Molekulární taxonomie a fylogenetika I (metody aplikovatelné v molekulární taxonomii) Elektroforeze proteinů - Elektroforeze horizontální, vertikální, kapilárová Prostředí pro elektroforézu - pufr s vysokou iontovou silou a pH co nejvíc odlišným od izoelektrického bodu zkoumaného proteinu (při pH pufru 8 - 9 má většina proteinů negativní náboj a migruje k anodě Základný předpoklad: změna v pohyblivosti proteinu je podmíněna změnami v sekvenci DNA Vnitrodruhové studie - genetická proměnlivost v populacích - genetická diferenciace mezi populacemi - genetická struktura populací - vymezení druhů a hranic jejich areálu Mezidruhové studie - rekonstrukce fylogenezy - speciace a hybridně zóny Omezení - detekovatelné jsou jen rozdíly, ne podobnosti - rozdíly můžou být způsobeny posttranslačními modifikacemi - použitelná jen úzka část genomu Využití sekvencí nukleotidů - genetická informace -o primární struktuře polypeptidů (bílkovin), -o primární struktuře DNA nebo RNA Funkčné vztahy mezi nukleovými kyselinami a proteiny DNA replikace —HDNA — transkripce—►RNA translace enzymy proteiny stavebné složky organel a struktur buňky Atrichopogon sp. Kolik najdete rozdílů? ■■■■■■ . .: ^qar VcVÉYY ď Vb kn.ff i c t ■ Yá ei i*e j ít i t ■ tjJBi ** r_i ■ i it FíTiTi kVfti |4Tp>iicti r.cit.> e b í I ■ - ...TTAGTTCGAGAAAAATGTTCGCGTTACGTGCTGCATCTAAAGCCGATAAGAATTTGCTGCCATTCTTGGGGCAATTGTCTCGTAGCCATGCTGCCAAGGCTGCAAAGGCTGCAGCTGCCGCAAATGGAAAGA TTGTGGCCGTAATTGGTGCAGTCGTCGATGTCCAGTTTGATGATAACTTACCGCCCATTCTGAATGCCTTGGAAGTAGACAACCGTTCTCCTCGGCTCGTGCTAGAGGTGGCCCAGCACTTGGGAGAAAATAC CGTGCGCACTATCGCCATGGATGGTACCGAAGGCTTGGTTCGCGGACAGAAGGTTCTCGATACTGGGTATCCTATCCGAATTCCAGTTGGTGCCGAAACACTAGGACGCATCATTAATGTTATTGGTAAGTAA ATTATATTAAAACATAAGAAAGAAATTAAGAAATTCTTTGAACAGGTGAACCCATTGATGAGCGTGGACCAATTGATACAGACAAGACCGCTGCCATTCATGCTGAGGCTCCTGAATTCGTTCAGATGTCTGTTGA GCAAGAGATTCTTGTCACTGGAATCAAAGTCGTCGATCTCCTGGCTCCATACGCCAAAGGTGGTAAAATTGGGTTGTTTGGAGGTGCCGGTGTGGGCAAAACTGTGTTGATCATGGAGCTCATTAACAACGTG GCTAAAGCTCATGGTGGATACTCGGTTTTCGCGGGAGTTGGTGAACGCACTCGTGAGGGAAACGATTTATACAATGAGATGATCGAGGGTGGTGTTATTTCACTAAAGGACAAGACCTCAAAGGTGGCTCTCG TATATGGGCAAATGAACGAGCCGCCAGGTGCTCGTGCCCGTGTTGCTCTAACTGGACTGACCGTTGCAGAGTACTTCCGTGATCAAGAAGGACAGGATGTGTTGCTGTTTATCGACAACATTTTCCGATTTACT CAAGCTGGCTCAGAAGTGTCCGCTTTGTTGGGTCGTATTCCCTCAGCCGTCGGTTACCAGCCAACCTTGGCTACCGACATGGGTTCTATGCAGGAGCGTATTACCACCACCAAAAAGGGATCCATTACTTCTGT TCAGGCCATATATGTGCCCGCTGATGATTTGACCGATCCTGCTCCTGCTACTACATTCGCTCATTTGGATGCCACCACTGTACTCTCGCGTGCGATTGCCGAACTGGGTATTTACCCTGCTGTGGATCCACTGG ATTCGACTTCTCGAATCATGGATCCCAACATCATTGGCCAAGAACACTATAACGTTGCCCGTGGTGTGCAGAAAATCTTGCAAGACTACAAATCACTTCAGGATATAATAGCCATTCTCGGAATGGATGAGTTGT CTGAGGAAGATAAGCTCACAGTCGCTCGTGCTCGCAAGATTCAGCGTTTCTTGTCGCAGCCATTCCAAGTTGCTGAAGTCTTCACCGGGCATGCTGGTAAACTAGTGCCCCTGGAGCAAACTATAAAAGGTTTT CAGCAATTCTAGCTGGGGACTACGACCATCTACCTGAAGTTGCTTTCTACATGGTCGGCCCAATCGAAGAAGTTGTAGAAAAGGCTGACCGCCTGGCAAAGGAAGCTGCCTAGATAGGCGTACTGGAAAAATC TTCAAAGTCAGCAAATCTATCATTGAATATTATGCATTGAATTTGTAATAAACTTTGTAAGATCAAATTAAATTCAATACAAGCGAAGAAAAAGTTAATAAAACCTATTTAAACATTACGGTATGA... Molekulární znaky mají oproti klasickým řadu výhod: • Jejich libovolné množství • Jsou vzájemně distinktní, kvalitativní, na sobě nezávislé • Umožňují srovnávat i nepříbuzné organizmy • Jsou selekčně neutrální —c I. Základ všeho Nukleové kyseliny DNA - objevená r. 1953 - James Watson, Francis Crick Struktura: dvoušroubovice - pentózafosfátová kostra, na kterou jsou navázané dovnitř orientované purínové/pyrimidínové báze komplementárně spojené vodíkovými můstky Purínové báze : A, G Pyrimidínové báze: C, T, U Jaderná DNA Organelové NK - Mitochondriální, chloroplastová DNA - vlastní kruhová DNA - mateřská dědičnost - molekulární evoluce mtDNA rychlejší než u jaderní DNA Ribozomální RNA - LSU rRNA a SSU rRNA - evoluce LSU rRNA o 30% pomalejší jako SSU rRNA Type of DNA Organism size in base pairs mammals 6x 109 plants 2x 108-2x ion chromosomal DNA fungi 2x 107-2x 108 animals 16x 103 - 19x 103 higher plants 150 x 103 -250x104 fungi 17x 103- 78x 103 green alga 16x 103 mitochondrial DNA protozoa 22x 103-40x 103 higher plants 120 x 103 -200x103 chloroplast DNA green alga 180x 103 mtDNA rRNA Gene that codes tor ri bo soma I RNA : iETSi iITS Ii JTS2 NTS i i IBS j is.asi ETSi i ITS Ii 1TS2J NTS i i IBS i ]5,8S' i 283 DHD3 expansion region D2TJ3 expansion region Dva pohledy genomiky • Vertikální: kompletné genomy, hluboké, ale omezené informace • několik druhů a jedinců • úspěšně ukončeno u člověka, Drosophily a některých plodin • Horizontální: krátké cílené sekvence, plytké, ale široké informace • mnoho druhů a jedinců • např. DNA barcoding Historické výzvy • Problémy s konceptem druhu a jeho aplikacemi • Problémy s druhovou identifikací • Systém znaků - morfologie, genetika, atd. • Přístup k existujícím informacím • Snižování odbornosti • Snižování dostupných služeb • Genomika a Internet nabízí nové možnosti Základné metody • Štěpení NK • Polymerase chain reaction • Proby, hybridizace • Vektory, molekulární klonování • Microarrays • DNA sequencing • Elektroforetická separace NK • Detekce genů: *DNA: Southern blotting; inSitu hybridization; FISH Technique *RNA: Northern blotting *Protein: Western blotting, immunohistochemistry K purifikaci (extrakci) nukleových kyselin může být jako vstupní materiál použit: • krev • tkáň • bakterie • houby • živočíšne bunky • rostliné buňky • exkrementy, vývržky • agarózové gely Výběr použité techniky závisí pouze na nás... • typ vstupného materiálu • očekávaný výtěžek • věk vzorků • čas • finance • požadovaná kvalita Všeobecný postup extrakce: 1. Digesce tkáně / lyže buněk 2. „chelátování" a proteinázová fáze 3. Separace NK a proteinů 4. Pročištění Odběr tkáně k získání NK Odebrání tkáně - živý nebo usmrcený Přenos tkáně na parafilm a následné zjištění hmotnosti na analytických váhách RNA Přenos sleziny do 1,5ml mikrozkumavek Přidání Trizolu Homogenizace sleziny Skladování homogenizované sleziny při teplotě -80 °C TRIZOL® Reagent (Invitrogen )- - monofázický roztok fenolu a quanidin izothiocyanatu - zlepšení prvního kroku metody izolace RNA vyvinuté Chomczynskim a Sacchim - počas homogenizace vzorky udržuje integritu RNA Extrakce RNA Fáze separace: Isopropanol Chloroform ti Centrifugace (4°C) Přenos supernatantu do nové zkumavky Fáze precipitace: Promyváni RNA: 75 % etanol Znovurozpuštění RNA RNA -free voda Centrifugace (4°C) Centrifugace (4°C) Sušení RNA Extrakce DNA DNA - fixace v 70% nebo 90% EtOh - Přenos tkáně do extrakčného pufru (Tris, EDTA, NaCI) - Přidání Proteinázy K a SDS - odštěpují proteiny okolo DNA - inkubace při 55-65°C počas několik hodin - degradace tkáně Fáze separace: phenol: chloroform: isoamylalcohol, chloroform isoamylalcohol - odstanění organické fáze, bifenolů Fáze precipitace: NaAc + EtOH 90% Fáze promyvání: EtOH 70% Fáze rozpuštění: DNA free voda nebo pufr Extrakce hmyzí DNA Hmyz - Insecta - kutikula z chitinu Nevhodná fixace materiálu -formalín Klíčový krok extrakce - nabourání exoskeletu Několik způsobů: fenol-chloroformová metoda - možno využít PLG zkumavky výhody, nevýhody extrakce pomocí komerčního kitu (Qiagen, Machery-Nagel, etc.) PCR: Amplifikace DNA • Často je k dispozici jen malé množství DNA - kapka krve - Vzácný typ buněk • V současnosti existují dvě metody pro amplifikaci DNA nebo tvorbu kopií - Klonování—trvá dlouho, než dostatek klonů dosáhne požadovaného stupně kvality - PCR—funguje dokonce i na jediné buňce hned PCR (polymerase chain reaction) - polymerázová řetězová reakce umožňuje amplifikovat in vitro požadovaný specifický úsek DNA prakticky v neomezeném množství, přičem množství původního vzorku DNA může být extréme malé. Historie PCR: - 1955- objev TAQ DNA polymerázy - první myšlenky o možnosti umělé synteze DNA - 80. roky- rozvoj umělé synteze oligonukleotidů - 1983- Kary Mullis - princip metody - 1984- Kary Mullis, Fred Faloon - dokončení metody a patentování - 1993- Kary Mullis - Nobelova ceny za chemii Je život fair? • 1983 - Kary Mullis, vědec pracující pro Cetus Corporation řídil podél US Route 101 v severní Californii, když ho napadla myšlenka polymerázové řetězové reakce • 1985 - metoda PCR byla představena vědecké komunitě na kongresu • Cetus odměnil Karyho Mullise $10,000 bonusem za jeho nápad • později, počas korporátní reorganizace Cetus prodává patent na PCR farmaceutické firmě Hoffmann-LaRoche za $300 millionů Život není fair! RT-PCR (v prípade práce s RNA) RT-PCR: (reverse transcription polymerase chain reaction); PCR reverzná je určena k amplifikaci molekul RNA, která sa nejdřív přepíše enzymem reverzní transkriptázou do cDNA a ta sa pak amplifikuje standardním postupem (PCR): Obsah mixu pro RT-PCR: 1. -kvalitní redestilovanú voda -Oligo(dT)- používá se při syntézách reverzní transkriptázou prvního řetězce cDNA -dNTP -RNA Široké použití, hlavně k velmi různých tkáních -RT5X -DTT(dithiothreitol; Clelanďs reagent) -RNAse OUT 3. M-MLV RT -(Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase)-RNA závislá DNA polymeráza,používá se při syntéze cDNA použitím RNA jako templátu přesné detekci a kvantifikaci konkrétní mRNA v Primery a PCR Design vhodného primem - specifický na různých úrovních, návrh podle sekvence z GenBanku, úprava vlastností vhodným SW (Oligo, GeneRunner) PCR - namnožení požadovaného úseku DNA, ovlivňována mnohými faktory (kvalita DNA, Tm, kvalita primem, koncentrace Mg2+, přítomnost inhibitorů, typ eppendorfky, typ polymerázy - TAQ (Thermus aquaticus), Pfu (Pyrococcus fuho u suš) Volba primem: 1. Délka 17-25 bazí 2. Sekvence primem co nejvíc shodná se sekvencí templátu v místě jejich vazby 3. Pozor!!! -sekvenční komplementarita uvnitř primem -neměli by být komplementární mezi sebou 4. Optimální obsah C-G bazí se doporučuje 50-60% Co potřebuje PCR? • Templát (DNA, kterou testujeme) • Specifické primery pro studovanou oblast, forward a reverz • Polymeráza • Nukleotidy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) • Magnesium chloride (enzyme cofactor) • Buffer • Enhancer • Vysoce kvalitní DNA-free voda, minerální olej dNTP: směs všech čtyř nukleotidů dGTP dTTP - nižší koncentrace dNTP= vyšší specifita, nižší frekvence začlenění nesprávneho nukleotidu MgCU: -správna funkce polymerázy, příliš vysoká koncentrace -> aktivita Taq polymerázy klesá, proužky na gelu jsou rozmazané nebo zmnožené následkem amplifikace nespecifických fragmentů -koncentrace vyšší než konc. dNTP Kroky PCR • Denaturace 93 - 95°C 1min • Annealing 50 - 55°C 45sec • Elongace 70 - 75°C 1-2min Jak tedy probíhá PCR? • Horko (94°C) k denaturaci DNA dvouvláken • Zchlazení (54°C) k přisednutí primem k templátu • Teplo (72°C) k aktivaci Taq Polymerázy, která prodlužuje primery a replikuje DNA Opakování cyklu PCR : Polymerase Chain Reaction 30 - 40 cycles of 3 steps : Step 1 : deiialuration ] minut 94! '-C 5' TTlTMTTMmnTlTTnTWW y step 2 III, 5' primers! 45 seconds 54 °C PCR Primery Primer je úsek NK, který slouží jako startovací místo replikace Je potřeba mít jak forwardní, tak reverzní primer, aby byla cílová sekvence tvořena simultánně v obou směrech Problémy s primery • Primery by měly ohraničovat cílovou část DNA sekvenci • Primery, které jsou komplementární k více místům, budou tvořit víc produktů • Primer může tvořit dimér se sebou nebo s druhým primerem 5 '-ACCGGTAG CCACG AATTCGT-3' 3'- TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5' Limitace PCR • Jsou potřebné informace o cílové sekvenci design primem pro neznámé známé hraničně oblasti Chybovost při DNA replikaci Taq Pol - Error 40% po 20 cyklech • Krátká délka a omezené množství produktu do 5kb je lehko amplifikovatelný produkt. do 40kb je amplifikace s modifikacema možná nelze amplifikovat geny >100kb nelze použít v projektech sekvenování genomu Design PCR primerů • Sekvence primerů by měly být unikátní • Sekvence primerů by měly být -20 bazí dlouhé • Obsah G/C by měl být 45-55%. • Annealingová teplota by měla být podobná • Na 3'-konci by měly být G nebo C. • Nesmí mít self-komplementární oblasti nebo vytvářet hairpiny • Nesmí mít repetitivní oblasti Výhody PCR • Rychlost • Snadné použití • Citlivost • Robustnost Typy PCR reakce RT-PCR „Nested" PCR Inverzní PCR Multiplex PCR Asymetrická PCR RAP D PCR First set of Primers Target DNA First set of Primers Specific Amplification of the Target DNA Vizualizace produktů v agarózovém gelu a purifikace PCR produktů Agaróza Pufr (TBE, TAE) Etidium bromid Nanášecí barva (brómfenolová modř) Horizontální elektroforéza Kontrola výsledků po PCR: •agarózový gél: agaróza- přírodní koloid extrahovaný z mořských řas •pufr TBE- Tris-Borát-EDTA •mikrovlnka 1. odměření agarózy 2. rozpuštění agarózy v TBE 3. Povaření roztoku 4. Ochlazení roztoku agarózy na 55 °C 5. Fluorescenční barvivo EtBr! - silně mutagen rukavice, 0,5[jb/ml - dochází k jeho implementaci do DNA 6. plastová forma na gél a hřeben: 30 min. 7. nanášecí pufr: obsahující barvivo (brómfenolová modř) a glycerol (napomáhá 8. ladder- standard nebo „žebřík", směs fragmentů známé délky 9. kontrola amplif i kovaných fragmentů v UV světle pomocí transilluminátoru a dokumentace kamerou nebo digitálním fotoaparátem 100 bp Ladder Purifikace PCR produktů - QiaQuick PCR Purification Kit (Qiagen), ExoSap, ethanolové pročištění Po potvrzení pozitivního PCR vzorku - 1. přímé sekvenování produktu 2. klonování produktu do hostitel, vektora a jeho následné sekvenování použitím univerzálních primerů Klonování DNA Základné pojmy a principy klonování: Klonování: proces tvorby klonů DNA vložením segmentu DNA do klonovacího vektoru za vzniku rekombinantní molekuly DNA a jejím následním pomnožením v hostitelském organizmu Klon DNA: soubor identických molekul, fragmentů nebo úseků DNA Klonovací vektor: najčastěji se používají kruhové molekuly DNA schopné autonomní replikace, odvozené v našem případě z plazmidů= plazmidové vektory. Vlastnosti vektorov: •malá velikost, lehce se izolují a v buňkách dosahují vysokého počtu kopií •schopnost stabilného udržení cizorodé DNA při replikaci a uchovávání klonů •schopnost lehkého a účinného přenosu do hostitelských buněk •přítomnost selekčního markru (např. geny odpovědné za rezistenci na antibiotika) •přítomnost vhodných klonovacích míst Přenos plazmidového vektoru do hostitelských buněk: -transformace -hostitelem plazmidových vektorů jsou buňky kmenů E. co// Určení bakteriálnyíh kolonií obsahujících rekombinantné plazmidy: - Alfa-komplementace Mapa klonovacího vektoru: M13 Reverse Primer Kpn\ Sac I BamH I Spe I 205 ICAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC ttg GTA CCG AGC TCG GAT CCA CTA IgTC CTT TGT CGA TAC TGG TAC TAA TGC GGT TCG AAC CAT GGC TCG AGC CTA GGT GAT Ss/XI EcoRI GTA ACG GCC GCC AG T GTg'cTG GAA TTC GCC CTTj CAT TGC CGG CGG TCA CAC GAC CTT AAG CGG GGC GAA TTC TGC TTC CCG CTT AAG ACG AGA TAT CCA TCA CAC TGG CGG CCG CTC GAG CAT GCA TCT AGA GGG CCC AAT TCG TCT ATA GGT AGT GTG ACC GCC GGC GAG CTC GTA CGT AGA TCT CCC GGG TTA AGC CCC TAT GGG ATA M13 Forward (-20) Primer M13 Forward (-40) Primer AGT GAG TCG TAT TAC AAT TCA TCA CTC AGC ATA ATG TTA AGT CTG GCC GTC GTT TTA dAA CGfT CGT GAC TGG GAA AAC GAC CGG CAG CAA AAT GTT GC\ GCA CTG ACC CTT TTG Bílé kolonie bakteriálních buněk s včleněným rekombinantním plazmidem Modré kolonie bakteriálních buněk bez inzertu. Tvorba aktivní li-galaktozidázy rozkladajícíj chromogénny substrát X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galaktozid) Kontrola: štěpení enzymy (napr. Eco R1) a elektroforeze M13 Reverse Primer Kpn I Sac I SarnHI Spel GTC CTT TGT CGA TAC TG 205 I cAG GAA ACA GCT ATG AC: ATG ATT ACG CCA AGC TTG GTA CCG AGC TCG GAT CCA CTA TAC TAA TGC GGT TCG AAC CAT GGC TCG AGC CTA GGT GAT GTA AC G GCC GCC AGT GTG CAT TGC CGG CGG TCA CAC GAA CTT CTC GCC CTT iAG CGG G, G GG TTC CC GAA CTT 'TC TGC lAG ACG EcoRV BsfiCI Noil X/101 Nsi I Xba I Apa I I - III II I AGA TAT CCA TCA CAC TGG CGG CCG CTC GAG CAT GCA TCT AGA GGG CCC AAT TCG TCT ATA GGT AGT GTG ACC GCC GGC GAG CTC GTA CGT AGA TCT CCC GGG TTA AGC CCC TAT GGG ATA M13 Forward (-20) Primer M13 Forward (-40) Primer CTG GCC GTC GTT TTA CAA CGT CGT GAC TGG GAA AAC GAC CGG CAG CAA AAT GTT GCk GCA CTG ACC CTT TTG Sekvenování DNA - od roku 1977 1. Chemická metoda (Maxam-Gillbertova) - bázově specifická chemická modifikace + následné štěpení fragmentů DNA 2. Enzymatická (Sangerova) - terminace replikace nového řetězce podle matrice zkoumané sekvence ddNTP (na 3'uhlíku deoxyribózy chybí OH skupina) Prirrw f Or replication Strand to be sequenced Prepare four reaction mixtures; include m each a tírffareni replication-stopping nucleotide Replication product s of -^^L Primar > Pnmer Prime*- Primed DNA Separate products by gel electrophoresis Raacf saqence as comptemnn! of bands containing labeled strands SANGEROVA metoda Nejpoužívanější způsob sekvenování Objeveno Frederickem Sangerem -1977 Nobelova cena - 1980 Nahrazení radioaktivního značení fluorescenčními barvičkami • Oligo - hybridizační sondy • Radioaktivní nuklidy: 3H, 32P, 35S, 125l • Detekce záření na scintilačním fotometru nebo autoradiografií na RTG filmu • 3' i 5', celé fragmenty: DNA I pol, Klenowův fragment, T4 DNA pol, T4 polynukleotid kináza, alkalická fosfatáza (BAP, CIP) • Fluorochromy - široké spektrum a využití v biologii • 6-FAM, NED, PET, ROX, HEX, VIC, JOE, LIZ, BigDyes • Detekce fluorescenčního záření: laser + indukční a emisní spektrum fluorochromu - excitace fluorochromu - detekce přes optický systém (CCD kamera; vzduchem chlazený CCD čip) - virtuální filtrování - vlnová délka se odečítá pouze v oblasti spektrálního maxima • Ovlivnění mobility fragmentů ABI Prism® Applied Biosystems Applied Biosystems Applied Biosystems Applied Biosystems 310 Genetic 3130 Genetic Analyzer 3130x/Genetic Analyzer 3730 DMA Analyzer 3730*/ DNA Analyzer Key applications: De novo sequencing • Resequencing • Mutation/heterozygote detection SNP genotyping • Relative fluorescent quantitation • Micro sate I lite analysis • AFLP® analysis Methylation analysis •T-RFLP analysis • MLST • BAC fingerprinting • SAGE™ ABI 3100 ABI 310 ABI 3100-Avant ARll7nn ^vcini SOLID SOLID PA ABI 3700 ABI3130/XL „. „„, . , T „ftA ABI 3500/xl. Ion Torrent J7UA , , i , ABI3730/xl. 1996 1998 2001 2003 2007 2009 2011 2010 Sekvenování DNA Automatické sekvenování DNA- sekvenátor -Modifikace Sangerovy metody -Syntéza DNA probíhá metodou asymetrické PCR v termocykleru s využitím Taq- polymerázy -Ke značení reakčních produktů se používají fluorescenčně značené primerv nebo ddNTPs (odlišné barviva pre NTP) - rozdělení v jedné dráze gelu - Detekce produktů - elektrická separace automaticky pomocí laserového detektoru napojeného na počítač (elektroforetická separace v kapilárách) Zpracování sekvenačních dat Manuální korekce sekvencí - Sequencher 5 (Gene Codes Corp.) „Zalinení" sekvencí - NCBI BLAST, ED program v MUST package (Philippe, 1993), Clustal W v BioEdit 5.0.9 (Hall, 1999) Fylogenetická analýza - MEGA 5 (Tamura et al., 2011) PAUP* 4b10 (Swofford, 2001) ATGCGTCGTT I I I I I I I I I ATGCGTCGT A T G---C G T C G T T III III ATGCGTCGT ATGCGTCGTT II I I I I I ATCCGTCAT File Edit Select Contig Seguence View Window Help H Show Chromatograms 1 Help Insert Help Insert Help Reposition -i^-^jin 13A:ľi ata a at 3 í í:s-;_::: lBBaiaaais; IkTCAiTJLATTCAATAATTÄTT 3IITTAAAATACAAAASTTTATT 5 Ü.:TOUT.-..-.ľTCAÄIľ IB.TT-B1 BT T T.-.CSI IT.-.II.- riTTlitCATT^ Jjpfrag bases |[ô TŠÔ ITÔ I 10 0 I 110 I 120 1 130 I 140 I 15 C I lí 0 Ti selected at 1A " I AT AAAT 3 SAT "AAIAATTCAAIA A IT AT T 3TT T T AAAATA~AAAA3I IT A IT At AT T T T Ji T AT iľACC :ľ :ľA AT AAAA I A AT T T T T I A "AT T AAA T T consensus position 135 lil li. Hei Urb:-. atugrfinii iron i Cofitig[0GVf 2] H Ť T Ť T 3ŘH H T H H T T TRH H H 3 H H T HS T33 3 3 T T HT T T T HT aA.aaaaaAaAaaAaaaaAaaAAAaA/W\AaAaaAaaaAAa. CRH R R G T T R T T R R R -.: : ::: = ;:-=- :řk-. = =1 = -. - :: T TT T W T TAT C A G T T H C R R T R R R R T R R MaAíWa&aAaaAAAaaaaAaaAaaAAAAaaaaAAAAaAA MEGAv. 5 - úprava sekvencí (alignment) ^.Alignment Ex p íore ľ {CADoctiments arid S^ing5y^n.rJrea\P!o.cha\29_0 6^55. meg) Data Edit Search Alignment Web Seguencer Display Help □ & y "3 w i^ii rl ß x * •41 !► D NA S eqUences T ranslated Protein S equences | 15 165 clc3 2S 165 clc3 3S 165. Clc3 4S 165 cic3 55 165 clc3 75 155 clc3 8S 165 clc5 5S 165 clc3 IIS 165 clc3 13S 165 Clc3 is; L6S clc3 1SS 165 clcS 20S 165 clc3 215 165 clc2 22: L65 cic2 395 16S clc-3 405 165 ClcS 41S 165 clc2 465 165 clc3 47S 165 clc3 48S 165 clc3 455 165 clc-3 515 165 clcS 445 16S clc-3 54S 16S clcS 555 165 clc3 ^zzz^z AAXt AAŤT ■iii ib ii Další metody založené na NK • RAP D (Random Amplified Polymorphic DNA) - náhodně zvolené primery, nízka teplota zchlazení - DNA -» mnoho segmentů (na elfo - soubor druhově specifických proužků) - příbuzné vztahy mezi populacemi jednoho druhu nebo mezi blízce příbuznými druhy Nevýhoda - velmi nízká opakovatelnost experimentů • Hybridizace DNA - Zahřátí DNA - 2 samostatné řetězce - Ochlazení - vznik dvouzávitnice - Opakované zahřátí - rozpletení DNA - teplota, u které se rozplete 50% hybridizované DNA - Vyhledávání a charakterizace specifických nukleotidových sekvencí, porovnání DNA dvou druhů za pomoci hybridních úseků o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o c IH o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o • o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o • o o o o o o o o o o o o o o • o o o o o o o o o o o o o oHo o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o pil9A>]9S 9A0IJ0 >] 9UJBJU9W9|dlU0>] 9S JOnOZBA 90U9A>]9S VNíd 0q9U VNQ BU90BUZ Á>]0!W9l|0 0q9U 9UA!J>]B0!PBJ íBA00Z9J9J0Up9Í-ÁpUOS JUOBZpjqÁlI BABJdjjd - >]OJ>] ÁAC»]S!P01|0ÁA - Reštrikčné analýzy - RFLP, DNA fingerprinting Tvorba restrikčních map - zjištění polohy reštrikčných míst na DNA V zoologických výzkumech je namísto polohy reštrikčných míst upřednostňována informace o délce restrikčních fragmentů • RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) - reštrikčné endonukleázy - organelová DNA -»fragmenty - porovnání geneticky totožných a odlišných jedinců na základě proměnlivosti velikostí restrikčních fragmentů Otisk DNA (fingerprinting) - analýza restrikčních fragmentů tzv. minisatelitní DNA Princip - Southern blotting a hybridizace se značenou sondou - analýzy na úrovni vnitropopulační, mezipopulační a mezidruhové ^ 2 3 4 5 e ? 8 — — — — — — — —v — — — — = — — = v — — — — — — — —v 1 2 Analýza mikrosatelitů Mikrosatelity - krátké tandemovitě se opakující jednoduché sekvenační motivy, 2-6bp - výskyt ve všech genomech - vysoká mutační rychlost Analýza: PCR, 20-30 cyklů, primery komplementární se sekvencí kolem mikrosatelitového lokusu automatický sekvenátor s fluorescenčně značenými primery - finančně nákladné Použití: genotypování jedinců, určování paternity, velikosti a struktury populace, genetická proměnlivost, tok genů specifické mikrosatelity: identifikace populací a druhů, dynamika hybridních zón