Metody výzkumu
patofyziologie volných
radikálů
Milan Číž
1
2
Metody detekce
 Chemiluminiscence
 Spektrofotometrie
NBT-test
redukce cytochromu C
 Elektronová spinová resonance
 Elektrochemie
stanovení spotřeby kyslíku
detekce NO
 Fluorimetrie (průtoková cytometrie)
3
Metody stanovení:
 volných radikálů
 aktivity zdrojů volných radikálů
 antioxidační aktivity biologických vzorků
 jednotlivých antioxidantů
 poškození biologických makromolekul
4
Spektrofotometrie
 superoxidový aniont:
cytochrom C assay
Princip metody je založen na redukci oxidovaného (Fe3+) cyt
C superoxidovým aniontem na Fe2+ cyt C
550 nm
 NBT test:
NBT je silný redoxní indikátor, který po redukci RKM tvoří
nerozpustný diformazan, 605 nm
nespecifický
 oxid dusnatý:
Griessova reakce (nitrity, nitráty), detekční limit 100 nM, 548
nm.
5
Elektronová spinová resonance
 ESR (EPR) je spektroskopická metoda, která se zabývá
mikrovlnnými přechody mezi energetickými stavy
nepárových elektronů se spinem a orbitálním momentem
hybnosti.
6
Elektrochemie
 oxid dusnatý:
selektivní elektroda pro NO
 ostatní RKM
 stanovení spotřeby kyslíku
7
Průtoková cytometrie
 povrchové antigeny:
MAb značené různými fluorescenčními značkami
 tvorba RMK neutrofily a makrofágy:
Dichlorodihydrofluorescein diacetate – peroxid vodíku,
peroxynitrit
Dihydrorhodamine 123 - peroxid vodíku, peroxynitrit
Dihydroethidium bromide – superoxidový anion.
 oxid dusnatý:
1,2-diaminoanthroquinone
 buněčný cyklus, buněčná viabilita:
propidium iodide
8
Detekce H2O2 ale i dalších intracelulárních oxidantů včetně
oxidů dusíku
Výhody
 shodná vlnová délka s fluoresceinem
 používána nejdelší dobu (od roku 1983)
Nevýhody
 unikání z buněk  nelze fixovat
 vysoká citlivost vůči světlu
 toxicita
 nezbytná aktivita esteráz
Dichlorodihydrofluorescein diacetát
9
Dichlorodihydrofluorescein diacetát
10
Dihydrorhodamin
Detekce H2O2 ale i dalších intracelulárních oxidantů
včetně oxidů dusíku
Výhody
 až 10x vyšší citlivost oproti DCFH-DA
 stabilita - možnost fixace
Nevýhody
 nespecifická detekce oxidantů
 závislost na mitochondriálním membránovém potenciálu?
11
Dihydrorhodamin
12
Výhody
 dobrá specificita pro O2

stabilita - možnost fixace
Nevýhody
 HE katalyzuje dismutaci O2

toxický
 nelze použít současně s PI
Dihydroethidium bromid
Detekce O2
-
13
Dihydroethidium bromid
14
Metody stanovení:
 volných radikálů
 aktivity zdrojů volných radikálů
 antioxidační aktivity biologických vzorků
 jednotlivých antioxidantů
 poškození biologických makromolekul
15
Luminometrické metody
Luminofory jsou oxidovány RMK. Při návratu do
základního energetického stavu emitují fotony. Jejich
detekce je možná pomocí luminometrů nebo
scintilačních spektrofotometrů.
Nejčastěji používané luminofory:
- Luminol
- Lucigenin
- Izoluminol
- Pholasin
16
Luminometrické metody
 aktivita MPO:
bromid-dependentní chemiluminiscence v přítomnosti
vzorku a peroxidu vodíku
 buněčná proliferace a cytotoxicita:
luciferin-luciferáza
17
Oxidativní vzplanutí fagocytů
NADPH
oxidáza
NADP+
(O2
-, H2O2, OH)
O2
-•
O2
NADPH + H+
luminol + oxidant -aminoftalát + N2 + světlo
(425 nm)
18
Oxidativní vzplanutí fagocytů
19
Oxidativní vzplanutí fagocytů
Aktivátory fagocytů Místo působení
osponizované částice (OZP) povrchové receptory
fMLP povrchové receptory
PMA proteinkináza C
vápníkový ionofor A23187 Ca2+ PKC
20
Intra- a extracelulární tvorba RMKD
 SOD, kataláza, křenová peroxidáza, azid sodný
 luminol vs. isoluminol
 Streptococcus mutans
21
Intra- a extracelulární tvorba RMKD
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60
Čas (min)
CL(RLU)
Control
SOD/CAT
Rat PMNLs + non-opsonized S. mutans
22
Intra- a extracelulární tvorba RMKD
0
50
100
150
200
250
0 10 20 30 40 50 60
Čas (min)
CL(RLU)
Control
SOD/CAT
Rat PMNLs + opsonized S. mutans
23
Intra- a extracelulární tvorba RMKD
24
Intra- a extracelulární tvorba RMKD
25
Intra- a extracelulární tvorba RMKD
26
Intra- a extracelulární tvorba RMKD
27
Rozlišení mezi RMK a RMD
 antioxidanty
 NO donory (sodium nitropruside, SIN-1)
 analogy L-argininu (L-NMMA, L-NAME, L-
NNA)
28
Metody stanovení:
 volných radikálů
 aktivity zdrojů volných radikálů
 antioxidační aktivity biologických vzorků
 jednotlivých antioxidantů
 poškození biologických makromolekul
29
Systémy generující RMKD
 xanthin/xanthin oxidáza O2
-•
 peroxid vodíku + ionty přech.kovů •OH
 peroxid vodíku H2O2
 ABAP ROO•
 SIN-1 ONOO
buněčné systémy (fagocyty)
30
Metoda TRAP
 Total (peroxyl) Radical-trapping Antioxidative Parameter
 stanovení celkové antioxidační kapacity ve vodě
rozpustných antioxidantů
 referenční vzorek: trolox
31
Metoda TRAP
 2,2‘-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride
 2,2‘-azobis(2-methylpropionamide) dihydrochloride
32
Metoda TRAP v lipidové fázi
 2,2‘-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)
33
Metoda TRAP
RN == NR N2 + 2R* R2, další reakce
2RO2
*
peroxylový radikál
2O2
34
Metoda TRAP
50% peak
CL
Čas
Přidání vzorku
1/2 peak-time
35
Metoda TRAP
•
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50
Čas [min]
CL[mV]
backgr
abap
trolox
36
Metody stanovení:
 volných radikálů
 aktivity zdrojů volných radikálů
 antioxidační aktivity biologických tekutin
 jednotlivých antioxidantů
 poškození biologických makromolekul
Metody stanovení oxidativního stresu 37
Spektrofotometrie
 jednotlivé antioxidanty:
kyselina močová
kyselina askorbová
albumin
bilirubin
38
Metody stanovení:
 volných radikálů
 aktivity zdrojů volných radikálů
 antioxidační aktivity biologických tekutin
 jednotlivých antioxidantů
 poškození biologických makromolekul
39
Poškození biologických makromolekul
 Lipidová peroxidace
Stanovení konjugovaných dienů pomocí CL
Stanovení MDA spektrofotometricky, HPLC
Stanovení 4-hydroxynonenalu (spektrometrie, GC-MS)
40
Poškození biologických makromolekul
 Oxidativní poškození bílkovin
Stanovení karbonylových skupin proteinů (HPLC,
spektrometrie)
Stanovení proteinových hydroperoxidů
41
Poškození biologických makromolekul
 Oxidativní poškození DNA
Stanovení 8-hydroxy-deoxy-guanosinu (8-OHdG)
-HPLC, GC-MS