Bi3390c Lékařská mykologie - cvičení Obsah: 1. Nativní preparát 2. Izolace kvasinek stěrem z dutiny ústní 3. Identifikace kvasinek I. Mikroskopický průkaz · Gramovo barvení · Germ tube test · Negativní barvení nigrosinem II. Kultivační průkaz · Průkaz Cryptococcus neoformans na Bird seed agaru · Mikromorfologie na kukuřičném agaru · Agar podle Nickersona pro izolaci a identifikaci kvasinek rodu Candida III. Biochemický průkaz · Asimilace cukrů · Fermentace cukrů 4. Identifikace vláknitých hub rodu Aspergillus 5. Příprava mikrokultury (sklíčkové kultury) 6. Vlasový perforační test 7. Stanovení celkového počtu směsné populace plísní v ovzduší vnitřního prostředí sedimentační metodou 1. Nativní preparát: Mikroskopické morfologické znaky vláknitých hub sledujeme v nativním preparátu. Pro krátkodobé pozorování se jako uzavírací médium používá voda. Pro dlouhodobější sledování používáme pomalu vysychající kapaliny např. 10 až 20 % roztok glycerolu. Místo glycerolu lze použít i roztok laktofenolu nebo kyselinu mléčnou. Materiál: kultury vláknitých hub Pomůcky: podložní a krycí sklo, preparační jehla, kyselina mléčná, mikroskop Pracovní postup: 1. Na podložní sklo naneseme kapku kyseliny mléčné. 2. Sterilní preparační jehlou přeneseme z kolonie mikromycety malé množství mycelia s fruktifikačními orgány do kapky kyseliny mléčné (nejlépe dvěma preparačními jehlami). U kultur silně sporulujících odebíráme mycelium na rozhraní mezi zbarvenou částí kolonie a bílým okrajem, aby v preparátu nebylo příliš mnoho konidií. Mycelium neroztíráme, abychom nepoškodili fruktifikační orgány – pouze jehlami uvolníme jednotlivá vlákna do kapaliny. 3. Opatrně přikryjeme krycím sklem (nepřitiskujeme!) a přebytečnou kapalinu odsajeme ze strany filtračním papírem. 4. Preparát bez další úpravy prohlížíme suchým objektivem, nejprve slabým zvětšením (objektiv 10x), postupně pak silnějším zvětšením (objektiv 40x a 100x) u hyalinních mikromycet s fázovým kontrastem Sledujeme: · charakter mycelia (šířku vláken, barvu a strukturu mycelia, přepážky (septa) – přítomnost a rozložení, způsob větvení) · charakter, způsob tvoření (konidiogeneze) a uspořádání fruktifikačních orgánů (např. sporangiofory, konidiofory, sporangia, kolumela, fialidy, konidie, zygospory, askospory aj.) · přítomnost a charakter jiných útvarů (chlamydospory). Hodnocení: Popište struktury viditelné pod mikroskopem u jednotlivých kultur 2. Izolace kvasinek stěrem z dutiny ústní Materiál: stěr z dutiny ústní Pomůcky: sterilní vatové tampóny, Sabouraudův agar s glukózou a chloramfenikolem (SAB), krevní agar (KA) a agar dle Nickersona, očkovací klička, termostat na 30°C a 37°C Pracovní postup: 1. Sterilním vatovým tamponem provedeme krouživým pohybem stěry z dutiny ústní. 2. Provedeme křížový roztěr stěru na KA, SAB s chloramfenikolem a agar dle Nickersona. 3. Kultivujeme ve tmě, KA při teplotě 37 °C, SAB s chloramfenikolem a agar dle Nickersona při teplotě 30 °C po dobu 24 - 48 hodin. 4. V případě růstu kolonií zhotovíme preparát barvený podle Grama a kulturu kvasinky naočkujeme krátkým řezem do středu tenké vrstvy kukuřičného agaru. Sabouraudův agar Sabouraudův agar s 2% glukózy příp. dextrózy je univerzální kultivační půdou pro záchyt patogenních i nepatogenních mikromycet, zejména dermatofytů a kvasinek. Původní recept obsahoval 4% glukózy. Použití pouze 2% glukózy omezuje rychlost přechodu kultury do pleomorfního stavu, kdy obsahuje pouze vlákna bez diagnosticky cenných reprodukčních struktur. 3. Identifikace kvasinek Kultivační průkaz I. morfologie na agaru s rýžovým extraktem nebo kukuřičném agaru II. Bird Seed Agar III. agar podle Nickersona IV. agar pro důkaz tvorby pouzdrového polysacharidu Mikroskopický průkaz V. Germ tube test VI. Gramovo barvení VII. negativní barvení nigrosinem Biochemický průkaz VIII. asimilace cukrů IX. fermentace cukrů Kultivační průkaz I. Mikromorfologie na agaru s kukuřičným extraktem: Rýžový agar stejně jako kukuřičný agar poskytuje vhodné podmínky pro růst Candida spp. na kterém tvoří chlamydospory společně s druhem C. dubliniensis. Pomůcky: kultura kvasinky Candida albicans CCM 8215 nebo vlastní izolát, Petriho miska s rýžovým agarem, sterilní krycí skla, preparační jehla, pinzeta sterilizovaná vypálením, termostat, světelný mikroskop Pracovní postup: 1. Kulturu kvasinky naočkujeme krátkým řezem do středu tenké vrstvy agaru. 2. Přikryjeme sterilním krycím sklem. 3. Kultivujeme 24 – 48 hodin při teplotě 25°C. 4. Poté kulturu prohlížíme přímo na misce pod mikroskopem. Hodnocení: Popište útvary pozorované v mikroskopu. II. Průkaz druhu Cryptococcus neoformans na Bird seed agaru: Bird seed agar je médium pro diferenciaci Cryptococcus neoformans na základě produkce vysoce specifické aktivity fenoloxidázy, vedoucí k tvorbě charakteristického tmavohnědého melaninu, C. albicans tvoří bílé kolonie. Pomůcky: kultura kvasinky Cryptococcus neoformans CCM 8312, Bird Seed Agar (Niger Seed Agar), očkovací klička, termostat Pracovní postup: 1. Kulturu kvasinky naočkujeme křížovým roztěrem. 2. Kultivujeme max. 7 dní při teplotě 30°C. 3. Poté hodnotíme makromorfologii. Hodnocení: Popište morfologii kolonií na agaru. III. Agar podle Nickersona pro izolaci a průkaz kvasinek rodu Candida BiGGY (Bismuth Sulphite Glucose Glycine Yaeast Agar) – agar podle Nickersona využívá schopnosti kvasinek rodu Candida extracelulárně redukovat siřičitan. Schopnost redukovat siřičitan bismutitý obsažený v kyselém nebo neutrálním médiu na sulfid se projeví tvorbou různě zbarvených kolonií. Siřičitan bismutitý zároveň inhibuje případný růst bakterií. Silně redukční schopnosti mají zejména druhy C. albicans, C. krusei, C. tropicalis. Pomůcky: kultury kvasinek, BiGGY agar, očkovací klička (tampon), termostat Pracovní postup: 1. Kulturu kvasinky naočkujeme křížovým roztěrem. 2. Kultivujeme 48 hod. při teplotě 30°C. 3. Poté hodnotíme makromorfologii. Hodnocení: Vzhled kolonií: C. albicans – hladké, kulaté, černohnědé, bez lesku, tmavé zbarvení nedifunduje do okolí C. tropicalis – hladké, tmavě hnědé s černým vyvýšeným středem, kovově lesklé, okolí kolonie hnědočerně zabarvené v důsledku šíření redukujících enzymů do okolí C. krusei – velké, ploché, zvrásněné, hnědočerné, žluté haló Popište morfologii kolonií na agaru a proveďte presumptivní identifikaci kvasinek. IV. Agar pro důkaz tvorby pouzdrového polysacharidu Pomůcky: kultura kvasinky Cryptococcus neoformans CCM 8312, agar pro kultivaci, očkovací klička, termostat, Lugolův roztok Pracovní postup: 1. Kulturu kvasinky naočkujeme hádkem na povrch kultivačního média. 2. Kultivujeme 48 hod. při teplotě 30°C. 3. Povrch nátěru na misce přelijeme Lugolovým roztokem.. Hodnocení: Přítomnost polysacharidu se projeví zmodráním nátěru. Určete, zda kultura Cryptococcus neoformans CCM 8312 tvoří polysacharidová pouzdra. Hodnocení makromorfologie: Barva - bílá, krémová, lososová Textura – hladká, drsná Vzhled – lesklé, matné Povrch kolonie - 1. centrálně pruhovaný (v koncetrických kruzích); 2. radiálně pruhovaný (radiálně zvrásněný) Okraje kolonie - 3. ucelený okraj; 4. lalokovitý okraj; 5. pilovitý okraj; 6. cípovitý okraj; 7. rhizoidní okraj Hodnocení: Popište makromorfologii kultury na SAB Mikroskopicý průkaz Materiál: kultura kvasinek V. Germ tube test: Germ tube test, nebo-li test na přítomnost klíčních hyf, je jedním ze základních identifikačních testů pro identifikaci C. albicans. C. albicans společně s C. dubliniensis jsou jediné kvasinky z rodu Candida, které tvoří tyto klíční hyfy. Materiál: Candida albicans CCM 8215, Candida tropicalis CCM 8223 Pomůcky: zkumavka s bovinním sérem, bakteriologická klička, pipeta, zkumavka se sterilním fyziologickým roztokem, termostat, podložní a krycí sklo, mikroskop Pracovní postup: 1. Připravte slabou suspenzi kvasinek v 0,5 - 1,0 ml sterilního séra , optimální hustota inokula je 10^5 - 10^6 buněk/ml, vyšší koncentrace často vede ke snížení tvorby klíčních hyf a tedy k falešně negativnímu výsledku. 2. Kultivujeme ne déle jak 3 hod. při teplotě 35 - 37°C. 3. Umístíme 1 kapku inokulovaného séra na podložní sklo a zakryjeme krycím sklem, v mikroskopu hodnotíme tvorbu klíčních vláken. Hodnocení: Určete, který ze vzorků je druh Candida albicans. VI. Preparát barvený podle Grama: Umožňuje podrobné pozorování mykotických organizmů při velkých zvětšeních a odlišení bakteriální kontaminace. Pomůcky: podložní skla, kahan, barvící roztoky, očkovací klička, mikroskop, imerzní olej Pracovní postup: 1. Na podložní sklo naneseme kapku sterilní destilované vody. 2. Sterilní kličkou nabereme kulturu a rozmícháme v kapce vody. 3. Preparát usušíme na vzduchu a fixujeme teplem, opakovaným protažením plamenem kahanu. 4. Fixovaný preparát přelijeme krystalovou violetí a necháme působit 30". 5. Opláchneme vodou (zbytek vody důkladně setřepat). 6. Převrstvíme Lugolovým roztokem na 30". 7. Opláchneme vodou (zbytek vody důkladně setřepat). 8. Odbarvujeme 95% etanolem, dokud odchází modrá barva (cca 20 – 30"). 9. Opláchneme vodou (zbytek vody důkladně setřepat). 10. Dobarvíme zředěným roztokem safraninu 1 min. 11. Opláchneme vodou (zbytek vody důkladně setřepat) a necháme oschnout na vzduchu. 12. Preparát prohlížíme imerzním objektivem při zvětšení 1000x a více. Hodnocení: Jak se barví kvasinky? Jak se liší v preparátu kvasinky od bakterií? Popište mikromorfologii kultury v preparátu. VII. Negativní barvení nigrosinem: Metoda spočívá v obarvení pozadí, buňky zůstávají nezbarvené. Používá se ke stanovení pouzder a slizů. Pomůcky: kultura CCM 8312 Cryptococcus neoformans, podložní skla, krycí skla, nigrosin, očkovací klička, mikroskop, imerzní směs Pracovní postup: 1. Klička kultury kvasinky se suspendujeme v kapce vody na podložním sklíčku a přidáme kapku nigrosinu. 2. Hranou druhého podložního skla suspenzi rozetřeme a necháme uschnout na vzduchu. Nefixujeme!!! Hodnocení: Tvoří kultura polysacharidová pouzdra? Biochemický průkaz Materiál: kultury kvasinek VIII. Asimilace cukrů Schopnost využívat za aerobních podmínek cukry jako zdroj energie a materiál pro syntézu buněčné hmoty - cukerný auxanogram. Běžně se sleduje schopnost asimilace glukózy, galaktózy, sacharózy, maltózy, laktózy a rafinózy. Pomůcky: médium pro testování asimilace uhlíku ve zkumavkách po 5 ml, 20% sterilní roztoky testovaných cukrů, pipety, termostat Pracovní postup: 1. Do média pro testování asimilace uhlíku přidáme testované cukry, aby výsledná koncentrace byla 1-2%. 2. Jako kontrolu použijeme medium bez zdroje uhlíku. 3. Kličkou slabě inokulujeme všechny typy medií 4. Zkumavky kultivujeme při 30°C po dobu jednoho týdne. Hodnocení: Zjistíme, ve kterých typech medií kultura roste srovnáním s kontrolou. IX. Fermentace cukrů Schopnost kvasinek zkvašovat některé jednoduché cukry za vzniku etanolu a oxidu uhličitého v anaerobním prostředí - zymogram. Běžně se sleduje schopnost fermentace glukózy, galaktózy, sacharózy, maltózy, laktózy a rafinózy. Pomůcky: médium pro fermentaci cukrů ve zkumavkách po 9 ml s Durmanovou plynovkou, 10% sterilní roztoky testovaných cukrů, pipety, termostat Pracovní postup: 1. Do média pro fermentaci cukrů přidáme testované cukry, aby výsledná koncentrace byla 1%. 2. Masivní kličkou inokulujeme všechny typy medií 3. Zkumavky kultivujeme při 25°C po dobu 5 dnů. Hodnocení: Hodnotíme tvorbu plynu – objeví se v plynovce a tvorbu kyselin – projeví se žlutým zbarvením. Podle výsledné kombinace testů identifikujeme kvasinku. 4. Identifikace vláknitých hub rodu Aspergillus Materiál: Petriho misky s kulturou Pomůcky: preparační jehla, CYA (Czapkův agar s kvasničným extraktem), MEA (Agar se sladovým extraktem), CY20S (Czapkův agar s kvasničným extraktem a 20% sacharózy), termostat Pracovní postup: 1. Povrch příslušných médií inokulujeme konidiemi vláknité houby formou vpichu na třech místech tvořících vrcholy rovnoramenného trojúhelníka (body mají být vzdáleny asi 3 cm od kraje misky). Aby se spory při očkování nerozptýlily po celé půdě, očkujeme misky zespodu, otočené dnem vzhůru. 2. Kultivujeme 7 dnů při teplotě 25 a 37 °C. Schéma inokulace: CYA 37°C MEA 25°C CYA 25°C Hodnocení: po 7 dnech kultivace provedeme vyhodnocení růstu vláknitých hub. Sledujeme: CY20S 25°C znaky makroskopické * rychlost růstu · charakter povrchu kolonií · barvu kolonie · barvu spodní strany kolonie · přítomnost pigmentu difundujícího do agaru · přítomnost a barvu výpotku (exudát) · přítomnost zvláštních útvarů viditelných okem (plodničky, sklerocia, aj.) · charakteristický zápach. V hodnocení vždy uvedeme stáří kultury a použitou kultivační půdu, neboť různé půdy mnohdy modifikují a značně mění charakteristické znaky (jak makroskopické, tak mikroskopické). Čisté kultury připravujeme zpravidla na půdě, na které je popis rodu autorem uveden. znaky mikroskopické Ke zjištění mikroskopických znaků nutných pro identifikaci vláknitých hub potřebujeme kromě mikroskopu i binokulární lupu. Pod lupou prohlédneme větší struktury (charakter mycelia, sklerocií, plodniček apod.), pro studium dalších struktur, na nichž je založena identifikace, připravíme mikroskopický preparát. Jeho příprava a správné posouzení a zhodnocení je mimořádně důležité, neboť morfologické znaky u vláknitých hub jsou základním diagnostickým kritériem při určování rodů a druhů. Identifikace do rodu či druhu na základě makroskopických a mikroskopických morfologických znaků se provádí podle klíčů vypracovaných pro určité taxonomické skupiny. Hodnocení: Vyplňte identifikační protokol Podle identifikačního klíče proveďte identifikaci do rodu. Eurotium chevalieri CCM F-6 Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Eurotiales, Trichocomaceae, Eurotium kleistothecium vřecka askospory s ekvatoriálními prstenci uniseriátní konidiofory konidie 5. Příprava mikrokultury (sklíčkové kultury) Materiál: Petriho misky s kulturou vláknité houby Pomůcky: preparační jehla, Petriho miska s vhodným kultivačním médiem (Malt Extrakt Agar nebo Sabouraudův glukozový agar), sterilní pinzeta, sterilní destilovaná voda, sterilní krycí a podložní skla, sterilní Petriho miska (vlhká komůrka). Pracovní postup: 4. Z tenké vrstvy kultivačního média připravíme bloček o velikosti 1x1 cm. 5. Bloček přeneseme na sterilní podložní sklo umístěné ve vlhké komůrce. 6. Vpichem do čtyř stran naočkujeme kulturu a překryjeme krycím sklem. 7. Kultivujeme 2 – 5 dní při teplotě 25 °C. 8. Průběžně sledujeme růst suchým objektivem při zvětšení 60x – 450x. Hodnocení: Popište struktury viditelné v mikroskopu. 6. Vlasový perforační test Test využívá schopnosti některých druhů perforovat vlas in vitro za vzniku perforačních kanálků. Materiál: kultura vláknité houby Pomůcky: sterilní dětské vlasy (nejlépe blonďaté), sterilní dest. voda, 50 ml 10% kvasničního extraktu, pinzeta, termostat, podložní a krycí sklo, preparační jehla, kyselina mléčná, mikroskop Pracovní postup: 1. Do lahvičky obsahující 10 ml ster. dest. vody přidáme 50 ml 10% kvasničního extraktu a očkovací jehlou přeneseme část mycelia. 2. Kultivujeme při 24 °C 1-3 týdny. 3. Zhotovíme nativní preparát. Hodnocení: Trychophyton interdigitale - přítomnost perforačních kanálků Trychophyton rubrum - perforační kanálky netvoří Na základě mikroskopického nálezu zjistěte, zda se jedná o druh Trychophyton interdigitale. 7. Stanovení celkového počtu směsné populace plísní v ovzduší vnitřního prostředí sedimentační metodou Princip: Sedimentační (gravitační) metoda využívá schopnost mikroorganismů sedimentovat na pevné povrchy. Tato metoda by neměla být používána při hodnocení prostor, které využívají oběhový vzduch. Jedná se o všechny typy klimatizačních zařízení s turbulentním či laminárním prouděním vzduchu. Pokud se využívá pro mikrobiologicko-hygienické hodnocení prostředí tato metoda, mělo by vždy být vyjádřeno i relativní znečištění, tj. provést i stanovení mikroorganismů ve venkovním ovzduší. Pomůcky: 4x Petriho miska s médiem (DRBC – Chloramfenikolový agar s dichloranem a bengálskou červení) o průměru 84 - 90 mm. Pracovní postup: 3. Ve středu místnosti, v inhalační zóně ve výšce 160 cm nad zemí se umístí dvě uzavřené Petriho misky s médiem. Vzdálenost mezi miskami je nejméně 10, maximálně 30 cm. Pro odběry je možno zvolit i jiné místo (nadzemní výška) podle účelu vyšetření. 4. Poté se misky otevřou a osoba, která provádí odběr, opustí interiér. Přítomnost a pohyb dalších osob ve sledovaném interiéru je vyloučen. 5. Dvě Petriho misky s médiem umístíme do venkovního prostředí před objekt nebo z okna 6. Po 1 hodině se Petriho misky uzavřou. 7. Inkubace se provádí při teplotě 25 ± 1 °C po dobu 3-5 dnů. 8. Po inkubaci se spočítají vyrostlé kolonie mikroskopických vláknitých hub. Stanovení relativního znečištění: u/v (koncentrace uvnitř/ koncentrace venku), tj. porovnáním stanovené koncentrace ve vnitřním prostředí s koncentrací ve venkovním ovzduší. Vypočte se aritmetický průměr počtu kolonií z obou Petriho misek. Tento počet se přepočítá na dobu expozice 1 hodina. Výsledek je tedy vyjádřen jako celkový počet plísní, které sedimentovaly na misku za jednu hodinu ve vnitřním prostředí / celkový počet plísní, které sedimentovaly na misku za jednu hodinu ve venkovním prostředí Hodnocení: Pro pobytové místnosti se považují hodnoty 50 KTJ plísní / Petriho misku / hod. za hodnoty, které přibližně odpovídají kategorii znečištění střední dle EUR 14988. Za hygienicky závažné znečištění se považuje hodnota u/v vyšší než 2,0. Hodnota u/v = 2,0 znamená, že koncentrace mikroorganismů je uvnitř objektu dvakrát vyšší než ve venkovním vzduchu. Odhad doby expozice otevřených agarových misek při sedimentační metodě Odběrové místo Doba expozice (hodiny) Prostory se zvýšeným požadavkem na čistotu 4 Prostory s běžnými nároky na kvalitu prostředí 1 Prostory s předpokládaným znečištěním ovzduší bioaerosolem 0,3 - 0,5 Literatura: 1. EUR 14988 (Report No. 12: Biological Particles in Indoor Environments, Commission of the European Communities, Report No. 12, Luxembourg, 1994) 2. Standardní operační postupy pro vyšetřování mikroorganismů v ovzduší a pro hodnocení mikrobiologického znečištění ovzduší ve vnitřním prostředí. Acta hygienica, epidemiologica et microbiologica. Příloha č. 1/2002 Hodnocení: Spočítejte kolonie na Petriho misekách a vypočítejte relativní znečištění. Jaké rody mikromycet byly izolovány? Mikroskopování Říše: FUNGI Pododdělení: MUCOROMYCOTINA Řád: MUCORALES - mnohojaderné coenocytické mycelium, přehrádky se tvoří pro oddělení rozmnožovacích orgánů nebo ve starších myceliích - sporangia vznikají na větvených či nevětvených sporangioforech, jsou většinou mnohosporová (až 1000 spor), u odvozenějších typů vznikají sporangia s malým počtem spor (až jednosporové - nesprávně označované za "konidii") - zygospora vzniká při pohlavním rozmnožování splynutím dvou různých gametangií přepážka - Mucoromycotina Diagram illustrating septum of Oomycota and Zygomycota. Rod Mucor - sporangiofory větvené či nevětvené, bez rhizoidů a stolonů, ukončeny mnohosporovými sporangii bez apofýzy, s kolumelou kulovitou, oválnou nebo hruškovitou Record #3564 Mucor circinelloides CCM 8328 Fungi, Zygomycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae, Mucor sympodiálně větvený circinátní sporangiofory kulovitá kolumela sporangiospory Rod Rhizopus – sporangiofory se tvoří obvykle ve svazcích a nebývají větvené. Vznikají na stolonech (výhoncích), které tvoří velmi často na pevném podkladu rozvětvené, tmavě hnědé rhizoidy. Kolumela má vyvinutou apofýzu (nálevkovité rozšíření sporangioforu pod sporangiem). Po prasknutí sporangiální stěny se kolumela s apofýzou kloboukovitě obrací. Rhizopus stolonifer CCM F-445 Fungi, Zygomycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae, Rhizopus Record #3587 nevětvené sporangiofory s rhizoidy kolumela s apofýzou sporangiospory Record #3547 Rod Lichtheimia Lichtheimia corymbifera CCM 8077 Fungi, Zygomycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae, Lichtheimia větvené sporangiofory kolumela kuželovitá s 1 nebo několika výběžky a apofýzou obří buňky sporangiospory rhizoidy a stolony nezřetelné Zygorhynchus moelleri CCM 8022 - zygospory Fungi, Zygomycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae, Zygorhynchus Record #8807 Rod Rhizomucor – od rodu Rhizopus se liší tvorbou větvených sporangioforů a méně vyvinutými rhizoidy Rhizomucor pusillus CCM F-211 Fungi, Zygomycota, Mucoromycotina, Mucorales, Mucoraceae, Rhizomucor Record #3575 sporangiofory větvené většinou pod vrcholkem sporangium kolumela sporangiospory zygospora Rod Cunninghamella - větvené sporangiofory ukončené jednosporovými sporangii (sporangioly), rhizoidy vyvinuté, stolony chybí Cunninghamella blakesleean CCM F-705 Fungi, Zygomycota, Mucoromycotina, Mucorales, Cunninghamellaceae, Cunninghamella http://www.mycobank.org/TempFiles/20170219/TempF682_Cunninghamella_blakesleeana_fig7.jpg zygospora sporangioly (jednosporová sporangia) větvený sporangiofor zakončený sporogenními hlavicemi Říše: FUNGI Oddělení: ASCOMYCOTA - vegetativní stélku tvoří přehrádkované mycelium nebo pučivé buňky či pseudomycelium - tvorba sept je centripetální, začíná u stěny hyf a pokračuje ke středu, kde ponechá volný pór přepážka - Ascomycota přepážka - Saccharomycetes Diagram illustrating septa of Ascomycota and some mitosporic fungi. Diagram illustrating septa of some mitosporic fungi. Rozmnožování: pohlavní i nepohlavní nebo jen nepohlavní - stádium, kdy houba vytváří nepohlavní mitospory, se nazývá stádium imperfektní (anamorfa) - stádium, kdy houba vytváří pohlavní meiospory, se nazývá stádium perfektní (teleomorfa) Nepohlavní rozmnožování - nejjednodušším způsobem je fragmentace hyf - buňky vznikající exogenně na specializovaných hyfách - konidioforech nazýváme konidie - buňky, které dávají vznik konidiím nazýváme konidiogenní buňky Základní typy konidiogeneze (vzniku konidií): 1. Thalická: již předem vytvořené buňky hyf se rozdělí přehrádkami a rozpadnou se na jednotlivé části. K formování definitivního tvaru dochází po oddělení. a) Thalicko - arthrická: arthrokonidie b) Holothalická: thalokonidie (thalokonidiemi jsou v jistém smyslu i chlamydospory - tlustostěnné přetrvávající buňky vznikající na myceliu) 2. Blastická: konidie se formuje dříve než je oddělena přepážkou od konidiogenní buňky a) Holoblastická - účast všech vrstev buněčné stěny a) synchronní - produkce více konidií na měchýřku b) sympodiální - proliferace konidiogenní buňky b) Enteroblastická - vnější stěna se protrhne, konidii utváří vnitřní vrstva a) tretická - vznik porokonidií, často s výraznou jizvou na konidiogenní buňce b) phialidická - konidiogenní buňky fialidy c) annelidická - konidiogenní buňky anelidy (límeček) Geotrichum candidum CCM 8228 – arthrokonidie v rozpadajících se řetízcích Fungi, Ascomycota, Saccharomycotina, Saccharomycetes, Saccharomycetidae, Saccharomycetales, Dipodascaceae, Geotrichum Dermatofyta Microsporum gypseum CCM 8342 – thalokonidie (makrokonidie a mikrokonidie) Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Onygenales, Arthrodermataceae, Microsporum Record #7863 Trichophyton ajelloi CCM 8351 – makrokonidie a mikrokonidie Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Onygenales, Arthrodermataceae, Trichophyton Record #8522 Epidermophyton floccosum CCM 8339 – makrokonidie Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Onygenales, Arthrodermataceae, Epidermophyton http://www.mycobank.org/TempFiles/20160417/TempF3791_atlas_p0643.jpg Melanizované mikromycety (Dematiaceae) Aureobasidium pullulans CCM F-148 Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Dothideomycetidae, Dothideales, Dothioraceae, Aureobasidium Record #3701 a) interkalární tmavě pigmentované chlamydospory b) konidie vznikající synchronně na nediferencovaných konidiogenních buňkách c) endokonidie d) pučící buňky Alternaria alternata CCM F-397 – vícebuněčné konidie (porokonidie) Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Pleosporomycetidae, Pleosporales, Pleosporaceae, Alternaria http://www.fomesa.net/Calidad/Variedades/img/P_Alternaria03.jpg Bipolaris spicifera CCM F-29 – pseudoseptované konidie (porokonidie) Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Pleosporomycetidae, Pleosporales, Pleosporaceae, Bipolaris http://www.mycobank.org/TempFiles/20140217/ibsgbtc3mtmmba0mwdqucnxh/TempF3711_Record__3711.jpg Pleurostomophora richardsiae CCM F-395 – fialidy s talířovitým límečkem Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Chaetothyriomycetidae, Chaetothyriales, Herpotrichiellaceae http://www.mycobank.org/TempFiles/20160417/TempF3961_atlas_p0876.jpg Phoma lingam CCM F-608 - pyknidy (kulovitý nebo lahvicovitý útvar s ostiolem, uvnitř vystlaný konidiofory na nichž se tvoří konidie) - nepohlavní rozmnožování Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Pleosporomycetidae, Pleosporales, Phoma ostiol Pohlavní rozmnožování - při pohlavním procesu vznikají plodnice (askomata) => v plodnicích pak dochází ke karyogamii v koncových buňkách tzv. askogenních hyfách - z nich vznikají vřecka - spory (askospory) vznikají ve vřecku (latinsky ascus, množné číslo asci) obvykle v počtu 8 v jednom vřecku Typy plodnic: 1) Askohymeniální typ - kleistothecium je uzavřená plodnice s vytvořenou stěnou, otvírá se rozpadem; vřecka nejsou nijak uspořádána (např. teleomorfa rodu Aspergillus) - perithecium je kulovitá nebo protáhlá plodnice s úzkým ústím (ostiolem) vystlaným perifýzami, vřecka jsou uspořádána v hymeniu, mezi nimi se tvoří sterilní hyfová zakončení – parafýzy (např. Chaetomium) - apothecium je miskovitá plodnice; vřecka jsou uspořádána v hymeniu na povrchu plodnice, parafýzy vytvořeny 2) Askolokulární typ - askostroma - v pseudoparenchymatickém útvaru se diferencují pohlavní orgány, askogenní hyfy a vřecka vrůstají do sekundárně vytvořené lyzogenní dutiny (lokulu) Chaetomium globosum CCM F-275 Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Sordariomycetidae, Sordariales, Chaetomiaceae, Chaetomium A - perithecium B - zvlněná něvětvená vlákna (trichomy) C - vřecko (ascus) D - askospory Hyalinní mikromycety Rod Penicillium Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Eurotiales, Trichocomaceae Penicillium – terverticilátní konidiofory Record #3918 Paecilomyces variotii CCM F-398 - konidiofory méně pravidelně větvené, fialidy protáhlé v dlouhý krček, konidie Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Eurotiomycetidae, Eurotiales, Trichocomaceae, Paecilomyces Record #3910 Fusarium sporotrichioides CCM 8014 - konidiofory s monofialidami, makro- a mikrokonidie, chlamydospory, sporodochia (palisáda konidioforů v ložisku na povrchu substrátu) Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Hypocreomycetidae, Hypocreales, Nectriaceae, Fusarium Scopulariopsis brevicaulis CCM F-388 - konidiogenní buňky - anelidy, konidie Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Hypocreomycetidae, Microascales, Microascaceae, Scopulariopsis Acremonium furcatum CCM F-735 - tvorba synnemat, fialidy většinou jednotlivé, k vrcholu se zužující (jehlicovité), septum na bázi, konidie jednobuněčné, hladké, hyalinní Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Hypocreomycetidae, Hypocreales, Acremonium http://www.mycobank.org/TempFiles/20140217/ibsgbtc3mtmmba0mwdqucnxh/TempF3614_Record__3614.jpg Sporothrix sp.- konidiofory vyrůstají jednotlivě ze septovaného mycelia, konidie se tvoří ve shlucích na krátkých výběžcích Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Sordariomycetidae, Ophiostomatales, Ophiostomataceae, Sporothrix Record #4001 Houby vnitřního prostředí „indoor fungi“ Cladosporium herbarum CCM F-159 Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Dothideomycetidae, Capnodiales, Cladosporiaceae, Cladosporium Record #3748 Stachybotrys chartarum CCM F-237 Record #11488 Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Hypocreomycetidae, Hypocreales, Stachybotryaceae, Stachybotrys Epicoccum nigrum CCM F-185 Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Pleosporomycetidae, Pleosporales, Pleosporaceae, Epicoccum Výsledek obrázku pro Epicoccum nigrum Použitá literatura: 1. Váňa, J.: Systém a vývoj hub a houbových organismů. Karolinum, Praha, 1996. 2. MycoBank, http://www.mycobank.org/ 3. De Hoog G.S.: et al.: Atlas of clinical fungi. Utrecht, Reus, 2000. 4. P.W. Crous, G.J.M. Verkley, J.Z. Groenewald, R.A. Samson. CBS Laboratory Manual Series 1, Fungal Biodiversity. CBS, Utrecht, 2009 5. Jandová, B., Kotoučková, L.: Praktikum z mikrobiologie. Masarykova univerzita v Brně, 1996. MEDIA Agar dle Nickersona bismut-amónium citrát 5,0 g/l siřičitan sodný 3,0 g/l dextróza 10,0 g/l glycin 10,0 g/l kvasničný extrakt 1,0 g/l agar 16,0 g/l pH 6,8 ± 0,2 Sabouraudův agar s glukózou glukóza 40 g/l pepton 10 g/l agar 15 g/l pH 6,9 Rýžový agar rýžový extrakt 5,0 g/l agar 20,0 g/l Kukuřičný agar kukuřičná mouka 40,0 g/l agar 20,0 g/l Tween 80 10,0g/l pH 6,6 - 6,8. Přidání Tween 80 podporuje tvorbu chlamydospor. Bird Seed Agar Guizotia abyssinica (niger seed, mastňák habešský) 50 g/l KH[2]PO[4] 1 g/l kreatin 1 g /l agar 15 g/l Agar pro důkaz tvorby pouzdrového polysacharidu (NH[4])^2SO^4 5,0 g/l KH[2]PO[4] 1 g/l MgSO4.7H2O 5 g/l glukóza 10g/l kvasniční extrakt 0,5 g/l agar 20,0 g/l Médium pro zjištění asimilace cukrů (NH[4])^2SO^4 5,0 g/l KH[2]PO[4] 1 g/l MgSO4.7H2O 5 g/l glukóza 10g/l kvasniční extrakt 0,5 g/l (agar 20,0 g/l) Médium pro fermentaci cukrů masový výtažek 3,0 g/l pepton 10,0 g/l NaCl 5,0 g/l bromkresolová červeň 1,0 g/l pH 7.2 DRBC (Agar s dichloranem, bengálskou červení a chloramfenikolem) pepton 5,0g/l glukóza 10,0g/l KH[2]PO[4] 1,0g/l MgSO[4] 0,5g/l dichloran 0,002g/l bengálská červeň 0,025g/l agar 15,0g/l pH 5.6 ± 0.2 Agar se sladovým extraktem Malt extract 20 g/l Agar 20 g/l pH 5.6 min. Media pro identifikace rodu Aspergillus CYA (Czapkův agar s kvasničným extraktem) Pitt, 1973 K[2]HPO[4] 1 g/l Czapkův koncentrát* 10 ml/l kvasniční extrakt 5 g/l sacharóza 30 g/l agar 15 g/l pH 6 - 6,5 *Czapkův koncentrát: NaNO[3] 30 g KCl 5 g MgSO[4].7H[2]O 5 g FeSO[4].7H[2]O 0,1 g ZnSO[4] 0,1 g CuSO[4] 0,05 g destilovaná voda 100 ml MEA (Agar se sladovým extraktem) Blakeslee, 1915 malt extrakt 20 g/l pepton 1 g/l glukóza 20g/l agar 20 g/l pH 5 - 5,5 CY20S (Czapkův agar s kvasničným extraktem a 20% sacharózy) Pitt a Hocking, 1985 K[2]HPO[4] 1 g/l Czapkův koncentrát* 10 ml/l kvasniční extrakt 5 g/l sacharóza 200 g/l agar 20 g/l