Testy trofie a toxicity na řasách to BM pro MU Základní přehled rasových testů: • Testy se sladkovodními i mořskými řasami • Testy statické, semistatické a průtočné • Vsádkové („bach cultures") a kontinuálni kultivace • Testy jednodruhové, dvou/tří druhové a vícedruhové • Baterie testů se zástupci skupin (rozsivky, zelené řasy jednobuněčné, cenobiální a vláknité, sinice) Uchovávání matečných kultur • Klasicky: - zkumavky-šikmé agary, - E-baňky- agar, tekutá media, „bi-fáz" • Alternativy - Imobilizace živin - Speciální media - Lyofilizace - Kryo- cesta - Imobilizace buněk do agaru a alginátu, molitanu, PU-pěny, experlitu Deimobilizace řas a sinic z • Z agaru - mechanicky • Z alginátu - princip - Ca-Na kompetice - Uhličitan draselný - Hydrogen uhličitan sodný - EDTA - Hexametafosforečnan sodný - Citronan sodný - Vinan draselno sodný - Jantaran sodný Sbírky a kultivace řas Uchováváni matečných kultur Sbírka BU AV CR v. .„ Klasické kultury Kontinuální kultivace 22 culture Collection of Algae and Protozoa Welcome to the CCAP Website Click he to view, The Culture Collection of Algae and Protozoa [CCAP) is the longest established of the world's major protistan service culture collections. It holds over 2000 strains of; protozoa which are supplied worldwide to industry and the academic community. The Collection is held at two sites: CCAP's Freshwater Laboratory (CCAP-F} holds the Collection's freshwater algae and all protozoa. It is based at the Centre for Ecology and Hydrology (CEH) Windermere, which is an institute of the Natural Environment Research Council fNERC) situated in the English Lake District. CCAP's Marine Laboratory (CCAP-M) holds the Collection's marine algae. It is based at Dunstaffnage Marine Laboratory [DML). which is an institute of the Scottish Association for Marine Sciences [SAMS) situated on the west coast of Scotland. natural /C~"\ Cen SAMS mm env1|kjnment Fffy J Eco RESEARCH COUNCIL Hyd Taxony používané pro EB s řasami: (dle novelizace ISO 8692/2003 a QECD 201 - novy návrh) • Desmodesmus subspicatus 5 x 10 4 • Pseudokirchneriella subcapitata 5 x 10 3 • Anabaena flos-aquae 10 4 • Synechococcus leopoliensis 10 4 • Navicula pelliculosa 10 4 Zdroj - sbírky, vlastní kultury Koncentrace inokula dle organismu a detekce Další použitelné organismy • Chlorella kessleri FOTT et NOVÁK., kmen LARG/1; • c) Desmodesmus subspicatus CHOD., kmen LAPAILEUR/Camb. 276-20; • d) Desmodesmus quadricauda (TURP.)BREB., kmen GREIF S WALD/15; • e) Chlamydomonas reinhardtii. DANG., kmen UTEX 2246 137c mt+. • Srovnání organismů viz [5]Dvořáková a kol. 1999, [6]Rojíčková a Maršálek, 1999. Předkultivace!!!!! Rasové inokulum pro zkoušku se odebírá z exponenciálně rostoucí inokulační kultury. Inokulační kultura se nasadí k předkultivaci 3 dny před začátkem zkoušky takto: • Do Erlenmeyerovy baňky na 150 ml se odměří živný roztok a přidá se inokulum tak, aby hustota buněk ve finální kultuře dosahovala předepsaných 10 000 v 1 ml. Inokulační kultura se 3 dny provzdušňuje a udržuje při světelné intenzitě 30 W/m2 (6000 lx) a teplotě (26+2) C. . Koncentrace inokula na počátku testu by měla být co nej nižší, aby se do testu zaneslo co nejméně živin a co nejvíce buněk se rozmnožilo pod vlivem zkoušené látky, ale v praxi se řídí také detekčním limitem přístrojů používaných pro vyhodnocování testu. Experimentální uspořádání rasových testů toxicity 1 - nádoby • Standardní: - E-baňky 250ml 1 OOml media, kontinuální třepání/bublání, ISO/OECD medium, 22+2 °C • Alternativy: - Zkumavky - třepané, bublané, stacionární - Kyvety 5-10 cm - Mikrodestičky - pevné/tekuté půdy, semikontinuální - Biosenzor s IMA Experimentální uspořádání rasových testů toxicity 2 - kultivační podmínky • Světlo-60-120|uE/m2/s (6-9.000 lx) • Důležité - PhAR, periodicita • Teplota 22-26°C (teplotní optimum 27°C) • Udržování pH - nepřesáhne 8.5 .... • Složení media - N/P poměr - Koncentrace mikroprvků - Koncentrace chelatačních látek - Speciální media pro studie limitace živinami Vyhodnocení rasových testů 1 • Přímé metody - Počítání buněk • pod mikroskopem, • počítač částic • Průtokový cytometr - „cell packing volume" - Hodnota spalného tepla v mikrokalorimetru - C/H/N analýza - (pozor na EP) Vyhodnocení rasových testů 2 • Nepřímé metody - OD 663, 680, 750 nm - Fluorescence ex 465 em 680nm - Změna pH - Inhibice fotosyntézy • 02, C02, RUBISCO, CCD-FLIA - Efekty na membránách - Inhibice příjmu makronutrientů Výpočet EC 50 A) dle integrálu biomasy . Ny-No Ny + Nz-lNo , . Nnl + N„-2N0, A = 2 -h +—-\-~ih +.....+ 2-"•('„ -Ci) tv tv tn.v tn = časy měření NO, Nv N2, Nn_v Nn = počty buněk v jednotlivých časech A - A Inhibice/. pro každou sledovanou koncentraci: / . =—--— Ac - integrál biomasy ai kontrolního vzorku A. = integrál biomasy sledované koncentrace Výpočet EC 50 B) - Dle růstových rychlostí Růstová rychlost se počítá podle vzorce: ^ _ ^n n Nn = počet buněk v 1 ml v závěru testu NQ = počet buněk v 1 ml na počátku testu t = délka testu Inhibice / pro každou sledovanou koncentraci: _ j _ Mi Mc juc = růstová rychlost kontrolního vzorku //. = růstová rychlost sledované koncentrace Kriteria validity testu • Růstová rychlost kontroly je l991/d pro Pseudokirchneriella a 1,74/d pro Desmodesmus (c.v. =24%) • pH se nezmění o více než 1,5 • Koncentrace testované látky neklesne pod 80% Stanovení trofického potenciálu • Trofický potenciál se určí odečtením sušiny biomasy v kontrolním vzorku od sušiny biomasy ve vzorku vody. • Podle tabulky 1 se určí stupeň trofie. Tabulka 1 - Klasifikační tabulka pro hodnocení trofie Hodnoty sušiny v mg/l.- přepočty dle konverzní křivky z OD 750 Stupeň trofie Autor stupnice Kataro bní Ultraoli go Olig 0 Oligome zo Mez 0 Mezoeut ro Eut ro Poly Hypert rofní Sládeček 1979 5 25 50 100 50 0 3 000 Zaková 1986 5 50 100 200 350 50 0 1000 1 000 Zkouška na limitující živiny • Stanovení trofického potenciálu je možno doplnit o zkoušku na limitující živiny. Vzorek vody se selektivně obohatí o P, N, P+N, popř. o další prvky, - vzorek (bez obohacení) - (konečná koncentrace fosforu 0,05 mg/l) - (konečná koncentrace dusíku 1 mg/l) - (konečná koncentrace fosforu 0,05 mg/l a dusíku 1 mg/l) • vzorek + další prvky /koncentrace • Roztoky se sterilizuj í v množství 2 ml v otevřených Petriho miskách 2 hodiny ve sterilizačním zařízení (viz příloha B). Sterilní roztoky se přelijí do sterilních lékovek. Protokol o zkoušce • V protokolu o zkoušce se uvede: - a) odkaz na použitou metodu; - b) identifikace vzorku nebo zkoušené látky; - c) zkušební organismus: druh, původ, kmenové referenční číslo, způsob kultivace; podrobné údaje o zkoušce: - 1) datum zahájení a doba trvání; - 2) koncentrace zkoušené látky a ředění vzorku; - 3) složení živného roztoku; - 4) kultivační zařízení a inkubační postup; - 5) intenzita osvětlení; - 6) teplota; - 7) metoda měření hustoty buněk, použitá konverzní rovnice; Protokol o zkoušce 2 - Výsledky 1) absorbance v jamkách sérologické destičky/ebo počty buněk v každé fázi měření; 2) sušina biomasy v jamkách sérologické destičky ve stacionární fázi růstové křivky; 3) hodnoty EC50; způsob výpočtu 4) hodnoty trofického potenciálu; 5) další skutečnosti významné z hlediska užitého postupu. Table 1. The influence of selected compounds on the growth of Chlorella kessleri in different medium. 96 h EC 50 values in ug*ll (95% confidence interval) and eoeficient of determination respectively. *values in mg.l'1. STANDARD BOTTLE ASSAY OECD medium BBM medium CdCl, 37.3 Z26.5-48.5/0.73 78.1 /69.4-86.8/0.68 CuCl2 56.3 /50.5-62.1/0.82 83.7 /74.7-92.8Z 0.76 ZnClj 54.1 /49.0-59.2/0.89 73.0 /67.1-78.9/0.86 bentazon 37.2 /33.2-41.2/ 0.92 44.6 Ml.0-48.2/ 0.94 *imidazolin 78.7 /72.2-85.2/0.85 97.1 /88.4-105.8/0.84 *gluphosinate 11.3 /8.6-14.0/ 0.86 15.7 /11.5-19.9/0.91 ammonium MICROPLATE ASSAY OECD medium BBM medium CdCl, 40.1 /30.9-49.1/0.89 79.6 /74.4-84.8/0.96 CuCl2 53.5 /48.3-58.7/0.85 78.2 /71.6-84.6/0.94 ZnCl, 54.1 /49.0-59.2/0.89 66.5 /61.9-71.1/0.94 bentazon 31.7 /28.6-34.8/0.97 37.8 /33.6-42.0/0.94 *imidazolin 81.2 /75.4-87.0/0.96 89.6 /86.5-92.7/0.94 *gluphosinate 9.2 / 6.5-11.9/0.98 13.6 /12.5-14.7/0.99 ammonium CHLOROPHYLL FLUORESCENCE ASSAY OECD medium BBM medium CdCl2 47.1 /37.5-56.5/ 0.88 48.3 M2.4-54.2/0.86 CuCI2 59.0 /54.4-63.6/0.90 56.6 /52.0-61.2/0.97 ZnCl2 72.3 /68.0-76.6/0.95 70.1 /66.5-73.7/0.96 bentazon 13.2 /10.1-16.6/0.98 -14.0 /l 1.3-16.7/0.98 *imidazolin 94.7 /90.5-98.9/ 0.98 96.2 /93.1-99.3/0.94 *gluphosi- 10.1 / 7.4-12.8/0.96 9.6 /8.5-10.7/0.98 te ammonium