Makroskopické pozorování mikroorganizmů, Gramovo barvení Očkování kultur, sterilita práce •Sterilita vs kontaminace? •Misky – jednotlivé kolonie? •Misky – mix - jednotlivé kolonie? •Šikmý agar (uchovávání) •Bujón – zákal, blanka povrchvé útvary (mázdra)? • Tvary kolonií •Velikost (průměr; mm) •Tvar – kolonie pravidelná kulatá, oválná, nepravidelně laločnatá, vláknitá, rhizoidní, plazící se •Profil – kolonie vyvýšená, plochá, pupkovitá,miskovitá … •Okraje – pravidelné, filiformní, laločnaté, okrouhlé … •Povrch – hladký, lesklý (S – fáze), matný, drsný (R- fáze), •Transparence – průhledná, průsvitná, neprůsvitná kolonie •Barva - kolonie bezbarvá, či pigmentovaná: našedlá, bělavá, žlutá … Další znaky popisované na bakteriální kolonii: Vůně, zápach – po jasmínu, žluklém másle, ovocný … Tvorba mycelia Změny media – dvorec zbarvení, hemolýzy, precipitátu Konzistence – zjišťuje se bakteriální kličkou (viskózní, mazlavá, drobivá, zarůstá do agaru) Při správně provedeném křížovém roztěru můžeme pozorovat na plotně jednotlivé kolonie. Hodnotime jejich barvu, tvar, profil a okraje… Mikroskopické preparáty •Nativní preparát •Nefixovaný, nebarvený • •zjišťování skutečného tvaru a struktury buněk neporušených fixací a barvením •při pozorování růstu a množení, pohybu bakterií •v diagnostické praxi má význam při studiu buněčných útvarů, které se obtížně barví • • Barvené preparáty • •Barvivem zvýrazníme tvar buňky • •či zjistíme, zda je živá (vitální test) • •struktury rozlišujeme diferenciačním barvením a to jak morfologické útvary (spory, membrány, buněčná stěna), tak chemické složky (barvení volutinu, glykogenu, škrobu.) • • diagnostické barvení pak pomáhá identifikaci (Gramovo, acidorezistentní) • Fixování preparátu •Podstatou fixace je vysrážení buněčných koloidů (zejména bílkovin) • •Fixací nátěru buněk dosáhneme toho, že lépe přilnou ke sklíčku (nespláchnou se tak aplikací barviva či rozpouštědla) a rovněž lépe přijmou barvivo • •Fixujeme až ve chvíli, kdy je nátěr buněk suchý - sklíčko držíme za okraje a třikrát jej protáhneme nesvítivou částí plamene • •Sklíčko držíme nátěrem nahoru (proto je doporučeno pracovní plochu sklíčka po vytažení z ethanolu označit štítkem či popsat) • •Barvíme chladné sklíčko • •Kvasinky a plísně jsou větší než buňky bakterií a tepelná fixace již příliš mění jejich (většinou se fixují chemikáliemi) • • Gramovo barvení •je jednou z nejdůležitějších diagnostických metod při identifikaci bakterií •rozlišuje skupinu grampozitivních G+ (barví se modrofialově) • gramnegativních G- buněk (barví se červenorůžově) a udává některé fyziologické a chemické vlastnosti buňky Princip: • •jde o barvení fixovaného preparátu krystalovou violetí a následné moření buněk jódem v roztoku KI • •Vzniká komplex barvivo-jód-buněčná stěna • • Tento komplex se tvoří v G+ i v G- bakteriích • • Rozdíl vzniká při promývání preparátu organickým rozpouštědlem (acetonem nebo alkoholem) • •Z G- bakterií se komplex vymývá a odbarvují se • • G+ bakterie si zbarvení ponechávají • •Pro zvýraznění rozdílu se G- bakterie dobarvují jiným kontrastním barvivem (např. bazickým safraninem) • •U gramnegativních buněk odbarvovací činidlo rozpustí vnější lipopolysacharidovou vrstvu a komplex krystalové violeti s jódem se vymyje přes tenkou vrstvu peptidoglykanu • •Nejčastější chyby: • • příliš silný nátěr buněk na sklíčku • sušení plamenem nedostatečně suchého preparátu - tj. uvaření buněk • příliš dlouhé odbarvování alkoholem nebo acetonem • • G- G+ •suspenzi z kultury mikrobů rozetřeme na čisté podložní sklíčko (označíme stranu sklíčka) necháme dobře zaschnout a fixujeme plamenem •ponoříme do roztoku krystalové violeti a necháme působit 30 sekund •barvivo opláchneme slabým proudem vody (2s) •preparát ponoříme do Lugolova roztoku na 30 sekund. •opláchneme slabým proudem vody (2s) •překryjeme ethanolem (nebo acetonem), maximálně 15-20 sekund •opláchneme slabým proudem vody • buňky dobarvíme safraninem 1 minutu (takto se dobarví pouze buňky gramnegativní, u kterých došlo k vyplavení krystalové violeti •osušíme mezi dvěma filtračními papíry a mikroskopujeme pod imerzním objektivem (zvětšení 1000x) Postup: DĚKUJI ZA POZORNOST