Extrakce a spektrofotometrické
stanovení chlorofylů a + b
Trocha teorie:
Téměř všechny živé organismy na Zemi (výjimku tvoří např. chemolithotrofní bakterie)
využívají ve svých metabolických procesech chemickou energii, která byla původně
přeměněna z energie světelného záření zelenými rostlinami v procesu fotosyntézy. Z hlediska
života na Zemi jsou tedy chlorofyly jednou z klíčových molekul.
Chlorofyly se vyskytují v rostlinách v chloroplastech ve formě chlorofyl-proteinových
komplexů. Chlorofyl sám je složen ze dvou komponent: substituovaným porfyrinovým
kruhem s centrálně navázaným kationtem Mg2+
a dlouhým uhlovodíkovým řetězcem fytolem.
Chlorofyl b se od chlorofylu a liší pouze substitucí metylové skupiny za skupinu
aldehydovou na 3. atomu uhlíku. Tyto dvě formy chlorofylů se v přírodě vyskytují v poměru
3:1 (chl a:chl b). Ačkoli porfyrin má hydrofilní charakter, nepolární charakter fytolu je pro
molekuly chlorofylů významnější a ty jsou proto dobře rozpustné v nepolárních
rozpouštědlech (ethanol, aceton, benzen...).
Chlorofyl a
* CH3
C55H72MgN4O5, relativní molekulová
hmotnost 893,49
maximální absorpce: λ=430 nm a λ=662
nm
Chlorofyl b
* CHO
C55H70MgN4O6, relativní molekulová
hmotnost 906,51
maximální absorpce: λ=453 nm a λ=642
nm
Pomůcky a potřeby:
Čerstvé listy kukuřice (Zea mays), třenka, pipety 2, 5 a 10 ml, odměrné baňky 50 ml,
skleněná tyčinka, filtrační papír, filtrační nálevky, stojan s filtračními kruhy, laboratorní
váhy, spektrofotometr, mořský písek, 100% aceton, MgCO3.
Postup:
1. Odvážíme 0,25 g čerstvých listů, rozstříháme je do třenky na menší kousky a přidáme
malé množství mořského písku a uhličitanu hořečnatého.
2. Obsah třenky důkladně rozetřeme a poté promyjeme 5 ml acetonu. Necháme chvíli
ustát a poté extrakt přes skleněnou tyčinku filtrujeme přes filtrační papír předem
zvlhčený acetonem do 25ml odměrné baňky.
3. Bod č. 2 opakujeme několikrát za sebou, až do úplného odbarvení obsahu třenky.
4. Acetonem promyjeme rovněž filtrační papír - kvantitativně přeneseme do roztoku
veškerý chlorofyl.
5. Acetonový extrakt chlorofylu v odměrné baňce doplníme po značku.
6. Oproti blanku (aceton) změříme absorbanci při λ=470nm, λ=646 nm a λ=663 nm.
7. Koncentraci chlorofylů a karotenoidů v extraktu vypočteme dle následujících rovnic
[Wellburn A.R., J. Plant Physiol. 144: 307-313 (1994)]:
Chl a = 12,21×A663 – 2,81×A646 [g.ml-1
]
Chl b = 20,13×A646 – 5,03×A663 [g.ml-1
]
Cx+c = (1000×A470 – 3,27×Chl a – 104×Chl b) / 198 [g.ml-1
]
kde A jsou absorbance při příslušné vlnové délce a šířce kyvety 1 cm.
8. Výsledky přepočteme na množství chlorofylů na jednotku hmotnosti (1 g) čerstvých
listů.
Prezentace a diskuze získaných dat
1. Jak se liší obsah chlorofylů a karotenoidů u vámi testovaných rostlin kukuřice?
2. Jaký je poměr chlorofylu a: chlorofylu b a odpovídá tento poměr teoreticky udávaným
hodnotám?