Rostlinné explantáty (kultury in vitro) úvod pro cvičení z fyziologie rostlin Oddělení fyziologie a anatomie rostlin Laboratoř rostlinných explantátů a anatomie rostlin Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity Bi6120 http://www.sci.muni.cz/explantaty/ Cyclamen Malus Lilium Příklady kultur Rostlinné explantáty  zpočátku obor rostlinné fyziologie odlišující se svou vlastní metodologií  v současnosti jsou základnou rostlinných biotechnologií  později četné aplikace v genetice a šlechtitelství  mají využití v molekulární biologii – množení rostlin, transformace, selekce… používají k regulaci procesů fytohormony a růstové regulátory Co to jsou fytohormony? rostlinný hormon = fytohormon organická sloučenina syntetizovaná v jedné části rostliny, zpravidla translokovaná do jiné části, kde ve velmi malé koncentraci způsobuje fyziologickou odpověď (Salisbury a Ross 1985) mohou mít účinky stimulující, ale i inhibující organické sloučeniny syntetizované chemicky, které mohou být rostlinnými buňkami přijímány, transportovány a způsobují podobnou fyziologickou odpověď jako fytohormony. Co to jsou růstové regulátory? 5 skupin „klasických“ fytohormonů • auxiny 4 • cytokininy několik • gibereliny mnoho • kyselina abscisová 1 • etylén 1 • kyselina jasmonová • brassinosteroidy • polyaminy • oligosachariny • oligopeptidy • fenolické látky • strigolaktony, butenolidy... netradiční fytohormony Konjugace DegradaceBiosyntéza Fyziologická odpověď Přenos hormonálního signálu k výkonným strukturám Příjem hormonálního signálu Transport (vstup do buňky výstup z buňky) HORMON metabolismus transport na dlouhou či krátkou vzdálenost příjem a přenos hormonem neseného signálu Definice termínů • explantát je každý fragment živého pletiva, celý orgán nebo soubor orgánů, který je vytržen z korelačních vztahů celku a je pěstován v umělých podmínkách (Bauer 1939) • ex plantare = pěstovat mimo • in vitro = ve skle, v umělých podmínkách • aseptická kultura = bez infekce (bakterie, kvasinky, plísně) • axenická kultura = kultura jednoho organismu • tkáňová kultura = historický pojem, přeneseno z oblasti fyziologie živočichů T. Murashige Z. Sladký Olomouc 1984 Foto: M. Griga Základní podmínky kultivace in vitro • aseptická kultura nutnost sterilizace a desinfekce • vhodná výživa explantátu živná média • vhodné fyzikální podmínky – osvětlení – teplota – koncentrace plynů – vlhkost vzduchu zkumavky, zavařovací lahve, Magenta boxy Kultivační nádoby sklo nověji i plasty Sterilizace a desinfekce A. Fyzikální • mechanická a elektrostatická vzduch očkovacích boxů (laminární, 2. třída) filtrace termolabilních látek - filtry: skleněné (frity G5, S4) membránové (Seitz, Millipore, Sartorius) 0,22mm • UV záření (kultivační místnosti, boxy) • teplota suché nebo vlhké teplo Očkovací boxy laminární proudění vzduchu přes filtry: • horizontální - FATRAN GELAIRE • vertikální – UNIFLOW GELAIRE Složení živných médií I. • Anorganické sloučeniny makroelementy: N, P, K, Ca, Mg, S mikroelementy: Fe, B, Cu, Mn, Ni, Co, I, • Organické sloučeniny vitamíny: B1, B6, kys. nikotinová, kys. listová, biotin aminokyseliny: směsi nebo čisté inositol polyaminy: putrescin, spermin, spermidin... aktivní uhlí přírodní látky: kokosové mléko, rostl. šťávy… Složení živných médií II. • Zdroj organického uhlíku = sacharidy mono- a disacharidy (sacharóza) • Růstové regulátory – auxiny – cytokininy – gibereliny – kys. abscisová • Ztužování médií - agar, Gelrite Úrovně organizace explantátu • rostlina ( semenáček, embryo) • orgán (kořen, list, řapík, pupen) • pletivo (dřeňový parenchym, endosperm, kambium - „tkáňové kultury“) • buňka (mikrospory, pyl. zrna, suspenze) • izolovaný protoplast Indukce tvorby adventivních kořenů auxinem vliv IBA kontrola bez IBA zakořeňování řízků kopřivěnky (Coleus) Praktické využití giberelinů • GA3 - indukce růstu bobulí bezsemenných hroznů - odrůda Thompson • GA4 – redukce střídavé plodnosti u jabloní a hrušní • GA3 – u citrusů – synchronizace dozrávání plodů kontrola ošetřeno GA3 během vývoje plodů Typy regeneračních procesů (Němec 1905) restituce = náhrada odňaté části - meristémy (meriklonové množení) reprodukce = regenerace z již existujících základů regenerace de novo = odvozování nejčastěji přes kalus, v něm diferenciace adventivních pupenů nebo embryí organogeneze somatická embryogeneze Apikální stonkový meristém listová primordia vlastní meristémizolovaný „meristém“ Růst izolovaného meristému karafiátu médium bez RR teratomy neschopné tvorby kořenů, květů a semen velká nadprodukce endogenních cytokininů potlačení apikální dominance transgenní tabák s aktivním ipt genem z Agrobacterium tumefaciens Vliv nadprodukce endogenních cytokininů Výhody množení in vitro • malý rozměr řízku • vysoký množitelský koeficient • zkrácení množitelského cyklu • možnost použití netradičních orgánů • možnost načasování na určitý termín • dobrý zdravotní stav (ozdravování) I. II. III. Stadia mikropropagace Saintpaulia ionantha Wendl. organogeneze Přímá somatická embryogeneze na listu africké fialky auxin NAA cytokinin BA Aklimatizace regenerantů africké fialky Saintpaulia ionantha Wendl. 1 3 12 9 2 Mikropropagace sukulenty masožravé rostliny Dionea Drosera mikropropagace Lilium mikropropagace Malus Mikropropagace okrasných rostlin i dřevin Hlavní zájmy evropských laboratoří in vitro COST meeting 1992, Dijon 0 10 20 30 40 50 60 70 80 komerce výzkum množení ozdravování uchování gen. manipul. šlechtění s. metabolity Jan Holub, Olomouc http://www.volny.cz/in-vitro/my.html mikropropagace rododendronů a jiných okrasných rostlin aklimatizace regenerantů Nepřímá somatická embryogeneze somatická embrya Aesculus hippocastaneum odvozená na kalusu z květenství Hevea brasiliensis Somatická embryogeneze u dřevin smrk sitka (Picea sitchensis) (Foto: P. Krogstrup) Kalusy na segmentu kořene mrkve auxin 2,4-D regenerace de novo Somatická embryogeneze na hypokotylu lnu auxin 2,4-D Nepřímá somatická embryogeneze na kalusu lnu – indukce auxinem 2,4-D A. Prašníkové či mikrosporové kultury (androgeneze) nebo kultury neoplozených vajíček (gynogeneze) Manipulace se stupněm ploidie umožňují: 1. regenerace haploidních rostlin 2. zdvojení haploidního genomu = dihaploidizace získání homozygotního materiálu v kratší době B. Regenerace de novo - možné změny počtu chromosomů Použití kultur izolovaných embryí • překonání dormance semen • překonání aborce embryí („embryo rescue“) mezidruhové hybridy: bavlník, ječmen, rýže, juta mezirodové hybridy: Hordeum x Secale, Triticum x Secale, Hordeum x Hordelymus, Tripsacum x Zea • studie experimentální embryogeneze • zdroj mladého materiálu pro mikropropagaci Indukce adventivních pupenů na izolovaných embryích konifer modřín smrk smrk 14 DC médium s cytokininem BA adventivní pupeny na hypokotylu adventivní prýty Praktické využití explantátů rychlé množení ve velkých kvantech urychlování šlechtitelských cyklů získávání vzdálených hybridů („embryo rescue“, opylení in vitro) získávání haploidů a dihaploidů ozdravování od virů umělá semena genové banky, kryoprezervace získávání sekundárních metabolitů transgenoze Rostoucí prýt z izolovaného meristému bramboru enkapsulovaného v alginátu http://allserv.rug.ac.be/~pdebergh/ind/content.htm Zajímavé odkazy http://www.biotrin.cz/ přehledné a názorné výukové stránky informace o moderních biotechnologiích a GMO http://www.jmu.edu/biology/pctc/tcstart.htm Jak začít s tkáňovými kulturami?: http://www.kitchenculturekit.com/africanviolet.htm http://www.jmu.edu/biology/biofac/facfro/cloning/cloning.htm http://aggie-horticulture.tamu.edu/tisscult/microprop/microprop.html http://www.micropropagation-services.co.uk/ http://bestcarnivorousplants.com/dionaea/ http://www.geocities.com/RainForest/2011/MicropropSHF.html Doporučená literatura • DROBNÍK J. a ŠTĚPÁNKOVÁ H. /eds./ (1997): Harmonizace pravidel práce v biologii a chemii. I. Bezpečnost biotechnologií. Series in Natural History, 6, PERES, Praha. (Skriptum UK). • ONDŘEJ M. (1992): Genové inženýrství kulturních rostlin.- Academia, Praha. • ONDŘEJ M. a Drobník J.(2002): Transgenoze rostlin. - Academia, Praha. Doporučená literatura • GAMBORG O.L. a PHILLIPS G.C.(1995): Plant cell, tissue and organ culture. Fundamental methods, Springer Berlin. Heidelberg. • PIERIK R.L.M. (1987): In vitro culture of higher plants. - Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, Boston, Lancaster. • REINERT J. a BAJAJ Y.P.S./eds./ (1977 ): Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture.- Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Doporučená literatura - skripta • KOVÁČ J. (1992): Explantátové kultury rostlin. Ústí n. Labem (Skriptum UJEP). • VOTRUBA M. a kol. (1987): Explantátové techniky (pro biotechnology a šlechtitele).- Praha (Skriptum VŠZ Praha). • ŠEBÁNEK J. a SLADKÝ Z. (1988): Biotechnologie rostlinných explantátů.- Brno (Skriptum VŠZ). (nyní MZLU)