Vzorkování a základní chemické a biologické analýzy v hodnocení životního prostředí (ENV007) Manuál k laboratorním úlohám a terénnímu cvičení Jan Kuta, Roman Prokeš a Marie Smutná Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta Brno 2016 Slf-Qa . Q (f] ■ f'Á,-, 1-:-1 MINISTERSTVO SKOl S I VI OP Vzděláváni A^^a? ■ fond V CR EVROPSKAUNIE MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost 1 \A ^ INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky OCentrum pro výzkum if«R«^ /*ŕ*í* toxických látek U «¥1 VV// | v prostředí ^ ^ Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno Měření základních parametrů vody: Pro měření základních parametrů vody jako je teplota, vodivost, pH, obsah kyslíku či nasycení kyslíkem bude použita sada iontově selektivních elektrod a senzorů. Pro práci v terénu se používají speciální sady s úchyty pro jednotlivé senzory, elektrody a kalibrační roztoky, aby transport techniky byl co nejjednodušší s minimálním rizikem poškození přístrojů (obrázek 7). Při měření základních parametrů se začne stanovením obsahu kyslíku, neboť koncentrace kyslíku se v čase výrazně mění. Následuje měření pH, teploty a konduktivity. Stanovení průhlednosti se provede pomocí Secchiho disku dle obrázku 8. Obrázek 7: Souprava pro měření základních parametrů vzorků vod Copyri ght©V*Hor«n Hoop Productions 2003 ■ M Lower disk Continue ...and ...until it Raise and into lowering lower... can no record level water. disk... longer be seen. you see disk again. Record this lerel. Obrázek 8: Stanovení průhlednosti pomocí Secchiho disku. (©) Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí NA** Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno Laboratorní cvičení Determinace a kvantifikace fytoplanktonu v přírodním vzorku Taxonomická determinace fytoplanktonu (dominantních druhů) pomocí určovacího klíče, mikroskopického pozorování a přístroje Flow cam. Literatura: Hindák F. et al. (1975): Klúč na určovanie výtrusných rastlín - SPN Bratislava Kvantifikace biomasy pomocí mikroskopického počítání na Burkrově komůrce: Obrázek 9: Burkrova komůrka Na Búrkrovu komůrku opatrně svorkami umístíme krycí sklíčko. Krycí sklíčko by mělo být svorkami uchyceno dostatečně pevně (duhové okraje skla kolem svorek). Na hranu uchyceného skla přiložíme pipetu obsahující 10 u.1 vzorku a lehce pouštíme, aby celá počítací plocha byla pokryta vzorkem. Burkrova komůrka (Obr. 10) se skládá z 9 velkých čtverců (trojité ohraničení). Každý z velkých čtverců obsahuje 16 malých čtverců (dvojitá čára). V našem případě budeme počítat 10 malých čtverců a vypočítáme průměrný počet buněk na jeden čtverec. Pro výpočet počtu buněk v jednom mililitru použijeme výpočet (Průměrný počet buněk na jeden čtverec/ objem čtverce) * 1000 1 i -■ - - E Ú C S = — 1 Plocha malého čtverce = 0.04 mm Hloubka čtverce = 0.1 mm Objem čtverce = 0.004 mm3 Počítají se černě vyznačené buňky v malém čtverci. Pokud se buňka dotýká strany čtverce, počítají se jen dvě strany (horní a levá nebo dolní a pravá - vždy stejné u všech čtverců) Obrázek 10: Počítání buněk 10 Centrum pro výzkum <>if«R«^ /*ŕ*í* toxických látek U «¥1 VV// | v prostředí ^ ^ Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno Úprava vzorků půd (homogenizace, sítování, mletí) pro stanovení celkového obsahu Hg, TC (uhlík), TOC (organických uhlík) a pH půdy Aplikace na matrice Úprava se aplikuje na vzorky silikátové matrice (horniny, minerály, půdy, sedimenty, písky apod.). Jsou-li vzorky mokré, vlhké či pastovité konzistence, aplikuje se sušení. Vzorky se zrnem větším než 2 mm se drtí, homogenizují a sítují. Pro analýzy, které vyžadují práci s mletým vzorkem, se vzorek mele. Rušivé vlivy a omezení Je třeba dbát na zabránění křížové kontaminace vzorků přes znečištěné nástroje (především mlýn a mlecí koule). Použité pomůcky: Homogenizace: Třecí miska s tloučkem, případně jiný nástroj na homogenizaci a zmenšení velikosti zrna Sítování: Síto s velikostí oka 2 mm. Mletí: Kulový mlýn planetový Pulverisette, mlecí nádoby a mlecí koule z karbidu wolframu nebo oxidu zirkoničitého. Pracovní postup: Homogenizace Vzorky se zrnem větším než 2 mm (sedimenty, půdy) homogenizujeme rozetřením v třecí misce. Vzorek sedimentu či půdy zároveň zbavíme větších kusů organických materiálů (dřevo, zbytky rostlin a živočichů) a velkých kamenů. Sítování Vzorek půdy či sedimentu upravíme přesítováním přes síto s velikostí oka 2 mm. Větší hrudky rozmělníme tak, aby prošly sítem. Vzorek po sítování důkladně promícháme. Takto upravený vzorek použijeme pro přípravu výluhů (KCI, voda) a dále pro mletí na stanovení Hg, TC (celkový uhlík) a TOC (celkový organický uhlík). Mletí Potřebné množství vzorku (cca polovinu mlecí nádoby) umístíme do čisté mlecí nádoby a spolu s mlecími koulemi upevníme do držáku. Další postup dle návodu k mlýnu. Po mletí musí být vzorek bez hrubých částic znatelných při tření mezi prsty. V opačném případě prodloužíme dobu mletí či upravíme otáčky / frekvenci mletí. Přesítování mletého vzorku není přípustné vzhledem k možnosti ovlivnění složení vzorku separací tvrdších / větších součástí. Vzorky pro stanovení rtuti a TOC umístíme do PE sáčku a uchováváme při laboratorní teplotě (min 2g). V případě hygroskopických preparátů uchováváme v exsikátoru nad silikagelem. 11 Centrum pro výzkum <>if«R«^ /*ŕ*í* toxických látek U «¥1 VV// | v prostředí ^ ^ Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno Stanovení celkového obsahu rtuti ve vzorcích půd metodou atomové absorpční spektrometrie Princip stanovení Rtuť ve vzorku je stanovena metodou atomové absorpční spektrometrie (AAS) s dávkováním pevných vzorků pomocí přístroje AMA254 (Altec s.r.o, česká republika). Metoda nevyžaduje extrakci Hg ze vzorku půd, pouze je potřeba zabezpečit homogenitu vzorku na úrovni navážek kolem 100 mg. Vzorek půdy je navážen na Ni lodičku a vložen do spalovací pece přístroje. Nejprve dochází k sušení vzorku a poté k postupnému spálení při 900 °C v proudu kyslíku a uvolnění par Hg. Uvolněná atomární Hg je dále zachycována na pozlaceném písku (amalgamátoru). Po dokončení rozkladu vzorku je krátkým ohřevem amalgamátoru vypuzena veškeré rtuť do absorpční kyvety, kde je zaznamenána absorbance par rtuti při vlnové délce 254 nm. Přístroj dosahuje meze detekce 0,003 ng s horní hranicí pracovního rozsahu 200 ng Hg. Při navážce 100 mg vzorku tyto hodnoty činní 0,00003 a 2 mg/kg. U nekontaminovaných vzorků půd se pohybuje celkový obsah rtuti obvykle v setinách a desetinách mg Hg na kg půdy. Postup stanovení • Otevřeme přívod kyslíku, zapneme přístroj AMA254 (červené tlačítko) a zapneme ovládací PC. Po naběhnutí sytému spustíme program AMA254 a vyčkáme přibližně 20 min pro dosažení požadované teploty ve spalovací peci. • Vyčištění systému - ikona „L" - otevření panelu Clean - spuštění analýzy s parametry 60/150/45 (doba sušení/termického rozkladu/čekání). Pro analýzu dávkujeme 100 u.1 deionizovane vody. Analýzu je třeba opakovat do dosažení konstantní hodnoty absorbance. • Nastavení slepého pokusu - ikona „B" - otevření panelu Blank - (20/180/45), spustit tlačítkem „start", po vysunutí lodičky vyčkat asi 20 s, než lodičku stiskem „Continue (Insert)" zasuneme zpět. • Ověření správnosti měření - ikona „A" - panel Analysis - parametry analýzy: 20/180/45. Dávkujeme 100 mg dvou vzorků půd (č. 1125 a 1129), pro správnosti měření v 1. i 2. kalibračním rozsahu. Tyto vzorky jsou naše interní QC standardy a výsledek analýzy by se neměl lišit o více jak 10% od průměrné hodnoty předchozích měření. • Vyčistíme systém nadávkováním 100 u.1 neionizované vody s parametry analýzy jako v bodě č. 2 (stačí jednou). • Vlastní analýza vzorku půd - ikona „A" - panel Analysis - parametry analýzy: 20/180/45. Dávkujeme přibližně 100 mg. Analýzu opakujeme 3x, spočítáme průměr, směrodatnou odchylku a relativní směrodatnou odchylku. • Vyčistíme systém nadávkováním 100 u.1 neionizované vody. 12 Centrum pro výzkum <>if«R«^ /*ŕ*í* toxických látek U «¥1 VV// | v prostředí ^ ^ Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno Stanovení pH půdní reakce v suspenzi s deionizovanou vodou a IM KC1 Princip stanovení Půdní reakce je jedním z hlavních ukazatelů stavu chemických vlastností půdy. Pudní pH lze měřit přímo na místě v terénu pomocí kontaktních elektrod nebo případně v laboratoři pomocí skleněných pH elektrod v suspenzi půdy s příslušným činidlem. V případě suspenze půdy s deionzovanou vodou předpokládáme, že naměřené pH odpovídá aktuální hodnotě pH půdní vody. V případě 1M roztoku KCI mluvíme tzv. výměnném pH. Oxoniové (vodíkové) kationty mohou být sorbovány na povrchu některých minerálů a při extrakci pomocí KCI dochází k jejich výměně za ionty K+. Pomůcky • 15 ml polypropylenové centrifugační zkumavky s víčky • Třepačka, pH metr, roztoky pufrů pH 4, 7 • Deionizovaná voda • Roztok chloridu draselného 1 mol/l - 74,5 g KCI v 1 litru Postup stanovení • Do šesti zkumavek o objemu 15 ml přidáme půdu o objemu 2 ml • Přidáme 10 ml deionizované vody či roztoku KCI • Zkumavky necháme třepat na třepačce 5 minut při otáčkách 150 rpm. • Následně suspenze necháme stát nejméně 2 hodiny, nejdéle 24 hodin. • Provedeme kalibraci pH metru pomocí roztoků půfrů o hodnotě pH 4 a 7 • Změříme hodnotu pH pro vodný výluh a roztok KCI ve všech zkumavkách, spočítáme průměr, směrodatnou odchylku a relativní směrodatnou odchylku. 13 Centrum pro výzkum /S*5?\ (fS) toxických látek I U 1 ívf$ VV// | v prostředí ^ W Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno Stanovení celkového a organického obsahu uhlíku Princip stanovení Homogenizovaný (mletý) vzorek o definované váze je zabalen v cínové kapsli a dávkován pomocí automatického carouselu do reaktoru, který je vyhříván na 950°C v proudu kyslíku. Spalováním vzorku vznikají různé oxidy, které jsou dále vedeny přes systém katalyzátorů a odlučovačů halogenů a vody až do infračerveného detektoru selektivního pro C02. Detektor je kalibrován pomocí vzorků o známém obsahu uhlíku (standardní půdy apod.). Tímto postupem stanovíme tzv. celkový obsah uhlíku (TC). Pokud je vzorek před analýzou upraven kyselinou chlorovodíkovou (odstranění uhličitanů vznikem C02), výsledná detekce uhlíku je pouze příspěvkem organického uhlíku (TOC). Spuštění stroje Otevřeme přívod kyslíku a zapneme přístroj. Po otevření programu se zobrazí hlavní okno, ze kterého se ovládá celý stroj. Dolní zelený panel zobrazuje všechny potřebné parametry, které se kontrolují před samotnou analýzou. Detektor by měl vykazovat konstantní nízkou odezvu, teplota reaktoru musí stoupnout na 950°C, jinak není možné začít analýzu. Průtok plynu by měl být stálý kolem 200 ml/min. Pokud je průtok nestalý, signalizuje to netěsnost systému (praskliny na reaktoru, neuchycené spoje apod.). 14 Centrum pro výzkum <>if«R«^ /*ŕ*í* toxických látek U «¥1 VV// | v prostředí ^ ^ Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno Příprava pevného vzorku Vzorek musí být dobře homogenizovaný a vysušený. Navážka vzorku je dostatečná mezi 10 -60mg. Na větší navážky je potřeba použít větší než běžně užívané cínové fólie. Na cínové fólie se nesmí sahat rukou (organický uhlík v potu a částečkách kůže. Vždy užívejte pinzety. Cínové fólie je potřeba od sebe oddělit. Jedna fólie váží cca 75 mg. Pokud si nejste jisti, zvažte fólii a tím zjistíte, zda je skutečně jen jedna (pokud by vzorek šel do stroje se dvěma fóliemi, mohlo by dojít ke zvýšení spalného tepla a k nežádoucí chybě. Z fólie se na "tvarovací" připraví mistička pomocí širšího konce plastové tyčky. Po navážení vzorku se na "tvarovací" zabalí vzorek do cínové fólie (obrázek 11) a vytlačí se kovovou tyčkou, tím vznikne uzavřená čočka se vzorkem. Je dobré vyzkoušet kompaktnost čočky mírným hozením čočky na bílý papír, kde by byl případně vidět vysypaný podíl vzorku. Takto připravený vzorek dáme na danou pozici carouselu a zapíšeme navážku do tabulky (obrázek 11). Všechny vzorky by se měly měřit 2x. Obrázek 11: Příprava vzorku pro stanovení TC a TOC TOC - vzorky pro stanovení TOC a ne TC jsou upraveny kyselinou chlorovodíkovou. Nejprve 35% a poté 1:1. Vždy stačí několik kapek do viditelné reakce s uhličitany. Poté se vzorek na půl hodiny vysuší při cca 120°C a takto upravený se analyzuje jako ostatní vzorky. Obsah TIC oproti TOC nebývá příliš významný u půdních vzorků. Příprava sekvence pro analýzu Před samotnými vzorky se zařazují, "Run-in" a blanky, popř. standardy. Nejprve pozice 1 a 2 name: Runln, kde je v těchto pozicích umístěna prázdná čočka (jde o tzv. zvyknutí si stroje na typ vzorku). Pozice 3-4 by měly být také prázdné čočky, ale tentokrát pro výpočet blanku. U Blanku i Runln se píše váha lmg. Pro jistotu je vhodné zařadit další vzorek standard a případně přepočítat tzv. daily factor. Na další pozice již píšeme názvy vzorků (nesmějí být použita již definovaná jména:blank, std_soil, Runln, khp...) a jejich váhy. V pozici method vybereme Solid TC pro všechny vzorky příp. Solid_KHP. 15 Centrum pro výzkum /S*5?\ (fS) toxických látek I U 1 ívf$ VV// | v prostředí ^ W Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno Analýza a export výsledných dat Po správné kalibraci, vyplnění tabulky vzorků a zkontrolování všech parametrů potřebných k analýze, můžeme nastartovat analýzu pomocí zeleného tlačítka se symbolem I (automatický sampler). Symbol l/Oje pro analýzu jednoho vzorku. Průběh analýzy je možné sledovat na pravém grafu. Doba analýzy je cca 8 min. Píky odezvy NDIR detektoru jsou automaticky integrovány a výsledky jsou vyjádřeny v %TC. Příkazem CTRL-E nebo File/Export můžeme exportovat výsledky do formátu mdb nebo xls. Takto exportované výsledky je již možné upravovat. Ukončení práce Před vypnutím stroje je vhodné použít tlačítko Sleep now! a počkat než klesnou průtoky na 0 ml/min (odvzdušení systému). Poté můžeme zavřít program, zavřít hlavní ventil kyslíkové bomby a vypnou hlavním vypínačem stroj. 16 Centrum pro výzkum <>if«R«^ /*ŕ*í* toxických látek U «¥1 VV// | v prostředí ^ ^ Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno Stanovení PAHs, PCBs a OCPs ve vzorku volného ovzduší Princip stanovení Exponované odběrové médium (PUF disk) je obohaceno směsí standardů a extrahováno v dichlormetanu na automatickém extraktoru Búchi Systém B-811 (extrakce 40 min - dolní ohřev 9, horní ohřev 2; prokapávání 20 min, dolní ohřev 9) a extrakt zahuštěn na stejném zařízení (15 min, dolní ohřev 9). Následně je extrakt přečištěn na koloně plněné aktivovaným silikagelem. Eluát obsahující PAHs, PCBs a OCPs je odpařen pod proudem dusíku a převeden do minivialky pro GC stanovení. Postup stanovení Extrakce Přidán extrakční standartu PBC 2K, D-PAHs a (50ul). Extrakce na automatickém extraktoru Buchi ve 150 ml DCM. Převedení do vialky, objem upraven na cca 10 ml. Dělení extraktu v poměru 1:9 PAH : (PCB, OCP) na vahách. Předtištění PAHs Frakcionace na 5 g (po rysku) aktivovaného silikagelu: 1) 10 ml n-C6 2) 20 ml DCM - jímají se obě frakce, odpařeno na 0,5 ml. Převod do kónických vialek, 2x výplach hexanem, přídavek 50ul nonanu. Ponechání v digestoři přes noc, nebo redukce pod dusíkem na konečný objem 50 ul. Přídavek standardu terfenyl na konečný objem lOOul. PCBs, OCPs Odpařeno na 1 ml. Frakcionace na aktivovaném silikagelu modifikovaném kyselinou sírovou: (8g- po rysku) ,eluce 30 ml směsi hexanu/DCM 1:1, odpařeno na cca 0,5 ml. Převod do kónických vialek, 2x výplach hexanem. Přídavek 50ul nonanu, ponechání v digestoři přes noc, nebo odfoukání na objem 50 ul Přídavek standardu 50 u.1 PCB 121. Analýza je provedena ve stopové laboratoři LSA pomocí GC/MS. 17 (©) Centrum pro výzkum ^Ulí^ toxických látek flUlf .(V)! v prostředí Vgs& Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno 18