Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Alternativy klasických in vivo testů in – vitro in – silico Speciální ekotoxikologické biotesty – in vitro • standardní testy (normy ISO, ČSN, USEPA) • optimalizace/vývoj nových testů • Toxicita • Výzkum mechanismů působení látek • Specifické mechanismy neletálních účinků  Genotoxicita  Dioxinová aktivita  Mechanismy endokrinní disrupce – estrogenita, androgenita  Imunotoxicita  Biochemická ekotoxicita • Testování čistých látek (environmentální polutanty) modelových směsí komplexních environmentálních extraktů In vitro toxikologie Testy na původních či geneticky modifikovaných prokaryotických či eukaryotických buňkách - využívány zejména pro teoretické objasnění účinku toxického agens - v poslední době i pro rutinní provádění testů toxicity BAKTERIÁLNÍ TESTY, KVASINKOVÉ TESTY TESTY NA TKÁŇOVÝCH KULTURÁCH Využití tkáňových kultur (TK) = Alternativní metoda k pokusům na živých organismech Řada testů optimalizována na provedení v mikrodestičkách (high throughput testing) • stabilizované linie se dobře pěstují, rychle rostou a lze vytvořit mnoho vzorků menších kultur, ke kterým se přidávají do kultivačního prostředí chemické látky a zkoumá se charakter toxických účinků Výhody TK: výrazné snížení množství zvířat použitých v experimentu • zajištění vysokého počtu vzorků; původ kontrolních i experimentálních vzorků ze stejné tkáně, což minimalizuje variabilitu získaných výsledků. Nevýhoda TK: možnost sledovat účinky testované látky pouze na konkrétním druhu tkáně, ze kterého byla TK připravena, tedy chybějící možnost posouzení zdravotního stavu a chování celého živočicha. Testy na buněčných kulturách • různé typy buněčných kultur – některé dostupné v buněčné bance, respektive Sbírce buněčných kultur. • podle předepsaných podmínek (výživa, teplota, vlhkost apod.) lze danou buněčnou kulturu rozpěstovat a použít v toxikologickém testu. • buňky se nasazují do speciálních nádob pro pěstování buněčných kultur, přidává se živné medium obohacené o antibiotika, případně antimykotika • Primární buněčné kultury – buňky přímo získané z organismu/ od dárce • omezená dostupnost - z tkání organismů, jsou nestandardní, variabilita a rozdíly mezi jedinci, což může významnou měrou ovlivnit výsledek testu toxicity (= nízká reprodukovatelnost) • omezená doba života v kultuře (Hayflickův limit) – i přes optimální kultivační podmínky většina typů normálních (nenádorových) buněk prodělá pouze omezený, předem daný počet buněčných dělení • nutná podrobná charakterizace zdrojové tkáně a postupu izolace (typ tkáně, věk a pohlaví dárce, způsob získání, počet pasáží od jejího stanovení, charakterizace fenotypu i genotypu atd.) Permanentní linie - (kontinuální) ⇒ nádorové nebo imortalizované - například stabilizované linie kožních buněk, nervových buněk, buněk srdečního svalu, buněk odvozených od tkání ledvin a pod., - často nádorového původu – geneticky nebo epigeneticky abnormální - buněčný substrát pro založení kultury pochází z modelových druhů nebo se kdysi získal od lidského dárce (jako vedlejší materiál např. při operaci), pak byl stabilizován a uzpůsoben k neomezenému dělení a následné kultivaci. Imortalizace: • Spontánně (pomalé a málo účinné, někdy záměrná indukce mutageneze) • Cíleně - transdukce virem –HPV, SV-40, mutageny, umělá exprese či inhibice klíčových molekul–např. telomerázy (hTERT), onkogeny • možno získat stabilní buněčné linie z různých orgánů a z různých druhů organismů; tyto linie se velmi dobře přechovávají v hybernovaném stavu. • v současné době dostupné stovky permanentních linií Primární kultury Permanentní linie Heterogenní Homogenní - klonální Omezená životnost Nesmrtelné Náročnější na kultivaci Snadno kultivované Variabilita mezi izolacemi Genetická nestabilita KMENOVÉ BUŇKY A Z NICH DIFERENCOVANÉ BUŇKY – NOVĚ VYVÍJENÉ MODELY self-renewal self-renewal self-renewal Terminálně diferencované buňky Proliferačnípotenciál Potence Diferenciace Izolace & Reprogramování (2007 - člověk) Izolace (1998 - člověk) Indukované pluripotentní buňky (iPSC) Izolace (1997 - člověk) Embryonální kmenové buňky (ESC) Dospělé kmenové a progenitorové buňkyDospělé (tkáňově-specifické) kmenové buňky – Normální nenádorové buňky organismu – Symetrické (self-renewal) a asymetrické dělení (diferenciace) – Proliferační potenciál a potence – Vývoj protokolů pro jejich in vitro diferenciaci do požadovaných typů buněk IN VITRO TOXIKOLOGIE & KMENOVÉ BUŇKY Příklad: Hepatotoxicita – Játra – hlavní detoxikační orgán – Biotransformace / bioaktivace toxických látek – Permanentní jaterní linie (např. HepG2) – nízká aktivita detoxikačních enzymů – malá relevance Gen Genová exprese Izol.hepa- tocyty HepG2 CYP2B6 100 0.5 CYP2C9 100 0 CYP3A4 100 0 UTG1A1 100 5.2 AldB 100 0 Albumin 100 12.3 In vitro diferenciace hESC do „hepatocyte-like cells“ (Greenhough 2010, Toxicology 278) (Guillouzo 2010, Toxicology 270) Vývoj nových modelů 3D modely Kokultivace více typů buněk: • Studium parakrinních účinků • Strukturní a funkční buňky • Odděleně membránami Feeder-layer • Myší fibroblasty • Podklad pro růst jiných b. Bioreaktory, mikrofluidní systémy MECHANISMY chronické toxicity polutantů • Princip: různé chronické účinky chemické látky vycházejí ze společného biochemického mechanismu působení – Základní výsledky z mechanisticky založených in vitro testů – zhodnocení in vitro účinků jednotlivých látek • Poznání zásadního mechanismu, predikce rizika – využití pro hodnocení rizik a/nebo monitoring • Určení relativních potencí ("toxických ekvivalentů") -> RA • Biomarkery in vitro – přímá charakterizace komplexních vzorků HORMON Biochemické účinky TOXIN In vivo účinkyRECEPTOR Receptorově-mediované mechanismy toxicity ESTROGENNÍ RECEPTOR - ER Testy receptorově-mediovaných mechanismů • Jaderné receptory zahrnují několik rodin receptorů: Androgenní receptor (AR), estrogenní receptor (ER), progesteronový receptor (PR), glukokortikoidní receptor (GR) a mineralokortikoidní receptor (MR) jsou hlavními představiteli rodiny steroidních receptorů • Aryl hydrokarbon receptor (AhR) – umístěný v cytosolu • Receptory slouží jako poslové mezi genomem a extracelulárními signály, na které musí buňka reagovat, aby přežila. • Např. AhR regulují na základě interakce s xenobiotiky expresi enzymů I. a II. fáze biotransformace a některých detoxifikačních transportérů, které se přímo podílejí na biotransformaci nebo exkreci xenobiotik. Princip testu: sledovaná aktivita reportérového enzymu odpovídá potenci látky či směsi pro interakci s receptorem aktivita reporterového genu, např. luminometrie - indukce nebo inhibice reporterové luciferázy, nebo spektrofotometrie – indukce nebo inhibice reporterové β-galaktosidázy Toxicita dioxinového typu • Aryl hydrokarbonový receptor (AhR) • indukce detoxikačních systémů • narušení funkce jater, imunity a reprodukce, endokrinního a nervového systému, karcinogenita, embryotoxicita • „cross-talk“ s jinými hormonálními signálními drahami Anti/estrogenita • Estrogenní receptor (ER) • vývoj pohlaví, řízení reprodukce, karcinogeneze, ovlivňuje buněčnou proliferaci a diferenciaci, vývoj a homeostázu Studované mechanizmy účinku Interakce s jadernými receptory – důležité mechanismy chronické toxicity Anti/androgenita • Androgenní receptor (AR) • vývoj pohlaví, zejména samčích pohlavních charakteristik, řízení reprodukce, karcinogeneze, ovlivňuje růst, spermatogenezi Glukokortikoidní aktivita • Glukokortikoidní receptor (GR) • ovlivňuje vývoj, metabolismus, immunitní odpověď, reakci na stres Anti/retinoidní aktivita • Receptor kyseliny retinové (RAR) • reguluje růst, morfogenezi, apoptozu a diferenciaci, ovlivňuje nervový a imunitní systém, vidění a embryonální vývoj Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky - Pod kontrolu AhR- responsivního elementu vložen gen pro luciferázu HSP90 HSP90 HSP90 HSP90 AhR Diox. aktivní látky DRE-Luc syntéza luciferázyluminometr ATP+ lucigenin - Stanovení na buněčné linii krysího hepatomu H4IIE.luc In vitro stanovení dioxinové toxicity In vitro stanovení estrogenní aktivity In vitro biotesty k detekci dioxinové a estrogenní aktivity Buňky H4IIE-Luc Buňky MVLNBuňky trypsinovány a dávkovány 15,000 buněk/jamku Po 24 hodinách vyměněno medium, dávkovány testované látky Expoziční doba : 3-72 hod Po expozici odstraněno medium, buňky vymyty pufrem a přidán Luclite reagent. Po 20 minutách měřena aktivita luciferázy v destičkovém luminometru. y = 1,1217x - 36,261 R2 = 0,9422 0 400 800 1200 1600 0 500 1000 1500 TCDD-EQ (pg/g) TEQ(pg/g) y = 1,0764x + 723,67 R 2 = 0,8345 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 0 5000 10000 15000 20000 25000 TCDD-EQ [pg/g] TEQ[pg/g] In vitro testy na buněčných liniích - hodnocení expozice látkami se specifickým mechanismem účinku (látky s dioxinovou, estrogenní aktivitou) - reportérové buněčné linie transfekované genem luciferázy, který je indukován po navázání ligandu na receptor - kalibrace odpovědi standardním ligandem (2,3,7,8-TCDD pro dioxinovou aktivitu, 17β-estradiol pro estrogenní aktivitu) Vztah mezi dioxinovými toxickými ekvivalenty stanovenými v biotestu na buněčné linii (TCDD-EQ) a spočítanými z výsledků chemických analýz Srovnání různých látek -> Použití v hodnocení rizik • Kvantifikace účinků (EC50) - relativní potence • Srovnání s účinkem referenčního toxikantu (2,3,7,8-TCDD) • Vyjádření jako relativní potence/ Ekvivalenční Faktor (~ REP/TEF) 0 20 40 60 80 100 120 1.E-07 1.E-04 1.E-01 1.E+02 TCDD 4´-OH-PCB 79 4´-OH-PCB 3 AhR-mediatedactivity(%TCDD-max) concentration (µM) EC50 = 10 pM EC50 = 2 µM B[a]P B[e]P TCDD: EC50 TCDD PAH: EC50 PAH Relativní potence REP = EC50 TCDD / EC50 PAH Kolikrát je ta látka slabší ligand než TCDD ? Toxické equivalenční faktory pro PCDDs, PCDFs a PCBs: Eljarrat & Barceló, Trends Anal. Chem.22: 655 Testování komplexních vzorků ze životního prostředí • vzorky vzduchu, sedimentů, půd • rychlý screening znečištění • hodnocena toxicita, genotoxicita, dioxinová a estrogenní aktivita • výběr vzorků pro podrobnější studium/analýzu • spojení s analytickou chemií, frakcionace Problém reprezentativního vzorkování, uchovávání vzorku „pseudopersistentní látky“ – kontinuální expozice nízkým dávkám Výhody toxikologických in vitro testů • rychlost, citlivost, reprodukovatelnost, snadnost provedení, menší náklady • ukazují celkovou biologickou aktivitu látek, které působí specifickým mechanismem • možnost provést screening velkého množství vzorků • mohou poukázat na přítomnost toxikologicky významných látek, které nejsou běžně analyticky stanovovány • sledují i možné interakce (jako synergismus či antagonismus) působení látek v komplexních směsích Nevýhody toxikologických in vitro testů • nezohledňují biotransformaci látek v organismu • nemohou plně nahradit enzymaticko-imunitní reakci živého organizmu • neposkytují informaci o tom, které jednotlivé látky ze směsí vyvolaly odpověď • poskytují informaci jen o celkové aktivitě látek působících určitým specifickým mechanismem Závěr: Testy toxicity na buněčných kulturách jsou vhodný screening před provedením baterie testů na živých organismech. OMICs • identifikace, kvantifikace potenciálních genetických rizik • identifikace konkrétních genů, jejich produktů a procesů, kterými buňky reagují na environmentální toxikanty a stresory • sledovat vedlejší účinky chemických látek na biologické systémy • vytváření databází toxikologických, genetických a genomických informací Toxikogenomika -– objasňuje, jak je celý genom zapojen v biologických odpovědích organismů na stresory - studuje odpovědi/reakce genomu na stresory a toxické látky (Waters et al. 2003) Transkriptomika – sledování exprese populací genů - hledání rozdílů v genové expresi (za různých podmínek, v různých stádiích vývoje, v různých orgánech, ...) Proteomika - komplexní analýza proteinů organely, buňky, tkáně či extracelulárních tekutin Metabolomika - kompletní identifikace a kvantifikace všech metabolitů v daném organismu nebo v buňce. - kombinace genomiky - transkriptomiky, proteomiky, metabolomiky a bioinformatiky s klasickou toxikologií Studium procesů probíhajících v živých organismech - nové vědecké disciplíny DNA mRNA PROTEIN METABOLIT transkripcetranslace biochemické procesy Genom / Genomika Transkriptom / Transkriptomika Proteom / Proteomika Metabolom / Metabolomika „OMICKÉ“ POLE Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky