Molekulární identifikace •Druh, jedinec, pohlaví http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c1/Male.svg/100px-Male.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/23/Female.svg/120px-Female.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c1/Male.svg/100px-Male.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c1/Male.svg/100px-Male.svg.png http://www.nhbs.com/images/jackets_resizer_xlarge/19/196496_3.jpg Identifikace druhů DNA barcoding Definice druhu •Koncept biologického druhu (Mayr, 1942) – RIM = post- nebo prezygotické bariéry toku genů (ne vždy tak jednoduché – hybridní zóny, alopatrická speciace, asexuální druhy atd.) •Další koncepty (např. typologický = morfologický, genetický, fylogenetický aj.) • •Proč je vůbec potřeba druhy určovat (geneticky)? •Ochranářská biologie – je nutno rozhodnout o taxonomické jednotce (druhu), která vyžaduje pozornost •Forenzní genetika, vývojová stadia bez determinačních znaků, identifikace kořisti v trávicím traktu predátorů, atd. Barcoding is a standardized approach to identifying plants and animals by minimal sequences of DNA, called DNA barcodes DNA Barcode: A short DNA sequence, from a uniform locality on the genome, used for identifying species The Barcoding Pipeline •first idea in 2003 CBOL •CBOL in 2005 iBol •iBOL 2010-2015 •500 000 species barcoded in 2015 world species known and unknown 26dec2004 Why barcode animal and plant species? Crisis of biodiversity and classical taxonomy •DNA barcoding is important part of „integrative taxonomy“ Integrative taxonomy What are the benefits of standardization? why barcode standardization •Suitable standard for animals → mtDNA Why barcode animals with mitochondrial DNA? Mitonuclear coevolution as the genesis of speciation (?) •Rand et al. 2004 •red = mtDNA blue = nDNA •Hill 2016 Why barcode animals with mitochondrial DNA? •Four properties make mitochondrial genomes especially suitable for identifying species why mitochondria • • •1. Greater differences among species, on average 5- to 10-fold higher in mitochondrial than in nuclear genes. Thus shorter segments distinguish among species, and because shorter, less expensively. •2. Copy number There are 100-10,000 more copies of mitochondrial than nuclear DNA per cell, making recovery, especially from small or partially degraded samples, easier and cheaper. • •3. Relatively few differences within species in most cases. Small intraspecific and large interspecific differences signal distinct genetic boundaries between most species, enabling precise identification with a barcode. • •4. Introns, which are non-coding regions interspersed between coding regions of a gene, are absent from mitochondrial DNA of most animal species, making amplification straightforward. Nuclear genes are often interrupted by introns, making amplification difficult or unpredictable. •For animals, a 658 base-pair fragment of the mitochondrial gene, cytochrome oxidase subunit I (mtCOI) – consensus for iBOL consortium; 18S rDNA – Nematoda etc. •For plants, mitochondrial genes do not differ sufficiently to distinguish among closely related species. Promising markers are genes on cpDNA: matK and rbcL •For bacteria, a 16S-rDNA emerges as very useful marker (especially when using next-generation sequencing) • •For particular taxonomic groups, also other barcodes are widely used, e.g. cytochrome b for mammals Focus to date human chimp anopheles pip 26dec2004 •Cytochrome c oxidase I (COI or CoxI) contains differences representative of those in other protein-coding genes • •Possible gains in accuracy or cost using a different protein-coding gene would likely be small. •„barcoding gap“ What do barcode differences among and within animal species studied so far suggest? •barcodes identify most animal species unambiguously •approximately 2-5% of recognized species have shared barcodes with closely-related species - many of them hybridize regularly •in all groups studied so far, distinct barcode clusters with biologic co-variation suggest cryptic species intra inter 28dec2004 •Barcoding North American birds Tak co třeba znamená toto? Barcoding Hominidae2 Barcodes affirm the unity of the species Homo sapiens Comparisons show we differ from one another by only 1 or 2 nucleotides out of 648, while we differ from chimpanzees at 60 locations and gorillas at 70 locations. •A barcoder? 1.Metagenomika/metatranskriptomika -celé společenstvo půdních, vodních mikroorganismů, střevní mikroflóra -PCR genu 16S (18S) rRNA -lze i kvantifikovat 2. Složení potravy (COI barcoding) -COI barcoding (masožravci) -cpDNA (býložravci) Next generation sequencing of amplicons • • http://www.massgenomics.org/wp-content/uploads/2010/03/ion-torrent-sequencer-300x235.jpg •3. Analýza kontaminovaných vzorků •A barcoder? ... COMING SOON •What isn’t DNA Barcoding? •it is not intended to, in any way, supplant or invalidate existing taxonomic practice •it is not DNA taxonomy; it does not equate species identity, formally or informally, with a particular DNA sequence •it is not intended to duplicate or compete with efforts to resolve deep phylogeny (e.g., Assembling the Tree of Life, ATOL) Fly Didemnum Xmas_worm2 Fish2 What are the main limits to barcoding encountered so far? •horizontal gene transfer •gene tree vs. species tree •nuclear pseudogenes •hybrids – mtDNA introgression 1. Horizontal gene transfer File:Wolbachia.png •Wolbachia within an insect cell •(25-70% druhů hmyzu) http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/fa/Protocalliphora.azurea.-.lindsey.jpg Výsledky jaderné a mitochondriální DNA si neodpovídají •Horizontální přenos mtDNA přes Wolbachia •(většinou mezi blízce příbuznými druhy, na úrovni rodů je barcoding OK) •AFLP •mtDNA •Ellipses = candidates for horizontal gene transfer •Symboly vpravo odpovídají typu Wolbachia infekce 2. Gene tree vs. species tree •Jeden gen (navíc mitochondriální) není (někdy) dostatečný pro definici druhu https://www.math.duke.edu/mathbio/images/geneTreesInSpeciesTree.jpg http://2.bp.blogspot.com/-2Zby6vL-3SQ/TmpxkW6VECI/AAAAAAAABcs/GdsqmH7MTrQ/s400/Hemiplazie.gif •Time to fix the polymorphisms = 2 Ne generations •Incomplete lineage sorting •Problems of species identification in young species • •Difficult to distinghuish from the gene flow (hybridization) Statistical species delimitation •*BEAST •(species trees) BEAST •BPP and iBPP 3. Pseudogenes •Heterozygotes in mtDNA → be careful! • •NUMTS = „nuclear copy of mtDNA sequences • •Relatively often for cytochrome b •How to recognize numt? • •- ultracentrifugation (fresh samples required) •- the use of tissues with high proportion of mitochondria (e.g. muscles) •- long-range PCR (or sequence complete mtDNA) •- RT-PCR (pseudogenes are not transcribed) •- indels, stop codons • •- cloning •cryptic numts •number of suggested barcoded taxa based on 3% divergence on COI with/without numts (identified by stop-codons and indels) Heteroplasmy http://www.mitochondrialncg.nhs.uk/images/3.jpg -well studied mitochondrial disorders in human -low Ne of mtDNA → usually fast fixation of new mutations – mitochondrial bottleneck - •paternal leakage Paternal leakage •allele-specific real-time quantitative PCR (RT-qPCR) → heteroplasmie je asi častý jev •14 % jedinců, ale velmi nízká frekvence druhého haplotypu •paternal leakage 6 % 4. Introgression of mtDNA •Berthier et al. 2006 •Myotis myotis - Evropa •Myotis blythii - Asie http://www.naturfoto.cz/fotografie/andera/netopyr-velky-xxx4242.jpg http://zmmu.msu.ru/bats/rusbats/pictures/mblythi2.jpg Příklad: Myotis blythii vs. Myotis myotis - introgrese mtDNA •M. myotis - Evropa •M. blythii - Asie •samec Příklad: Myotis blythii vs. Myotis myotis - introgrese mtDNA •M. myotis - Evropa •M. blythii - Asie •Tendence ke zpětnému křížení se samci M. blythii vedla k nárůstu proporce genomu M. blythii v Evropě •Kolonizující (invazní) druh „ukradne“ mtDNA původnímu druhu (Currat et al. 2008) •samec MLtree •98/99/1.00 •70/-/- •94/100/1.00 •100/100/1.00 •96/96/1.00 •-/97/- •66/77/0.95 •89/93/1.00 • • •A •B •C2 •C1 •D Příklad: Praomys cf. daltoni complex •How many species? • •Čtyři podle mtDNA genotypu – cca 7% divergence (cyt b)? •Dva druhy podle fenotypu? C:\Documents and Settings\Pepa Bryja\Local Settings\Temporary Internet Files\Content.IE5\1VH7BA5N\MCAN04317_0000[1].wmf C:\Documents and Settings\Pepa Bryja\Local Settings\Temporary Internet Files\Content.IE5\1VH7BA5N\MCAN04317_0000[1].wmf C:\Documents and Settings\Pepa Bryja\Local Settings\Temporary Internet Files\Content.IE5\1VH7BA5N\MCAN04317_0000[1].wmf C:\Documents and Settings\Pepa Bryja\Local Settings\Temporary Internet Files\Content.IE5\1VH7BA5N\MCAN04317_0000[1].wmf C:\Documents and Settings\Pepa Bryja\Local Settings\Temporary Internet Files\Content.IE5\1VH7BA5N\MCAN04317_0000[1].wmf DSC_5869 C:\Documents and Settings\Pepa Bryja\Local Settings\Temporary Internet Files\Content.IE5\1VH7BA5N\MCAN04317_0000[1].wmf C:\Documents and Settings\Pepa Bryja\Local Settings\Temporary Internet Files\Content.IE5\1VH7BA5N\MCAN04317_0000[1].wmf •daltoni - parafyletický •derooi - synantropní Fig. 2: Phylogenetic relationships between haplotypes recovered by maximum likelihood (ML) analysis. Main clades are identified on the right border; broad lines separate presumed species.The numbers above branches represent ML and neighbour joining (NJ) bootstrap support, and Bayesian posterior probability, respectively. See text and Table 1 for more details on localities and haplotypes. NOT CORRECTED !!! Fig 1 zaklad.tif • 48 •51 • 41 •7 • 37 •12 • 17 •13 • 20 •27 • 19 • 21 • 31 •8 • 35 • 26 •16 •24 •11 • 30 •33 •38 • 29 • 34 • 1 • 49 •44 • 50 • 46 • 40 •3 •2 • 6 • 47 • 43 • 45 • 39 • 42 •67 •71 • 61 • 68 • 55 • 54 • 57 • 56 • 53 • 32 • 10 • 23 •15 •60 • 63 •58 •18 • 70 • 66 • 62 •65 •64 • 82 • 83 • 86 • 72 • 75 • 88 • 84 • 73 • 77 • 85 • 78 • 74 • 80 • 91 • 4 •Senegal river •Niger river •Volta river • 79 • 89 • 90 • •Clade B •Clade A •Clade D •Clade C1 •Clade C2 •SENEGAL •GUINEA •MALI •BURKINA •FASO •GHANA •BENIN •TOGO •IVORY •COAST •NIGER •NIGERIA •CAMEROON •69 • 36 • 14 •25 •9 •5 •59 • 81 • 76 • 87 • 52 •22 • 28 C:\Documents and Settings\Pepa Bryja\Local Settings\Temporary Internet Files\Content.IE5\1VH7BA5N\MCAN04317_0000[1].wmf C:\Documents and Settings\Pepa Bryja\Local Settings\Temporary Internet Files\Content.IE5\1VH7BA5N\MCAN04317_0000[1].wmf C:\Documents and Settings\Pepa Bryja\Local Settings\Temporary Internet Files\Content.IE5\1VH7BA5N\MCAN04317_0000[1].wmf C:\Documents and Settings\Pepa Bryja\Local Settings\Temporary Internet Files\Content.IE5\1VH7BA5N\MCAN04317_0000[1].wmf C:\Documents and Settings\Pepa Bryja\Local Settings\Temporary Internet Files\Content.IE5\1VH7BA5N\MCAN04317_0000[1].wmf Phylogeographic structure at mtDNA •Dahomey gap Fig. 1: Map of sampling points showing the distribution of principal phylogenetic clades identified on the basis of mtDNA analyses. Different symbols represent populations belonging to different clades: clade A (black triangles), clade B (dark purple circle), clade C1 (green triangles), clade C2 (yellow squares), and clade D (red circles). Numbers indicate collection sites. See Table 1 for description of haplotypes occurring at different localities. Rivers mentioned in the text are shown in blue. The presumed distribution of mtDNA clades is marked by dashed lines of particular colours. Partial mtDNA introgression in Dahomey gap Fig 1 zaklad.tif • 48 •51 • 41 •7 • 37 •12 • 17 •13 • 20 •27 • 19 • 21 • 31 •8 • 35 • 26 •16 •24 •11 • 30 •33 •38 • 29 • 34 • 1 • 49 •44 • 50 • 46 • 40 •3 •2 • 6 • 47 • 43 • 45 • 39 • 42 •67 •71 • 61 • 68 • 55 • 54 • 57 • 56 • 53 • 32 • 10 • 23 •15 •60 • 63 •58 •18 • 70 • 66 • 62 •65 •64 • 82 • 83 • 86 • 72 • 75 • 88 • 84 • 73 • 77 • 85 • 78 • 74 • 80 • 91 • 4 •Senegal river •Niger river •Volta river • 79 • 89 • 90 • •Clade B •Clade A •Clade D •Clade C1 •SENEGAL •GUINEA •MALI •BURKINA •FASO •GHANA •BENIN •TOGO •IVORY •COAST •NIGER •NIGERIA •CAMEROON •69 • 36 • 14 •25 •9 •5 •59 • 81 • 76 • 87 • 52 •22 • 28 What is species??? Fig. 1: Map of sampling points showing the distribution of principal phylogenetic clades identified on the basis of mtDNA analyses. Different symbols represent populations belonging to different clades: clade A (black triangles), clade B (dark purple circle), clade C1 (green triangles), clade C2 (yellow squares), and clade D (red circles). Numbers indicate collection sites. See Table 1 for description of haplotypes occurring at different localities. Rivers mentioned in the text are shown in blue. The presumed distribution of mtDNA clades is marked by dashed lines of particular colours. Fig 1 zaklad.tif • 48 •51 • 41 •7 • 37 •12 • 17 •13 • 20 •27 • 19 • 21 • 31 •8 • 35 • 26 •16 •24 •11 • 30 •33 •38 • 29 • 34 • 1 • 49 •44 • 50 • 46 • 40 •3 •2 • 6 • 47 • 43 • 45 • 39 • 42 •67 •71 • 61 • 68 • 55 • 54 • 57 • 56 • 53 • 32 • 10 • 23 •15 •60 • 63 •58 •18 • 70 • 66 • 62 •65 •64 • 82 • 83 • 86 • 72 • 75 • 88 • 84 • 73 • 77 • 85 • 78 • 74 • 80 • 91 • 4 •Senegal river •Niger river •Volta river • 79 • 89 • 90 • •Clade B •Clade A •Clade D •Clade C1 •SENEGAL •GUINEA •MALI •BURKINA •FASO •GHANA •BENIN •TOGO •IVORY •COAST •NIGER •NIGERIA •CAMEROON •69 • 36 • 14 •25 •9 •5 •59 • 81 • 76 • 87 • 52 •22 • 28 Morphology and ecology Fig. 1: Map of sampling points showing the distribution of principal phylogenetic clades identified on the basis of mtDNA analyses. Different symbols represent populations belonging to different clades: clade A (black triangles), clade B (dark purple circle), clade C1 (green triangles), clade C2 (yellow squares), and clade D (red circles). Numbers indicate collection sites. See Table 1 for description of haplotypes occurring at different localities. Rivers mentioned in the text are shown in blue. The presumed distribution of mtDNA clades is marked by dashed lines of particular colours. Fig 1 zaklad.tif • 48 •51 • 41 •7 • 37 •12 • 17 •13 • 20 •27 • 19 • 21 • 31 •8 • 35 • 26 •16 •24 •11 • 30 •33 •38 • 29 • 34 • 1 • 49 •44 • 50 • 46 • 40 •3 •2 • 6 • 47 • 43 • 45 • 39 • 42 •67 •71 • 61 • 68 • 55 • 54 • 57 • 56 • 53 • 32 • 10 • 23 •15 •60 • 63 •58 •18 • 70 • 66 • 62 •65 •64 • 82 • 83 • 86 • 72 • 75 • 88 • 84 • 73 • 77 • 85 • 78 • 74 • 80 • 91 • 4 •Senegal river •Niger river •Volta river • 79 • 89 • 90 • •Clade B •Clade A •Clade D •Clade C1 •SENEGAL •GUINEA •MALI •BURKINA •FASO •GHANA •BENIN •TOGO •IVORY •COAST •NIGER •NIGERIA •CAMEROON •69 • 36 • 14 •25 •9 •5 •59 • 81 • 76 • 87 • 52 •22 • 28 •Karyotypes Fig. 1: Map of sampling points showing the distribution of principal phylogenetic clades identified on the basis of mtDNA analyses. Different symbols represent populations belonging to different clades: clade A (black triangles), clade B (dark purple circle), clade C1 (green triangles), clade C2 (yellow squares), and clade D (red circles). Numbers indicate collection sites. See Table 1 for description of haplotypes occurring at different localities. Rivers mentioned in the text are shown in blue. The presumed distribution of mtDNA clades is marked by dashed lines of particular colours. Fig 1 zaklad.tif • 48 •51 • 41 •7 • 37 •12 • 17 •13 • 20 •27 • 19 • 21 • 31 •8 • 35 • 26 •16 •24 •11 • 30 •33 •38 • 29 • 34 • 1 • 49 •44 • 50 • 46 • 40 •3 •2 • 6 • 47 • 43 • 45 • 39 • 42 •67 •71 • 61 • 68 • 55 • 54 • 57 • 56 • 53 • 32 • 10 • 23 •15 •60 • 63 •58 •18 • 70 • 66 • 62 •65 •64 • 82 • 83 • 86 • 72 • 75 • 88 • 84 • 73 • 77 • 85 • 78 • 74 • 80 • 91 • 4 •Senegal river •Niger river •Volta river • 79 • 89 • 90 • •Clade B •Clade A •Clade D •Clade C1 •SENEGAL •GUINEA •MALI •BURKINA •FASO •GHANA •BENIN •TOGO •IVORY •COAST •NIGER •NIGERIA •CAMEROON •69 • 36 • 14 •25 •9 •5 •59 • 81 • 76 • 87 • 52 •22 • 28 Mitochondrial DNA + microsatellites in Benin + karyotypes Fig. 1: Map of sampling points showing the distribution of principal phylogenetic clades identified on the basis of mtDNA analyses. Different symbols represent populations belonging to different clades: clade A (black triangles), clade B (dark purple circle), clade C1 (green triangles), clade C2 (yellow squares), and clade D (red circles). Numbers indicate collection sites. See Table 1 for description of haplotypes occurring at different localities. Rivers mentioned in the text are shown in blue. The presumed distribution of mtDNA clades is marked by dashed lines of particular colours. Fig 1 zaklad.tif • 48 •51 • 41 •7 • 37 •12 • 17 •13 • 20 •27 • 19 • 21 • 31 •8 • 35 • 26 •16 •24 •11 • 30 •33 •38 • 29 • 34 • 1 • 49 •44 • 50 • 46 • 40 •3 •2 • 6 • 47 • 43 • 45 • 39 • 42 •67 •71 • 61 • 68 • 55 • 54 • 57 • 56 • 53 • 32 • 10 • 23 •15 •60 • 63 •58 •18 • 70 • 66 • 62 •65 •64 • 82 • 83 • 86 • 72 • 75 • 88 • 84 • 73 • 77 • 85 • 78 • 74 • 80 • 91 • 4 •Senegal river •Niger river •Volta river • 79 • 89 • 90 • •Clade B •Clade A •Clade D •Clade C1 •SENEGAL •GUINEA •MALI •BURKINA •FASO •GHANA •BENIN •TOGO •IVORY •COAST •NIGER •NIGERIA •CAMEROON •69 • 36 • 14 •25 •9 •5 •59 • 81 • 76 • 87 • 52 •22 • 28 •Splitting approach taking morphology and ecology into account – the reproductive barriers between clades A, B, C1, and D remains to be identified Fig. 1: Map of sampling points showing the distribution of principal phylogenetic clades identified on the basis of mtDNA analyses. Different symbols represent populations belonging to different clades: clade A (black triangles), clade B (dark purple circle), clade C1 (green triangles), clade C2 (yellow squares), and clade D (red circles). Numbers indicate collection sites. See Table 1 for description of haplotypes occurring at different localities. Rivers mentioned in the text are shown in blue. The presumed distribution of mtDNA clades is marked by dashed lines of particular colours. Identifikace jedinců DNA fingerprinting (DNA profiling) Identifikace jedinců – kdy? •většinou když jedince nevidíme (příp. u zpětných odchytů, když chybí značka) • •neinvazivní genetika – skrytá zvířata, vzorky trusu, moči, chlupů atd. – dá se spojit např. s individuální variabilitou potravy • •forenzní genetika – identifikace DNA v živočišných produktech, pytláctví, atd. • •druhová ochrana – např. sokolnictví (potvrzení rodičovství) apod. Identifikace jedince – unikátní multilokusový genotyp •minisatelitový fingerprinting - velké množství kvalitní DNA, technická náročnost + univerzalita • •AFLP - kvalitní nedegradovaná DNA + univerzalita • •Mikrosatelity + stačí malé množství nekvalitní DNA, optimální pro neinvazivní přístupy - je nutné znát konkrétní lokusy a sekvence specifických primerů • •SNPs + velké množství znaků v genomu - malá variabilita, je potřeba hodně lokusů, nutno znát konkrétní lokusy http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c5/Alec_Jeffreys_-2008.jpg/200px-Alec_Jeffrey s_-2008.jpg •Alec Jeffreys, the pioneer of DNA profiling Mikrosatelity •Tandemová opakování krátkých motivů • •Izolace DNA • •PCR • •Detekce → sekvenátor, fragmentační analýza •CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT •CTTTCTTTCTTTCTTTC •CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT •CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT tools_1a 3LOKCELE • • •detektor •laserový paprsek Individual human identification https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/prodImages/high/4473287_and_4473289_FINAL650x600.jpg http://www.cstl.nist.gov/strbase/kits/Identifiler.JPG http://www.bodetech.com/wp-content/uploads/2011/01/analyze-the-samples.png •16 loci = reliable individual identification •(Euro-American population) Identifikace jedinců závisí na stupni polymorfismu •multilocus microsatellite fingerprinting – power estimated as „probability of identity“ (P(ID)) (Waits et al. 2001) – např. program GenAlex • •Number of loci (H=0.6) •Random •Sibs •pilot studies with tissue samples are required to identify P(ID) in a population studied by e.g. non-invasive methods Medvědi v Pyrenejích Taberlet et al. 1997 •Trus a chlupy • •24 mikrosatelitových lokusů • •4 samci a jedna samice s unikátními multilokusovými genotypy (o jednoho víc než podle stop a fotografií) • •Multiple-tube approach, mnohonásobné opakování PCR reakcí Analýza prostorové aktivity •P. Hájková – PhD thesis • vydra_snezna Identified individuals - Hornád, NP Slovenský Raj mapa_komplet_orezana • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •SR 1 • •SR 2 • •SR 3 • •SR 4 • •SR 5 • •SR 6 • •SR 7 • •SR 8 • •SR 9 • SR 10 •1 km • vydra1 vysek02 kopie_orezana •Ind. SR 3 otter_otocena_hneda • • • • • •5. 4. 2003 • • • • • • • • •4. 11. 2003 • • • • • • • • • • •10. 11. 2003 • • • • • 11. 11. 2003 • • •30. 12. 2003 •500 m •Hornad •Spatial activity in mountain habitat Human forensic genetics •Pozůstatky vojáků z války Vietnam a Korea Identifikace na základě mtDNA příbuzných osob (lze jen někdy) V současnosti: vzorek DNA (krve) při odvodu, jiné markery Armed Forces Repository of Specimen Samples for the Identification of Remains • •Soudní pře Clinton-Lewinská Pozůstatky ruského cara Nikolaje II •Kriminalistika • •Oběti tragických událostí • • • 461921_Clinton_Lewinski News Czar-Nicholas-II- Klony Bambus Sasa senanensis •Suyama et al. 2000 • •Plocha 10 hektarů • •AFLP • •22 klonů • •Klon na ploše 300 m v průměru s_senanensis_M Slavní klonální bezobratlí •Rotifera – Bdelloidea • •Ostracoda (Darwinula) • •Partenogenetické klony vysokého stáří (milióny let) • • •Darwinula stevensoni •organismy složené z buněk s různými genotypy • •Dictyostelium discoideum chimérismus je pravidelná součást života Genetické chiméry Genetické chiméry •Ficus srůst kořenů různých jedinců • •sumky Botryllus schlosseri chimérické kolonie příbuzní jedinci • •Diplosoma listerianum i nepříbuzní Celleporella hyalina (Bryozoa) Hughes et al. 2004 •Pravděpodobnost fůze koreluje s příbuzností • •Histokompatibilita • •Lepší rozpoznávání v pokročilejších fázích → dozrávání imunokompetence • •Speciální proteiny (spongikany...) Ceratioid anglerfish File:Representatives of ceratioid families.jpg •miniaturní samec po narození vyhledá samici, její kůže vyloučí hydrolytický enzym a samec přiroste • •vzniká hermafroditická chiméra Genetické chiméry – „microchimerism“ •kosman bělovousý Callithrix jacchus (asi i rod Saguinus) • •dizygotická dvojčata • •DNA fingerprinting krve - hematopoietické chiméry • •během embryonálního vývoje vzájemná výměna buněk kostní dřeně • •týká se to asi jen krve (neinvazivní metody – chlupy, trus → jeden genotyp) • •průnik embryonálních erytroblastů a volné DNA přes placentu i u člověka • •(pohlaví dítěte před narozením lze určit i pomocí PCR sekvencí typických pro Chr Y, jako templát je periferní krev matky) • title07-01 sagui_de_tufos_brancos Canine transmissible venereal tumor (CTVT) Devil facial tumour disease -parasitic cancer -„single cell parasitic wolf“ Známé „lidské chiméry“ - geneticky nepotvrzené mateřství - chiméra matky Foekje Dillema.jpg •46XX/46XY woman • - holandská atletka, mistryně na 100 a 200 m - odmítla test na pohlaví - mozaika zjištěna až posmrtně (v r. 2007) •Foekje Dillema Identifikace pohlaví DNA sexing Genetická identifikace pohlaví - proč 1)druhy s nevýrazným pohlavním dimorfismem (ptáci, ale i řada savců) 2)zárodky v ranném stádiu ontogeneze (embrya, larvy) 3)neinvazivní metody (trus, skořápky, šupiny) 4) Genetická identifikace pohlaví •druhy s genetickou determinací pohlaví (tj. nejčastěji pohlavní chromozómy) •ptáci (♂=ZZ, ♀=ZW) •savci (♂=XY, ♀=XX) •amplifikace DNA oblasti specifické pro heterogametické pohlaví •W, Y – malé chromozómy http://www.nature.com/scitable/content/18935/pierce_4_10_large_2.jpg Určení pohlaví – ptáci Griffith et al. 1998 •CHD1W a CHD1Z, geny na pohlavních chromosomech (chromobox-helicase-DNA-binding gene (CHD) – Griffiths & Tiwari 1995) • •Primery amplifikují introny obou genů • •Introny se mohou lišit délkou • •Existují už tři možnosti běžně používaných primerů • •Problematické druhy Struthioniformes • •♂ •♂ •♂ •♂ •♀ •♀ •♀ ostrich Manorina melanocephala (Meliphagidae) Arnold et al. 2001 •Synové fungují jako pomocníci • •U adultů 2,31 samců na 1 samici • •Mláďata v hnízdě poměr pohlaví 1:1 (57:57) • •První se líhnou samci (v 17 hnízdech z 18) Při opouštění hnízda jsou větší a těžší • • OW_NoisyMinerThumbnail •medosavka hlučná Určení pohlaví - savci •Amplifikace genu na Chr Y (Sry) (nejlépe duplex PCR s genem na X nebo autosomech) • • •Microtus cabrerae Sry na Chr X Ellobius, Tokudaia Sry zcela chybí •Nannomys • Velká variabilita • • •Bryja a Konečný 2003 •Ellobius •Tokudaia osimensis •M. cabrerae DSC_5565 •Nannomys Určení pohlaví - savci •Amplifikace genu na Chr Y (Sry) (nejlépe duplex PCR s genem na X nebo autosomech) • • • • •Analýzy z trusu: nutno používat druhově specifické markery (jinak cross-amplification s druhy tvořícími potravu) bear3 odocoileus •x •Murphy et al. 2003 •Bryja a Konečný 2003 Určení pohlaví – jiné skupiny •Chr Y občas i u rostlin Rumex • •Plazi Calotes versicolor Sry má i 50% samic! • •Hledání markerů pomocí nespecifických metod (RAPD, AFLP) aflp-gel_01 image002 Calotes_versicolor400