomu 6. NF-κB se váže na promotory pro RNA polymerasu a pomáhá indukovat transkripci 7. IκB je rovněž indukována, což vede k následné inhibici NF-κB § zajímavost: HIV nese ve své sekvenci místa pro nasedání NF-κB SUMO § small ubiquitin-like modifier § malý protein (12 kDa, 100 aminokyselin), u člověka 4 varianty – SUMO-1,2,3,4 § SUMO-1 netvoří řetězce a konjuguje s proteiny za fyziologických podmínek § SUMO-2,3 konjuguje za stresových podmínek § SUMO-2,3 sekvenčně podobné, SUMO-4 téměř výhradně v ledvinách § průběh sumoylace je podobný ubikvitinaci (E1 → E2 → E3 → protein) Wilkinson & Henley, Biochemical J., 2010 … SUMO § konsenzuální sekvence pro SUMO-2,3 ψKxD/E hydrofóbní aminokyselina (Val, Leu, Ile ,Phe, Tyr, Trp) SUMO lysin jakákoli aminokyselina asparagová / glutamová kyselina § SUMO interaguje se SIM (SUMO-interacting motif) § SIM je méně konzervovaný – 3-4 hydrofobní aminokyseliny následuje blízká, záporně nabitá oblast (Asp, Glu; fosforylovaný Ser, Thr) § SUMO může stericky bránit interakci, působit jako interakční povrch, působit jako induktor interakce Sumoylace Komplexu MCM § MCM (minichromosome maintenance complex) - podjednotky Mcm2-7 § součástí helikasového podkomplexu, který je součástí replisomu § MCM nasedá na DNA (na „počátek replikace“) → dochází k fosforylaci Mcm4 → vazba dalších 2 kofaktorů Cdc45 a GINS a vznik CMG replisomové helikasy § po nasednutí DNA může být MCM sumoylován → nedochází k fosforylaci → ochrana před předčasným rozplétáním DNA § desumoylací MCM může dojít k fosforylaci a sestavení CMG MCM GINS Cdc45 SUMO fosfát 1. 2. 2. CMG Sumoylace PML jaderných tělísek § jaderná tělíska – malé kruhovité útvary v jádře buněk § důležité pro regulaci transkripce, senescence, virové odpovědi, reakce na stres § PML (promyelocytic leukemia) protein – obsahuje SIM motiv a SUMO lysiny § PML protein tvoří homodimer, který agreguje sumoylací a interakcí se SIM § tato síť následně skrze SIM interaguje s další řadou proteinů § akutní promyeloidní leukémie § zapříčiněna z 98 % fúzí PML-RARA (retinoic acid receptor alpha) § léčba As2O3 – arsen indukuje tvorbu disulfidických můstků a zesíťování PML-RARA § SUMO dependentní ubikvitin ligasa rozezná sumoylace jako signál k degradaci § dochází k ubikvitinaci a degradaci proteasomem Matunis et al., Developmental Cell, 2006 § proteiny mohou být modifikovány SUMO nebo ubikvitinem, případně obojím § připojení SUMO a ubikvitinu mívá odlišný efekt § SUMO může s ubikvitinem soutěžit o Lys Srovnání SUMO a Ubikvitinu NEDD8 § NEDD8 (Neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 8) § 81 aminokyselin, 9 kDa, 60 % sekvenční podobnost s ubikvitinem § nezbytný pro většinu cullin RING E3 ligas § váže se na cullinové jádro, čímž umožní interakci s E2 § neddylace probíhá téměř analogicky k ubikvitinaci – před konjugací dochází k maturaci NEDD8 odštěpením 5 aminokyselin od C-konce proteinu http://www.bioon.com/3g/id/577000/ ISG15 § ISG15 (Interferon stimulated gene 15) § 165 aminokyselin, 17 kDa, 2 domény, 29 a 31 % sekvenční podobnost s ubikvitinem § přítomný pouze u vyšších eukaryot § u člověka podobně jako NEDD8 přítomen v cytoplasmě v neaktivní formě, maturace odstraněním krátkého úseku na C-konci proteinu § například ryby mají pouze aktivní formu § exprese indukována interferony, součástí dráhy odpovědi na virové infekce PDB: 1Z2M Ubikvitin D § Ubikvitin D (FAT10) § podobný ISG15 – obsahuje 2 domény spojené linkerem § není podrobně prozkoumaný § společně s NUB1L (NEDD8 ultimate buster 1-long) je schopen vyvolat degradaci proteinu v 26S proteasomu § pravděpodobně funguje v opozici k neddylaci § HIVAN (HIV-associated nephropathy) § jedna z nejčastějších příčin úmrtí HIV pozitivních pacientů § HIV Vpr protein indukuje expresi FAT10 v renálních buňkách a způsobuje deregulaci buněčného cyklu a apoptosu § navíc Vpr interaguje s FAT10 a je kolokalizován v mitochondriích § inhibice FAT10 brání Vpr indukované apoptose Pup § Pup – „prokaryotický ubikvitin“ § produkt PUP genu u bakterií kmene aktinomyceta (aktinobakterie) § nejběžnější zástupce v půdě, zahrnuje mnoho patogenů (Mycobacterium leprae, tuberculosis) § 60 - 70 aminokyselin, 7 kDa, nesdílí sekvenční ani strukturní motiv s ubikvitinem § nemá konzervovaný motiv, C-konec vykazuje sekvenční homologii § spíše rozvolněný, hydrofobní interakce u C-konce mohou vytvářet šroubovice PDB: 3M9D Pup § pupylace – připojení Pup proteinu na lysin cílového proteinu § pupylovaný protein je následně degradován prokaryotickým proteasomem § pouze 1 pupylační enzym PufA a 1 depupylační Dop § tato dráha není esenciální – úloha a vznik proteasomu v bakteriích? Striebel et al., BBA, 2014 Co si pamatuji z přednášky? § Co je to ubikvitin? § Jaký je rozdíl mezi pojmy ubikvitin a ubikviton? § Jak probíhá ubikvitinace? § Co se může dít s proteinem po ubikvitinaci? § Jsou nějaké proteiny podobné ubikvitinu? § Existuje ubikvitin nebo ubikvitinu podobny protein u prokaryot?