DS154/CE v002.00/2014-09-15
Page 1 of 6
Instructions For Use
REF: LPF 002
FAST FISH Prenatal X, Y and 18
Enumeration Probe kit
PROFESSIONAL USE ONLY
ENGLISH/FRANÇAIS/ITALIANO/DEUTSCH/ESPAÑOL
Further information available at www.cytocell.com
Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) is a technique that allows DNA
sequences to be detected on metaphase chromosomes or in interphase nuclei
from fixed cytogenetic samples. The technique uses DNA probes that hybridise
to entire chromosomes or single unique sequences, and serves as a powerful
adjunct to classic cytogenetics. Recent developments have meant that this
valuable technique can now be applied as an essential diagnostic tool in
prenatal, haematological and pathological chromosomal analysis. Target DNA,
after fixation and denaturation, is available for annealing to a similarly
denatured, fluorescently labelled DNA probe, which has a complementary
sequence. Following hybridisation, unbound and non-specifically bound DNA
probe is removed and the DNA is counterstained for visualisation.
Fluorescence microscopy then allows the visualisation of the hybridised probe
on the target material.
Probe Information
The Cytocell FAST FISH Prenatal X, Y and 18 Enumeration Probe assays are
designed for the rapid and accurate detection of the most common foetal
chromosomal disorders. The probe set is intended for the detection and
quantification of chromosomes 18, X and Y in interphase nuclei of uncultured
amniotic fluid cells by FISH. The assay should be used in conjunction with
foetal karyotype analysis.
Trisomy of chromosome 18, resulting in Edwards syndrome, occurs in around 1
in 6000-8000 live births with a female sex bias
1
. The clinical findings are
variable, though many exhibit growth delay, heart defects and craniofacial
anomalies, as well as possible limb and kidney abnormalities
2
. Aberrant copy
numbers of the X and Y chromosomes can lead to various sex chromosome
disorders, such as Klinefelter (47,XXY), Turner (45,X) and other syndromes
caused by variations in copy number of X and/or Y. These syndromes have
variable incidences and clinical findings
3
.
The probe set is intended for the detection and quantification of chromosomes
18, X and Y of interphase nuclei of uncultured amniotic fluid cells by FISH. The
assay should be used in conjunction with foetal karyotype analysis.
Probe Specification
X centromere, Xp11.1 – q11.1 (DXZ1) Green
Y centromere, Yp11.1 – q11.1 (DYZ3) Orange
18 centromere, 18p11.1 – q11.1 (D18Z1) Blue
The probe set X, Y and 18 is a mixture of green, orange and blue directly
labelled fluorescent DNA probes specific for the alpha satellite DNA sequences
at the DXZ1, DYZ3 and D18Z1 regions of the chromosomes X, Y and 18
respectively.
Materials Provided
Probe: 50µl per vial (5 tests) or 100µl per vial (10 tests)
Amount of green X centromere (DXZ1) probe: 60 – 75ng/test
Amount of orange Y centromere (DYZ3) probe: 40 – 50ng/test
Amount of blue 18 centromere (D18Z1) probe: 280 – 350ng/test
The probes are provided premixed in hybridisation solution (Formamide;
Dextran Sulphate; SSC) and are ready to use.
Counterstain: 150µl per vial (15 tests)
The counterstain is DAPI antifade (ES: 0.125µg/ml DAPI (4,6-diamidino-2-
phenylindole)).
Warnings and Precautions
1. For in vitro diagnostic use. For professional use only.
2. Wear gloves when handling DNA probes and DAPI counterstain.
3. Probe mixtures contain formamide, which is a teratogen; do not breathe
fumes or allow skin contact. Wear gloves, a lab coat, and handle in a fume
hood. Upon disposal, flush with a large volume of water.
4. DAPI is a potential carcinogen. Handle with care; wear gloves and a lab
coat. Upon disposal, flush with a large volume of water.
5. All hazardous materials should be disposed of according to your
institution’s guidelines for hazardous waste disposal.
Storage and Handling
The Aquarius
®
kit should be stored at -20ºC until the expiry date indicated on
the kit label. The probe and counterstain vials must be stored in the dark.
Equipment Necessary but not Supplied
1. Hotplate (with a solid plate and accurate temperature control up to 80ºC).
2. Variable volume micropipettes and tips range 1µl - 200µl.
3. Water bath with accurate temperature control at 37ºC and 72ºC.
4. Microcentrifuge tubes (0.5ml).
5. Fluorescence microscope (Please see Fluorescence Microscope
Recommendation section).
6. Plastic or glass coplin jars.
7. Forceps.
8. Fluorescence grade microscope lens immersion oil.
9. Bench top centrifuge.
10. Microscope slides.
11. 24x24mm coverslips.
12. Timer.
13. 37ºC incubator.
14. Rubber solution glue.
Fluorescence Microscope Recommendation
For optimal visualisation of the probe we recommend a 100 watt mercury lamp
and plan apochromat objectives x63 or x100. The triple bandpass filter
DAPI/FITC/TRITC is optimal for viewing the green and orange fluorophores as
well as counterstain simultaneously. The blue fluorophore has specificity to the
Aqua and DEAC spectrum (single bandpass Aqua or DEAC filter is required).
The triple bandpass filter DAPI/FITC/Texas Red can be used to view all three
fluorophores and DAPI simultaneously.
Sample Preparation
The prenatal kit is designed for use on uncultured amniocytes fixed in Carnoy’s
fixative (see procedure below). Amniotic fluid sample collection should be
performed according to the laboratory or institution guidelines.
Amniotic fluid samples that appear bloody or brown should not be used, since
they may contain maternal blood and may lead to false results.
Suggested Protocol
Preparation of fresh amniotic fluid samples for FISH:
1. Centrifuge 2 – 5ml of whole amniotic fluid specimen for 7 minutes at
180xg, carefully remove the supernatant without disturbing the cell pellet.
2. Resuspend the pellet in 2ml of 0.075M KCl. Leave at room temperature
(RT) for 5 minutes.
3. Add 2ml of fresh fixative (3:1 methanol:glacial acetic acid) to the
cells/hypotonic solution, adding the first ml dropwise whilst continuously
mixing. Mix well.
4. Centrifuge the suspension for 5 minutes at 280xg, carefully remove the
supernatant and resuspend the pellet in 2ml of fresh fixative.
5. Fixed specimens can be stored at this stage in a freezer at -20ºC.
6. If the sample is not to be frozen, centrifuge the tube at 280xg for 5
minutes. Remove as much supernatant as possible without disturbing the
cell pellet. Flick the tube to resuspend the pellet in the small amount of
fluid remaining.
7. To prepare slides for FISH, spot the cell suspension directly onto slide.
Allow to air dry.
Recommended slide Pretreatment:
1. Immerse the slide prepared from uncultured amniocytes in 2xSSC for 2
minutes at 37ºC.
2. Place the slide in freshly made pepsin working solution (5mg of pepsin
added to 100ml of 0.01M HCl) for 13 minutes at 37ºC.
3. Immerse the slide in phosphate buffered saline (PBS) at RT for 5 minutes.
4. Immerse the slide in post fixation solution (0.95% formaldehyde: 1.0ml of
37% formaldehyde, 0.18g of MgCl2 and 39.0ml of PBS) for 5 minutes at
RT.
5. Immerse the slide in PBS at RT for 5 minutes.
6. Immerse the slide in 70% ethanol at RT. Allow the slide to stand in the
ethanol wash for 1 minute.
7. Remove the slide from 70% ethanol. Repeat step 6 with 85% ethanol,
followed by 100% ethanol.
8. Allow to air dry.
FISH Protocol
(Note: Please ensure that exposure of the probe to laboratory lights is limited at
all times)
Slide preparation (skip this step if the slide was pretreated according to
the protocol above)
1. Spot the cell sample onto a glass microscope slide. Allow to dry.
DXZ1
DYZ3
D18Z1
DS154/CE v002.00/2014-09-15
Page 2 of 6
2. Immerse the slide in 2xSSC for 2 minutes at RT without agitation.
3. Dehydrate in an ethanol series (70%, 85% and 100%), each for 2 minutes
at RT.
4. Allow to dry.
Pre-Denaturation
5. Remove the probe from the freezer and allow it to warm to RT.
6. Ensure that the probe solution is uniformly mixed with a pipette.
7. Remove 10µl of probe per test, and transfer it to a microcentrifuge tube.
Quickly return the remaining probe to -20ºC.
8. Place the probe and the sample slide to prewarm on a 37ºC (+/- 1ºC)
hotplate for 5 minutes.
9. Spot 10µl of probe mixture onto the cell sample and carefully apply a
coverslip. Seal with rubber solution glue and allow the glue to dry
completely.
Denaturation
10. Denature the sample and probe simultaneously by heating the slide on a
hotplate at 75ºC (+/- 1ºC) for 2 minutes.
Hybridisation
11. Place the slide in a humid, lightproof container at 37ºC (+/- 1ºC) for 2
hours.
Post-Hybridisation Washes
12. Remove the coverslip and all traces of glue carefully.
13. Immerse the slide in 0.4xSSC (pH 7.0) at 72ºC (+/- 1ºC) for 2 minutes
without agitation.
14. Drain the slide and immerse it in 2xSSC, 0.05% Tween-20 at RT (pH 7.0)
for 30 seconds without agitation.
15. Drain the slide and apply 10µl of DAPI antifade onto each hybridisation
area.
16. Cover with a coverslip, remove any bubbles and allow the colour to
develop in the dark for 10 minutes.
17. View with a fluorescence microscope.
Stability of Finished Slides
FISHed slides remain analysable for up to 1 month if stored in the dark at or
below RT.
Procedural Recommendations
1. Baking or ageing of slides is not recommended as it may reduce signal
fluorescence.
2. Hybridisation conditions may be adversely affected by the use of reagents
other than those provided or recommended by Cytocell Ltd.
3. The use of a calibrated thermometer is strongly recommended for
measuring temperatures of solutions, waterbaths, and incubators as these
temperatures are critical for optimum product performance.
4. The wash concentrations, pH and temperatures are important as low
stringency can result in non-specific binding of the probe and too high
stringency can result in a lack of signal.
5. Incomplete denaturation can result in lack of signal and over denaturation
can also result in non-specific binding.
Interpretation of Results
The sensitivity and specificity of FISH depends on a number of parameters,
which vary from one cell type to another; from one probe to another; with the
cell techniques used; and within the individual laboratory. Therefore we
recommend for the use of the prenatal kit, that each laboratory should have its
own standard material and determine its own FISH assay cutoff values for
karyotypically normal and aneuploid samples (for guidelines contact Cytocell).
Expected Results
A normal female cell should show 2 green and 2 blue signals (2G, 2B). A
normal male cell should show 1 green, 1 orange and 2 blue signals (1G, 1O,
2B). Cells with trisomy 18 should show 2 green and 3 blue signals (2G, 3B) for
female samples and 1 green, 1 orange, 3 blue (1G, 1O, 3B) for male samples.
There are multiple different combinations of signal patterns possible for the X
and Y chromosomes other than those normal signal patterns outlined above.
Limitations
This test does not detect structural chromosome abnormalities and mosaicism.
It also does not detect numerical abnormalities of chromosomes other than
tested.
The test is not designed to evaluate the risk of trisomy.
Reporting and interpretation of FISH results should be consistent with
professional standards of practice and should take into consideration other
clinical and diagnostic information.
This kit is intended as an adjunct to other diagnostic laboratory tests and
therapeutic action should not be initiated on the basis of the FISH result alone.
Additional Information
For additional product information please contact the Cytocell Technical
Support Department.
T: +44 (0)1223 294048
E: techsupport@cytocell.com
W: www.cytocell.com
FRANÇAIS
L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) est une technique qui permet de détecter des
séquences ADN sur les chromosomes en métaphase ou sur les noyaux interphasiques
d’échantillons cytogénétiques fixés. La technique utilise des sondes ADN qui s’hybrident aux
chromosomes entiers ou à des séquences uniques spécifiques, et sert de test
complémentaire à la cytogénétique classique. De récents développements ont démontré que
cette technique informative peut maintenant être utilisée comme outil diagnostic essentiel
lors de l’analyse des chromosomes en prénatal, hématologie et pathologie. . Après fixation
et dénaturation, l’ADN cible est alors disponible pour hybridation avec une sonde ADN
complémentaire,dénaturée de la même manière et marquée par fluorescence. Après
l’hybridation, l’ADN non hybridé et non lié spécifiquement est éliminé et l’ADN est ensuite
contre-coloré. Un microscope à fluorescence permet ensuite la visualisation de la sonde
hybridée sur l’ADN cible.
Informations concernant la sonde
Le kit de sondes de dénombrement prénatal FAST FISH de Cytocell est un kit de test
prénatal permettant une détection rapide des trisomie, 18 présente, dans les syndrome
d'Edwards ainsi que des aneuploïdies touchant les chromosomes sexuels (comme dans les
syndromes de Klinefelter et de Turner). Les sondes sont conçues pour détecter et quantifier
les chromosomes 18, X et Y des noyaux interphasiques des cellules de liquide amniotique
non cultivées par FISH. L'essai doit être utilisé en association avec l'analyse du caryotype.
Caractéristiques de la sonde
Sonde de la région centromère X a-satellite Xp11.1 – q11.1 (DXZ1) en vert
Sonde de la région centromère Y a-satellite Yp11.1 – q11.1 (DYZ3) en orange
Sonde de la région centromère 18 a-satellite 18p11.1 – q11.1 (D18Z1) en bleu
Les sondes des chromosomes X, Y et 18 sont un ensemble de sondes ADN directement
marquées avec un fluorochrome vert, orange et bleu et qui sont spécialement conçues pour
les séquences d'ADN par alpha satellite dans les région DXZ1, DYZ3 et D18Z1 respectives
des chromosomes X, Y et 18.
Conditionnement
Sonde : 50µl par tube (5 tests) ou 100µl par tube (10 tests)
Quantité de sonde centromère X a-satellite (DXZ1) en vert: 60 – 75ng/test
Quantité de sonde centromère Y a-satellite (DYZ3) en orange: 40 – 50ng/test.
Quantité de sonde centromère 18 a-satellite (D18Z1) en bleu: 280 – 350ng/test
La sonde est fournie prémélangée prête-à-l’emploi dans le tampon d’hybridation (formamide,
sulphate de dextran, SSC).
Contre-colorant: 150µl par tube (15 tests)
Le contre-colorant est le DAPI antifade (ES: 0,125µg/ml DAPI (4,6-diamidino-2-
phenylindole)).
Avertissements et précautions
1. Pour utilisation en diagnostic in vitro. Pour usage professionnel uniquement.
2. Porter des gants lors de la manipulation des sondes ADN et du contre-colorant DAPI.
3. La sonde contient de la formamide qui est un tératogène. Ne pas respirer les vapeurs.
Ne pas mettre en contact avec la peau. Porter des gants, une blouse de laboratoire et
manipuler sous une hotte. Après élimination, rincer abondamment avec de l’eau.
4. Le DAPI est un carcinogène potentiel. Manipuler avec précaution. Porter des gants et
une blouse de laboratoire. Après élimination, rincer abondamment avec de l’eau.
5. Toutes les matières dangereuses doivent être éliminées selon les réglementations
concernant l’élimination des déchets dangereux en vigueur dans votre établissement.
Conservation et manipulation
Le kit Aquarius
®
doit être conservé à -20ºC jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit. La
sonde et le contre-colorant doivent être conservés à l’abri de la lumière.
Equipement nécessaire non fourni
1. Plaque chauffante (avec bloc et contrôle de la température jusqu’à 80ºC).
2. Micropipettes de volume variable et gamme d’embouts de 1µl - 200µl.
3. Bain-marie avec contrôle précis de la température à 37ºC et 72ºC.
4. Tubes à microcentrifugation (0,5ml).
5. Microscope à fluorescence (Voir la section Microscope à fluorescence recommandés).
6. Bocaux Coplin en plastique ou en verre.
7. Pinces.
8. Huile à immersion pour microscope à fluorescence.
9. Centrifugeuse de paillasse.
10. Lames de microscope.
11. Lamelles 24x24mm.
12. Chronomètre.
13. Incubateur à 37ºC.
14. Colle à base de caoutchouc.
Microscope à fluorescence recommandés
Pour une visualisation optimale de la sonde, nous recommandons l’utilisation d’une lampe à
mercure de 100 watts et d’objectifs plan apochromatiques x63 ou x100. Le filtre triple bande
DAPI/FITC/TRITC est optimal pour la visualisation les fluorochromes oranges et verts ainsi
que des contre-colorant simultanément. Le fluorochrome bleu a une spécificité par rapport
au spectre Aqua ou DEAC (un filtre Aqua ou DEAC est requis). Le filtre triple bande
DAPI/FITC/Texas Red permet la visualisation des 3 fluorochromes et du DAPI
simultanément.
Conformité de l'échantillon et collecte
Le kit prénatal a été développé pour utilisation sur des amniocytes non cultivés qui sont fixés
avec du fixateur Carnoy (voir la procédure ci-après). Les échantillons de liquide amniotique
doivent être collectés selon les protocoles en vigueur dans le laboratoire ou établissement.
Les échantillons de liquide amniotique sanguins ou de couleur brune ne doivent pas être
utilisés parce qu’ils pourraient contenir du sang maternel et risquent de falsifier les résultats.
Recommandations de protocole
Préparation d’échantillons de liquide amniotique frais pour le test FISH :
1. Centrifuger 2 - 5ml de l’échantillon de liquide amniotique total pendant 7 minutes à
180xg, puis enlever avec précaution le liquide surnageant sans perturber le culot
cellulaire.
2. Resuspendre le culot dans 2ml de 0,075 KCl. Laisser à température ambiante (TA)
pendant 5 minutes.
3. Ajouter 2ml de fixatif frais (3:1 méthanol:acide acétique glacial) à la solution
cellulaire/hypotonique en ajoutant le premier ml goutte par goutte tout en mélangeant
l’ensemble en continu. Bien mélanger.
4. Centrifuger la suspension pendant 5 minutes à 280xg, enlever avec précaution le
liquide surnageant et resuspendre le culot dans 2ml de fixatif frais.
5. Les échantillons fixés peuvent être conservés dans un réfrigérateur dans cet état à une
température de -20ºC.
6. Lorsque l’échantillon ne doit pas être gelé, centrifuger le tube à 280xg pendant 5
minutes. Enlever autant de liquide surnageant que possible sans perturber le culot
cellulaire. Secouer le tube pour resuspendre le culot dans la faible quantité du liquide
résiduel.
7. Pour préparer les lames pour le test FISH, déposer la suspension cellulaire directement
sur la lame en deux zones d’hybridation. Laisser sécher à l’air.
Prétraitement des échantillons recommandé :
1. Immerger le échantillon préparés à partir d’amniocytes non cultivés dans du tampon
2xSSC pendant 2 minutes à 37ºC.
2. Mettre le échantillon dans une solution de pepsine fraîchement préparée (5mg de
pepsine ajoutée dans 100ml de 0,01M HCI) pendant 13 minutes à une température de
37ºC.
3. Immerger le échantillon dans une solution saline tamponnée au phosphate pendant 5
minutes à TA.
4. Immerger le échantillon dans la solution post-fixation (0,95% de formaldéhyde : 1,0ml
de 37% de formaldéhyde, 0,18g MgCl2 et 39,0ml de la solution saline tamponnée au
phosphate) pendant 5 minutes à TA.
5. Immerger le échantillon dans une solution saline tamponnée au phosphate pendant 5
minutes à TA.
DS154/CE v002.00/2014-09-15
Page 3 of 6
6. Immerger le échantillon dans de l’éthanol à 70% à TA. Laisser le échantillon dans la
solution éthanol pendant une minute.
7. Sortir le échantillon de l’éthanol à 70%. Répéter l'étape 6 avec de l’éthanol à 85%, suivi
par une procédure avec de l’éthanol à 100%.
8. Laisser sécher à l’air libre.
Protocole FISH
(Remarque : Veuillez toujours vous assurer de limiter l’exposition de la sonde à l’éclairage
du laboratoire)
Préparation de la lame (sautez cette étape si la lame a été prétraitée conformément au
protocole décrit ci-dessus)
1. Déposer l’échantillon cellulaire sur une lame en verre. Laisser sécher.
2. Plonger la lame dans du 2xSSC pendant 2 minutes à TA sans agiter.
3. Déshydrater dans une série de bains éthanol (70%, 85% et 100%), 2 minutes dans
chaque bain à température ambiante.
4. Laisser sécher.
Pré-dénaturation
5. Retirer la sonde du congélateur et la laisser se remettre à TA.
6. Bien homogénéiser la sonde en pipetant plusieurs fois.
7. Prélever 10µl de sonde par test et placer dans un tube à microcentrifugation. Remettre
rapidement le tube avec le restant de sonde à -20ºC.
8. Mettre la sonde et la lame échantillon à préchauffer sur une plaque chauffante à 37ºC
(+/- 1ºC) pendant 5 minutes.
9. Déposer 10µl de sonde sur l’échantillon et couvrir avec une lamelle. Sceller avec de la
colle à base de caoutchouc et laisser sécher.
Dénaturation
10. Dénaturer simultanément la sonde et l’échantillon en plaçant la lame sur une plaque
chauffante à 75ºC (+/- 1ºC) pendant 2 minutes.
Hybridation
11. Incuber la lame pendant 2 heures à 37ºC (+/- 1ºC) dans un récipient humide et à l’abri
de la lumière.
Lavages post-hybridation
12. Retirer la lamelle et éliminer toute trace de colle à base de caoutchouc.
13. Laver la lame dans du tampon 0,4xSSC (pH 7,0) à 72ºC (+/- 1ºC) pendant 2 minutes
sans agiter.
14. Egoutter la lame et laver dans du tampon 2xSSC, 0,05% Tween-20 (pH 7,0) à
température ambiante pendant 30 secondes sans agiter.
15. Sécher la lame et appliquer 10µl de DAPI antifade sur chaque échantillon.
16. Recouvrir d’une lamelle, éliminer les bulles et laisser la coloration apparaître à l’abri de
la lumière pendant 10 minutes.
17. Visualiser avec un microscope à fluorescence.
Stabilité des lames
Les lames sont analysables pendant un mois si elles sont conservées à l’abri de la lumière
et à/ou au-dessous de la TA.
Recommandations
1. Il est déconseillé de cuire ou vieillir les lames, ceci pouvant réduire l'intensité du signal
de la fluorescence.
2. Les conditions d’hybridation peuvent être affectées par l’utilisation de réactifs autres
que ceux fournis ou recommandés par Cytocell Ltd.
3. L’utilisation d’un thermomètre calibré est fortement recommandée pour mesurer les
températures des solutions, bains-marie et incubateurs. Ces températures sont
essentielles pour une efficacité optimale du produit.
4. Les concentrations des lavages, pH et température sont importants. Une faible
stringence peut résulter en une liaison non-spécifique de la sonde et une trop forte
stringence peut résulter en une perte de signal.
5. Une dénaturation incomplète peut engendrer une perte de signal et une trop forte
dénaturation une hybridation non-spécifique.
Interprétation des résultats
La sensibilité et la spécificité du test FISH dépend de nombreux paramètres qui varient d’un
type de cellule à l’autre, d’une sonde à l’autre, en fonction des techniques cellulaires
utilisées et au sein d’un laboratoire particulier. Nous recommandons donc, pour l’utilisation
du kit prénatal, que chaque laboratoire dispose de son propre matériel standard et qu’il
détermine ses propres valeurs de découpe pour le test FISH pour des échantillons
aneuploïdes et au caryotype normal (pour plus d’instructions, contactez Cytocell).
Résultats attendus
Une cellule femelle normale doit présenter 2 signaux verts et 2 signaux bleus (2V, 2B). Une
cellule mâle normale doit présenter 1 signal vert, 1 signal orange et 2 signaux bleus (1V, 1O,
2B).Les cellules porteuses d'une trisomie 18 doivent présenter 2 signaux verts et 3 signaux
bleus (2V, 3B) pour les échantillons de cellules femelles et 1 signal vert, 1 signal orange et 3
signaux bleus (1V, 1O, 3B) pour les échantillons de cellules mâles.Il existe plusieurs
combinaisons différentes de configurations de signaux possibles pour les chromosomes X et
Y autres que les configurations de signaux normales définies ci-dessus.
Limitations
Ce test ne détecte pas les anomalies et la mosaïque chromosomiques structurelles.
Il ne détecte pas les anomalies du nombre de chromosomes autres que celles testées.
Ce test n’est pas conçu pour évaluer le risque de trisomie.
Le reporting et l’interprétation du test FISH doivent être effectués conformément aux normes
professionnelles pour la pratique et tout en prenant en compte d’autres informations
cliniques et diagnostiques.
Le test été développé comme complément aux autres tests diagnostiques de laboratoire.
Pour cette raison, des actions thérapeutiques ne doivent pas être lancées sur la seule base
des résultats du test FISH.
Informations supplémentaires
Pour plus d’informations sur le produit, veuillez contacter l’Assistance technique Cytocell.
T: +44 (0)1223 294048
E: techsupport@cytocell.com
W: www.cytocell.com
ITALIANO
L'ibridazione in situ in fluorescenza (Fluorescence In Situ Hybridisation - FISH) è una tecnica
che permette di rilevare sequenze di DNA su cromosomi in metafase o in nuclei in interfase
in campioni citogenetici fissati. La tecnica prevede l'utilizzo di sonde di DNA in grado di
ibridare con un intero cromosoma o con sequenze specifiche presenti in singola copia e
costituisce quindi un potente complemento delle metodologie citogenetiche classiche.
Recenti progressi hanno ora reso possibile l'applicazione di questa utile tecnica come
strumento diagnostico essenziale nell’analisi cromosomica in campo prenatale, ematologico
e patologico. Dopo essere stato sottoposto a fissazione e denaturazione, il DNA bersaglio è
pronto per l’annealingcon una sonda di DNA a sequenza complementare, anch'essa
denaturata, marcata con una sostanza fluorescente. Terminata l’ibridazione, la sonda di
DNA non legata o legata in modo aspecifico viene rimossa e il DNA viene colorato con un
colorante di contrastoper poter essere visualizzato. Per osservare la sonda ibridata sulla
sequenza bersaglio sarà quindi necessario un microscopio a fluorescenza.
Informazioni sulla sonda
Il kit FAST FISH Prenatal Enumeration Probe Cytocell è un saggio prenatale per
l'individuazione rapida delle trisomia 18 presenti nelle sindromi di Edward, nonché di
aneuploidie dei cromosomi sessuali (come la sindrome di Klinefelter e quella di Turner). I set
di sonde sono concepiti per permettere la rilevazione e quantificazione dei cromosomi 18, X
e Y in nuclei in interfase di cellule di liquido amniotico non cresciute in coltura mediante
FISH. Il saggio deve essere associato all'analisi del cariotipo fetale.
Specifiche della sonda
Regione X centromero α-satellite Xp11.1 – q11.1 (DXZ1) verde
Regione Y centromero α-satellite Yp11.1 – q11.1 (DYZ3) arancione
Regione 18 centromero α-satellite 18p11.1 – q11.1 (D18Z1) blu
Il set di sonde X, Y e 18 è una miscela di sonde di DNA fluorescenti marcate direttamente
con fluorofori verdi, arancioni e blu e specifiche per le sequenze di DNA alfa-satellite
presenti nelle regioni DXZ1, DYZ3 e D18Z1 dei cromosomi X, Y e 18, rispettivamente.
Materiali forniti
Sonda: : 50µl per flaconcino (5 test) o 100µl per flaconcino (10 test)
Quantità di X centromero α-satellite (DXZ1) verde: 60 – 75ng/test
Quantità di Y centromero α-satellite (DYZ3) arancione: 40 – 50ng/test
Quantità di 18 centromero α-satellite (D18Z1) blu: 280 – 350ng/test
Le sonde sono fornite premiscelate nella soluzione di ibridazione (formammide; destrano
solfato; SSC) e pronte per l'uso.
Colorante di contrasto: 150µl per flaconcino (15 test)
Il colorante di contrasto è costituito da DAPI antifade (ES: 0,125µg/ml DAPI (4,6-diamidino-
2-fenilindolo)).
Avvertenze e precauzioni
1. Per uso diagnostico in vitro. Solo per uso professionale.
2. Quando si maneggiano le sonde e il colorante di contrasto DAPI, è necessario
indossare guanti.
3. Le miscele dellesonde contengono formammide, una sostanza teratogena. Non
respirare i fumi ed evitare il contatto con la pelle. Indossare guanti e camice da
laboratorio e maneggiare sotto cappa chimica. Per lo smaltimento, sciacquare con
grandi quantità di acqua.
4. Il DAPI è un potenziale cancerogeno. Maneggiare con cura, indossare guantiecamice
da laboratorio. Per lo smaltimento, sciacquare con grandi quantità di acqua.
5. Lo smaltimento dei materiali pericolosi deve avvenire nel rispetto delle normative
interne dell'istituzione relative allo smaltimento dei rifiuti pericolosi.
Conservazione e manipolazione
Conservare il kit Aquarius
®
a -20ºC fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta. I
flaconcini della sonda e del colorante di contrasto devono essere conservati al buio.
Apparecchiature necessarie ma non fornite
1. Piastra riscaldante (dotata di superficie d'appoggio e controllo accurato della
temperatura fino a 80ºC).
2. Micropipette a volume variabile con capacità da 1µl a 200µl e relativi puntali.
3. Bagno termostatato con controllo accurato della temperatura a 37ºC e 72ºC.
4. Provette da microcentrifuga (0,5ml).
5. Microscopio a fluorescenza (fare riferimento alla sezione Caratteristiche consigliate per
il microscopio a fluorescenza).
6. Vaschette di Coplinin plastica o in vetro.
7. Pinzette.
8. Olio di immersione per obiettivi per microscopia a fluorescenza.
9. Centrifuga da banco.
10. Vetrini per microscopia.
11. Vetrini coprioggetto da 24x24mm.
12. Timer.
13. Incubatore a 37ºC.
14. Colla tipo mastice.
Caratteristiche consigliate per il microscopio a fluorescenza
Per una visualizzazione ottimale della sonda si consiglia di utilizzare una lampada al
mercurio da 100 watt e obiettivi planapocromatici 63x o 100x. La soluzione ideale per
visualizzare contemporaneamente i fluorofori verdi e arancioni e il colorante di contrasto è il
triplo filtro passa-banda DAPI/FITC/TRITC. Il fluoroforo blu presenta specificità per lo spettro
di Aqua e DEAC (è necessario un filtro passa-banda per Aqua o DEAC). Per visualizzare
contemporaneamente tutti i tre fluorofori e il DAPI è possibile utilizzare il triplo filtro
passabanda DAPI/FITC/Texas Red.
Preparazione del campione
Il kit prenatale è concepito per essere utilizzato su amniociti non cresciuti in coltura, fissati in
fissativo di Carnoy (vedere la procedura descritta di seguito). La raccolta del campione di
liquido amniotico deve essere eseguita secondo il protocollo in uso nel proprio laboratorio o
istituzione.
Se il campione di liquido amniotico appare contaminato da sangue o di colore marrone, non
deve essere utilizzato, in quanto potrebbe contenere sangue materno e, di conseguenza,
fornire risultati errati.
Protocollo consigliato
Preparazione di campioni di liquido amniotico fresco per FISH:
1. Centrifugare 2 - 5ml del campione di liquido amniotico intero per 7 minuti a 180xg,
rimuovere con la massima attenzione il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare.
2. Risospendere il pellet in 2ml di KCl 0,075M. Lasciare a temperatura ambiente (TA) per
5 minuti.
3. Aggiungere 2ml di fissativo fresco (soluzione 3:1 di metanolo: acido acetico glaciale)
alle cellule/soluzione ipotonica, aggiungendo il primo ml goccia a goccia mescolando
costantemente. Mescolare bene.
4. Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 280xg, rimuovere con la massima
attenzione il sopranatante e risospendere il pellet in 2ml di fissativo fresco.
5. A questo punto della procedura i campioni fissati possono essere conservati in freezer
a una temperatura di -20ºC.
6. Se il campione non deve essere congelato, centrifugare la provetta a 280xg per 5
minuti. Rimuovere la maggiore quantità possibile di sopranatante senza disturbare il
pellet cellulare. Agitare la provetta dando colpetti col dito per risospendere il pellet nella
ridotta quantità di liquido rimasta.
7. Per preparare i vetrini per la FISH, collocare la sospensione cellulare direttamente sul
vetrino.Lasciare asciugare all’aria.
Pretrattamento raccomandato per i vetrini:
1. Immergere il vetrino preparato a partire da amniociti non cresciuti in coltura in SSC2X
per 2 minuti a 37ºC.
2. Collocare il vetrino in una soluzione di lavoro di pepsina appena preparata (5mg di
pepsina aggiunti a 100ml di HCl 0,01M) per 13 minuti a 37ºC.
3. Immergere il vetrino in tampone fosfato salino (PBS) a TA per 5 minuti.
4. Immergere il vetrino in una soluzione post-fissazione (formaldeide allo 0,95%: 1,0 ml di
formaldeide al 37%, 0,18g di MgCl2 e 39,0ml di PBS) per 5 minuti a TA.
5. Immergere il vetrino in PBS a TA per 5 minuti.
DS154/CE v002.00/2014-09-15
Page 4 of 6
6. Immergere il vetrino in una soluzione di etanolo al 70% a TA. Lasciare il vetrino nel
lavaggio in etanolo per 1 minuto.
7. Rimuovere il vetrino dalla soluzione di etanolo al 70%. Ripetere il passaggio 6 con
etanolo all’85% e poi con etanolo al 100%.
8. Lasciare asciugare all’aria.
Protocollo della FISH
(Nota: limitare l'esposizione della sonda alle luci del laboratorio durante l'intera procedura)
Preparazione del vetrino (se il vetrino è stato sottoposto a pretrattamento come
descritto nel protocollo riportato sopra, saltare questo passaggio)
1. Posizionareil campione cellulare su un vetrino per microscopia. Lasciare asciugare.
2. Immergere ilvetrino in SSC2x per 2 minuti a TA senza agitazione.
3. Eseguire la disidratazione in una serie di soluzioni di etanolo a concentrazione
crescente (70%, 85% e 100%), con immersioni di 2 minuti ciascuna a TA.
4. Lasciare asciugare il vetrino.
Pre-denaturazione
5. Rimuovere la sonda dal congelatore e attendere che raggiunga la TA.
6. Mescolare con una pipetta la soluzione della sonda in modo da renderla omogenea.
7. Trasferire in una provetta da microcentrifuga 10µl di sonda per ciascun test da
eseguire. Riporre rapidamente la sonda non utilizzata a -20ºC.
8. Pre-riscaldare la sonda e il vetrino con il campione su una piastra riscaldante a 37ºC
(+/- 1ºC) per 5 minuti.
9. Collocare 10µl di miscela della sonda sul campion e cellulare e coprire delicatamente
con un vetrino coprioggetto. Sigillare con una colla tipo mastice e attendere che la
colla si asciughi completamente.
Denaturazione
10. Denaturare contemporaneamente il campione e la sonda riscaldando il vetrino su una
piastra riscaldante a 75ºC (+/- 1ºC) per 2 minuti.
Ibridazione
11. Disporre il vetrino in una camera umida, non permeabile alla luce, a 37ºC (+/- 1ºC) per
2 ore.
Lavaggi post-ibridazione
12. Rimuovere accuratamente il vetrino coprioggetto e qualsiasiresiduo di colla.
13. Immergere il vetrino in SSC0,4x (pH 7,0) a 72ºC (+/- 1ºC) per 2 minuti senza
agitazione.
14. Scolare il vetrino e immergerlo in SSC2x, Tween-20 0,05% (pH 7,0) a TA per 30
secondi senza agitazione.
15. Scolare ilvetrino e applicare 10µl di DAPI antifade su ciascun campione.
16. Coprire con un vetrino coprioggetto, rimuovere eventuali bolle e attendere lo sviluppo
del colore per 10 minuti lasciando il vetrino al buio.
17. Esaminare con un microscopio a fluorescenza.
Stabilità deivetrini ultimati
I vetrini sottoposti a FISH restano analizzabili per circa 1 mese se conservati al buio a TA o
inferiore.
Raccomandazioni per la procedura
1. L’eccessivo riscaldamento el’invecchiamento dei vetrini sono sconsigliatiin
quantopotrebbero ridurre la fluorescenza del segnale.
2. Le condizioni di ibridazione potrebbero essere influenzate negativamente dall’impiego
di reagenti diversi da quelli forniti o consigliati da Cytocell Ltd.
3. È fortemente consigliato l'uso di un termometro calibrato per la misurazione delle
temperature delle soluzioni, dei bagni termostati e degli incubatori in quanto queste
temperature sono di fondamentale importanza per il funzionamento ottimale del
prodotto.
4. Le concentrazioni, il pH e la temperatura dei lavaggi sono di fondamentale importanza
in quanto condizioni di stringenza blande possono favorire un legame aspecifico della
sonda, mentrecondizioni di stringenza troppo elevate possono determinare l'assenza di
segnale.
5. Una denaturazione incompleta può determinare l'assenzadi segnale, mentre una
denaturazione eccessiva può produrre un legame aspecifico.
Interpretazione dei risultati
La sensibilità e la specificità della FISH dipendono da un numero di parametri che variano da
un tipo cellulare all'altro; da una sonda all'altra; a seconda delle tecniche cellulari utilizzate e
all'interno del singolo laboratorio. Pertanto, per l'uso del kit prenatale è consigliabile che ogni
laboratorio adoperi il proprio materiale standard e stabilisca i propri valori soglia per il saggio
FISH per determinare quali campioni presentano un cariotipo normale e quali sono
aneuploidi (per indicazioni contattare Cytocell).
Risultati attesi
Una cellula femminile normale deve mostrare 2 segnali verdi e 2 blu (2V, 2B). Una cellula
maschile normale deve mostrare 1 segnale verde, 1 arancione e 2 blu (1V, 1A, 2B). Le
cellule con trisomia 18 devono mostrare 2 segnali verdi e 3 blu (2V, 3B) nei campioni
femminili e 1 segnale verde, 1 arancione e 3 blu (1V, 1A, 3B) nei campioni maschili. Oltre ai
pattern di segnali normali descritti sopra, sono possibili varie altre combinazioni diverse per i
cromosomi X e Y.
Limitazioni
Questo test non è in grado di rilevare anomalie strutturali dei cromosomi o mosaicismo.
Inoltre, non permette di individuare anomalie numeriche dei cromosomi diverse da quelle
oggetto del saggio.
Il test non è indicato per valutare il rischio di trisomia.
La refertazione e l’interpretazione dei risultati della FISH devono rispettare gli standard
professionalidipraticamedicae devono tenere conto delle altreinformazionicliniche e
diagnostiche.
Questo kit va utilizzato come strumento complementare ad altri test diagnostici di laboratorio
e non devono essere prese decisioni terapeutichesulla base del solo risultato della FISH.
Informazioni aggiuntive
Per informazioni aggiuntive sul prodotto contattare il Reparto di Assistenza Tecnica Cytocell.
T: +44 (0)1223 294048
E: techsupport@cytocell.com
W: www.cytocell.com
DEUTSCH
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, mit der DNA-Sequenzen auf
Metaphase-Chromosomen oder Interphase-Kernen von fixierten zytogenetischen Proben
nachgewiesen werden. Diese Technik, bei der die verwendeten DNA-Sonden an
vollständige Chromosomen oder an einzelne, eindeutige Sequenzen hybridisieren, dient als
leistungsstarke Ergänzung zur klassischen Zytogenetik. Dank der jüngsten Entwicklungen
kann diese nützliche Technik nun auch als ein wesentliches diagnostisches Werkzeug für
pränatale, hämatologische und pathologische Chromosomenanalysen eingesetzt werden
kann. Die Ziel-DNA lagert sich dabei nach Fixieren und Denaturieren an eine ebenso
denaturierte fluoreszenzmarkierte DNA-Sonde mit komplementärer Sequenz an. Nach der
Hybridisierung werden nicht gebundene und nicht spezifisch gebundene DNA-Sonden
entfernt und die DNA zum Sichtbarmachen gegengefärbt. Unter dem Fluoreszenzmikroskop
lässt sich dann die hybridisierte Sonde am Zielmaterial erkennen.
Sondeninformation
Das Cytocell FAST FISH Prenatal Enumeration Probe Kit ist ein pränataler Assay zum
schnellen Nachweisen der Trisomie 18, die beim Edwards-Syndrom vorliegen, sowie von
Aneuploidien der Geschlechtschromosomen (z. B. Klinefelter- und Turner-Syndrom). Die
Sondensätze sind zum Nachweisen und Quantifizieren der Chromosomen 18, X und Y der
Interphase-Kerne von nicht kultivierten Fruchtwasserzellen durch die FISH Technik
ausgelegt. Zusätzlich zu diesem Assay sollte eine Analyse des fetalen Karyotypen
durchgeführt werden.
Sondenspezifikation
X Centromer α-Satellit Xp11.1 – q11.1 (DXZ1) grünen
Y Centromer α-Satellit Yp11.1 – q11.1 (DYZ3) orangen
18 Centromer α-Satellit 18p11.1 – q11.1 (D18Z1) blauen
Bei den Sondensätzen X, Y und 18 handelt es sich um Mischungen von direkt markierten,
grün, orange und blau fluoreszierenden DNA-Sonden, die für die alpha-Satellit-DNASequenzen
an den Regionen DXZ1, DYZ3 und D18Z1 der Chromosomen X, Y bzw. 18
spezifisch sind.
Bestandteile des Kits
Sonde: 50µl pro Röhrchen (5 Tests) oder 100µl pro Röhrchen (10 Tests)
Menge an X Centromer α-Satellit (DXZ1) grünen: 60 – 75ng/test
Menge an Y Centromer α-Satellit (DYZ3) orangen: 40 – 50ng/test
Menge an 18 Centromer α-Satellit (D18Z1) blauen: 280 – 350ng/test
Die Sonden werden vorgemischt und gebrauchsfertig in Hybridisierungslösung geliefert
(Formamid, Dextransulfat, SSC).
Farbstoff für die Gegenfärbung: 150µl pro Röhrchen (15 Tests)
Der Farbstoff für die Gegenfärbung ist DAPI Antifade (ES: 0,125µg/ml DAPI (4,6-Diamidino-
2-Phenylindol)).
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Zur Verwendung in der In-vitro-Diagnostik. Nur für die Verwendung durch Fachkräfte
bestimmt.
2. Beim Umgang mit DNA-Sonden und dem DAPI Farbstoff Handschuhe tragen.
3. Sondenmischungen enthalten Formamid, das Teratogen ist. Keine Dämpfe einatmen
und Hautkontakt vermeiden. Handschuhe und Labormantel tragen und unter einer
Abzugshaube arbeiten. Bei der Entsorgung mit viel Wasser nachspülen.
4. DAPI ist ein potenzielles Karzinogen. Vorsichtig damit umgehen, Handschuhe und
Labormantel tragen. Bei der Entsorgung mit viel Wasser nachspülen.
5. Alle Gefahrstoffe sollten gemäß den Leitlinien Ihrer Einrichtung zur Entsorgung von
Sondermüll entsorgt werden.
Lagerung und Handhabung
Das Aquarius
®
-Kit wird bis zum Ablauf des auf dem Kitetikett angegebenen
Haltbarkeitsdatums bei -20ºC gelagert. Die Durchstechflaschen mit den Sonden und dem
Farbstoff werden lichtgeschützt aufbewahrt.
Benötigte, aber nicht mitgelieferte Laborgeräte
1. Heizplatte (mit stabiler Platte und genauer Temperatursteuerung bis 80ºC).
2. Mikropipetten mit unterschiedlichen Volumen von 1µl - 200µl.
3. Wasserbad mit genauer Temperatursteuerung bei 37ºC und 72ºC.
4. Mikrozentrifugenröhrchen (0,5ml).
5. Fluoreszenzmikroskop (siehe auch „Empfehlungen zum Fluoreszenzmikroskop“).
6. Coplin-Färbetrog aus Kunststoff oder Glas.
7. Pinzette.
8. Für Fluoreszenzobjektive geeignetes Immersionsöl.
9. Tischzentrifuge.
10. Objektträger für das Mikroskop.
11. 24x24mm Deckgläser.
12. Zeituhr.
13. 37ºC-Inkubator.
14. Gummilösung zum Versiegeln der Deckglasränder.
Empfehlungen zum Fluoreszenzmikroskop
Zur bestmöglichen Beobachtung der Probe empfehlen wir eine 100-WattQuecksilberdampflampe
und Plan Achromat Objektive mit 63-facher oder 100-facher
Vergrößerung. Das Dreifach-Bandpasssfilter DAPI/FITC/TRITC ist für die simultane
Beobachtung der grünen und orangen Fluorophore sowie der Gegenfärbung optimal
geeignet. Das blaue Fluorophor hat eine Spezifität gegennüber dem Aqua- oder DEACSpektrum
(ein Aqua- oder DEAC-Einfach-Bandpassfilter ist erforderlich). Das DreifachBandpasssfilter
DAPI/FITC/Texasrot ist für die simultane Beobachtung aller drei Fluorophore
und DAPI optimal geeignet.
Probeneignung und Entnahme
Das Pränatalkit ist für die Verwendung an nicht kultivierten Amniocyten, die in Carnoy’s
Fixativ fixiert sind, ausgelegt (siehe folgendes Verfahren). Die Entnahme von
Fruchtwasserproben sollte gemäß den Richtlinien des jeweiligen Labors oder der jeweiligen
Einrichtung erfolgen.
Fruchtwasserproben, die blutig oder braun scheinen, sind nicht zu verwenden, da sie Blut
der Mutter enthalten könnten und somit die Ergebnisse verfälscht werden könnten.
Empfohlenes Protokoll
Vorbereitung von frischen Fruchtwasserproben für FISH:
1. Zentrifugieren Sie 2 - 5ml der gesamten Fruchtwasserprobe 7 Minuten lang bei 180xg;
entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand, ohne das Zellpellet aufzuwirbeln.
2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 2ml 0,075M KCl. Für 5 Minuten bei
Zimmertemperatur stehen lassen.
3. Geben Sie 2ml frisches Fixativ (3:1 – Methanol:Eisessig) zu den Zellen/der
hypotonischen Lösung, wobei Sie den ersten ml tropfenweise unter ständigem Rühren
zugeben. Mischen Sie das Ganze gut.
4. Zentrifugieren Sie die Suspension für 5 Minuten bei 280xg, entfernen Sie den
Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Pellet in 2ml frischem Fixativ.
5. Fixierte Proben können in diesem Zustand bei -20ºC in einem Gefrierschrank
aufbewahrt werden.
6. Wenn die Probe nicht eingefroren werden soll, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei
280xg für 5 Minuten. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne dabei das
Zellpellet aufzuwirbeln. Schnippen Sie mit dem Finger gegen das Röhrchen, um das
Pellet in der geringen Menge verbleibender Flüssigkeit zu resuspendieren.
7. Zur Vorbereitung von Objektträgern für FISH tropfen Sie die Zellsuspension direkt auf
den Objektträger. An der Luft trocknen lassen.
Empfohlene Vorbehandlung des Objektträgers:
1. Tauchen Sie den aus nicht kultivierten Amniocyten gewonnenen Objektträger 2
Minuten bei 37ºC in 2xSSC.
2. Legen Sie den Objektträger dann 13 Minuten lang bei 37ºC in frisch vorbereitete
Pepsin-Arbeitslösung (5mg Pepsin werden in 100ml 0,01M HCl gegeben).
3. Tauchen Sie den Objektträger bei Zimmertemperatur für 5 Minuten in
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
DS154/CE v002.00/2014-09-15
Page 5 of 6
4. Tauchen Sie den Objektträger für 5 Minuten bei Zimmertemperatur in
Nachfixierungslösung (0,95% Formaldehyd: 1,0ml 37% Formaldehyd, 0,18g MgCl2 und
39,0ml PBS).
5. Tauchen Sie den Objektträger bei Zimmertemperatur für 5 Minuten in PBS.
6. Tauchen Sie den Objektträger bei Zimmertemperatur in 70%iges Ethanol. Lassen Sie
den Objektträger 1 Minute lang in der Ethanol-Waschlösung stehen.
7. Nehmen Sie den Objektträger aus dem 70%igen Ethanol. Wiederholen Sie Schritt 6 mit
85%igem Ethanol und dann mit 100%igem Ethanol.
8. An der Luft trocknen lassen.
FISH-Protokoll
(Hinweis: Bitte stellen Sie sicher, dass die Sonde nur in begrenztem Umfang der Strahlung
von Laborlampen ausgesetzt ist.)
Vorbereitung des Objektträgers (überspringen Sie diesen Schritt, wenn der
Objektträger gemäß dem obigen Protokoll vorbehandelt wurde)
1. Zellprobe auf gereinigten Mikroskop-Objektträger auftropfen Trocknen lassen.
2. Objektträger bei Zimmertemperatur 2 Minuten lang ohne Schütteln in 2xSSC
eintauchen.
3. Entwässern in Alkoholreihe (70%, 85% und 100%), jeweils 2 Minuten bei
Zimmertemperatur.
4. Trocknen lassen.
Vordenaturierung
5. Sonde aus dem Gefrierschrank nehmen und auf Zimmertemperatur aufwärmen lassen.
6. Durch Mischen mit Pipette sicherstellen, dass die Sondenlösung homogen gemischt ist.
7. Pro Test 10µl Sonde entnehmen und in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben. Restliche
Sonde schnell zurück in den Gefrierschrank legen.
8. Sonde und Probenobjektträger zum Vorwärmen 5 Minuten lang auf eine 37ºC (+/- 1ºC)
warme Heizplatte stellen.
9. 10µl Sondenmischung auf die Zellprobe auftropfen und Deckglas sorgfältig auflegen.
Mit Gummikleber-Lösung versiegeln und vollständig trocknen lassen.
Denaturierung
10. Probe und Sonde gleichzeitig durch 2 Minuten langes Erwärmen des Objektträgers auf
einer 75ºC (+/- 1ºC) warmen Heizplatte denaturieren.
Hybridisierung
11. Den Objektträger 2 Stunden lang bei 37ºC (+/- 1ºC) in eine feuchte, lichtdichte Kammer
geben.
Waschen nach der Hybridisierung
12. Deckglas und alle Kleberspuren vorsichtig entfernen.
13. Objektträger 2 Minuten lang bei 72ºC (+/- 1ºC) in 0,4xSSC (pH 7,0) waschen.
14. Objektträger abtropfen lassen und 30 Sekunden bei Zimmertemperatur in 2xSSC,
0,05% Tween-20 (pH 7,0), waschen.
15. Objektträger abtropfen lassen und 10µl DAPI Antifade zu jeder Probe geben.
16. Mit einem Deckglas abdecken, die Luftblasen entfernen and die Farbe 10 Minuten lang
im Dunkeln entwickeln lassen.
17. Unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachten.
Stabilität der fertigen Objektträger
Objektträger mit FISH-Proben können bis zu einem Monat lang analysiert werden, wenn sie
im Dunkeln bei oder unter Zimmertemperatur aufbewahrt werden.
Empfehlungen zur Durchführung
1. Wärmebehandlung oder Reifung der Proben ist nicht empfehlenswert, da dies zu einer
verminderten Signalfluoreszenz führen kann.
2. Durch die Verwendung von Reagenzien, die nicht von Cytocell Ltd. empfohlensind,
können die Hybridisierungsbedingungen negativ beeinflusst werden.
3. Es wird dringend empfohlen, zur Temperaturmessung von Lösungen, Wasserbädern
und Inkubatoren ein geeichtes Thermometer zu verwenden, da diese Temperaturen für
die optimale Leistung des Produkts ausschlaggebend sind.
4. Die Konzentration der Waschlösungen, pH und Temperatur sind wichtig, da niedrig
stringente Bedingungen zu nicht spezifischer Bindung der Sonde führen kann und zu
hohe Stringenz zum Verlust des Signals.
5. Unvollständige Denaturierung kann zu einem Verlust des Signals führen und
übermäßige Denaturierung kann zu nicht spezifischer Bindung der Sonde führen.
Interpretation der Ergebnisse
Die Empfindlichkeit und Spezifität des FISH Tests hängt von einer Reihe von Parametern
ab, die von Zelltyp zu Zelltyp, von Sonde zu Sonde sowie entsprechend den verwendeten
Zelltechniken und dem jeweiligen Labor unterschiedlich sind. Wir empfehlen daher, dass das
Pränatalkit verwendet wird und dass jedes Labor seine eigenen Standardmaterialien
verwenden und seine eigenen Cutoff-Werte für karyotypisch normale und aneuploide
Zellproben für den FISH Assay bestimmen sollte (erfragen Sie Richtlinien direkt von
Cytocell).
Zu erwartende Ergebnisse
Eine normale weibliche Zelle sollte 2 grüne und 2 blaue Signale (2G, 2B) aufweisen. Eine
normale männliche Zelle sollte 1 grünes, 1 oranges und 2 blaue Signale (1G, 1O, 2B) Zellen
mit Trisomie 18 sollten 2 grüne und 3 blaue Signale (2G, 3B) bei weiblichen Proben und 1
grünes, 1 oranges, 3 blaue (1G, 1O, 3B) bei männlichen Proben aufweisen.Mehrere
unterschiedliche Kombinationen von Signalmustern sind bei X- und Y-Chromosomen
möglich, die sich von den oben dargestellten normalen Signalmustern unterscheiden.
Einschränkungen
Dieser Test weist weder strukturelle Chromosomanomalien noch Mosaizismen nach.
Er weist auch keine numerischen Aberrationen von Chromosomen nach, auf die nicht
getestet wird.
Der Test ist nicht zur Einschätzung des Risikos einer Trisomie geeignet.
Protokollierung und Interpretation der FISH-Tests müssen den fachlichen Standards für die
Praxis entsprechen und unter Berücksichtigung anderer klinischer und diagnostischer
Informationen erfolgen.
Der Test ist als Ergänzung zur klassischen Zytogenetik gedacht. Daher sollten
therapeutische Maßnahmen nicht allein auf Grundlage der FISH-Ergebnisse eingeleitet
werden.
Weitere Informationen:
Weitere Produktinformationen erhalten Sie vom Technischen Kundendienst von Cytocell.
T: +44 (0)1223 294048
E: techsupport@cytocell.com
W: www.cytocell.com
ESPAÑOL
La hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH) es una técnica que permite detectar
secuencias de ADN en cromosomas metafásicos o núcleos en interfase de muestras
citogenéticas fijadas. La técnica emplea sondas de ADN que se hibridan con cromosomas
enteros o con secuencias únicas y es una poderosa prueba complementaria para la
citogenética clásica. Los recientes avances han conseguido que esta valiosa técnica pueda
aplicarse ahora como herramienta esencial de diagnóstico para el análisis de cromosomas
prenatal, hematológico y patológico. El ADN diana después de ser fijado y desnaturalizado
queda listo para hibridarse con una sonda de ADN, también desnaturalizada y marcada con
fluorescencia, de secuencia complementaria. Después de la hibridación, la sonda de ADN
unida inespecíficamente y no unida se lava y posteriormente se aplica una contratinción al
ADN para su visualización. El uso de un microscopio de fluorescencia permite la
visualización de la sonda hibridada en el material diana.
Información sobre las sondas
El kit Cytocell FAST FISH Prenatal Enumeración Probe es un análisis prenatal para la
detección rápida de las trisomía 18 que se encuentran en los síndromes de Edward,
además de aneuploidías en los cromosomas sexuales (por ejemplo los síndromes de
Klinefelter y Turner). Los conjuntos de sondas han sido diseñados para la detección y la
cuantificación mediante FISH de los cromosomas 18, X e Y de los núcleos en interfase de
las células de líquido amniótico no cultivadas. La prueba debe emplearse junto con el
análisis cariotípico fetal.
Especificaciones de las sondas
Región satélite α del centrómero de X Xp11.1 – q11.1 (DXZ1) verde
Región satélite α del centrómero de Y Yp11.1 – q11.1 (DYZ3) naranja
Región satélite α del centrómero de 18 18p11.1 – q11.1 (D18Z1) azul
El conjunto de sondas X, Y y 18 es una mezcla de sondas de ADN fluorescentes
directamente marcadas de color verde, naranja y azul específicas para las secuencias de
ADN satélite alfa de las regiones DXZ1, DYZ3 y D18Z1 de los cromosomas X, Y y 18
respectivamente.
Material incluido
Sonda: 50µl por vial (5 análisis) o 100µl por vial (10 análisis)
Cantidad de satélite α del centrómero de X (DXZ1) verde sonda: 60 – 75ng/análisis
Cantidad de satélite α del centrómero de Y (DYZ3) naranja sonda: 40 – 50ng/análisis
Cantidad de satélite α del centrómero de 18 (D18Z1) azul sonda: 280 – 350ng/análisis
Las sondas se presentan premezcladas en la solución de hibridación (formamida; sulfato de
dextrano; SSC) y listas para usar.
Contratinción: 150µl por vial (15 análisis)
La tinción se realiza con DAPI Antifade (ES: 0,125µg/ml de DAPI (4,6-diamidino-2-
fenilindol)).
Advertencias y precauciones
1. Para diagnóstico in vitro. Sólo para uso profesional.
2. Utilizar guantes al manipular las sondas de ADN y la contratinción DAPI.
3. Las soluciones de las sondas contienen formamida, que es teratógena; no respire los
vapores y evite el contacto con la piel. Utilice guantes y bata de laboratorio con una
campana de ventilación. Al desechar, lave abundantemente con agua.
4. El DAPI puede producir cáncer. Manipúlelo con cuidado; utilice guantes y bata de
laboratorio. Al desechar, lave abundantemente con agua.
5. Las sustancias peligrosas deben eliminarse de acuerdo con las directrices de su
institución sobre la eliminación de residuos peligrosos.
Almacenamiento y manipulación
El kit Aquarius
®
debe almacenarse a -20ºC hasta la fecha de caducidad que se indica en la
etiqueta del kit. Los viales de las sondas y de la contratinción deben almacenarse en un
lugar oscuro.
Material necesario pero no incluido
1. Placa calefactora (con una placa estable y un control de temperatura preciso hasta
80ºC).
2. Micropipetas y puntas de volumen variable (de 1µl a 200µl).
3. Baño maría con control preciso de temperatura a 37ºC y 72ºC.
4. Tubos de microcentrifugación (0,5ml).
5. Microscopio de fluorescencia (véase la sección Recomendaciones sobre el
microscopio de fluorescencia).
6. Cubetas Coplin de cristal y de plástico.
7. Pinzas.
8. Aceite de inmersión para objetivos de microscopio de fluorescencia.
9. Centrífuga sobremesa.
10. Portaobjetos para microscopio.
11. Cubreobjetos de 24x24mm.
12. Temporizador.
13. Incubadora a 37ºC.
14. Pegamento de solución de caucho.
Recomendaciones sobre el microscopio de fluorescencia
Para una visualización óptima de la sonda, se recomienda utilizar una lámpara de mercurio
de 100 vatios y objetivos Plan-Apochromat de 63 o 100 aumentos. El triple filtro pasabanda
DAPI/FITC/TRITC es la mejor solución para visualizar simultáneamente los fluorocromos
naranja y verde y la contratinción. El fluorocromo azul tiene especificidad por el espectro
Aqua o DEAC (se necesita filtro pasabanda sencillo Aqua o DEAC). El triple filtro pasabanda
DAPI/FITC/Texas Red puede emplearse para visualizar simultáneamente los tres
fluorocromos y DAPI.
Preparación de las muestras
El kit prenatal está diseñado para su uso con amniocitos no cultivados fijados con fijador de
Carnoy (véase el procedimiento más abajo). La obtención de las muestras de líquido
amniótico debe realizarse de conformidad con las directrices de la institución.
Las muestras de líquido amniótico que presenten un aspecto sanguinolento o marrón no
deben utilizarse, ya que pueden contener sangre materna y pueden producir resultados
incorrectos.
Protocolo propuesto
Preparación de muestras de líquido amniótico recientes para FISH:
1. Centrifugue 2 - 5ml extraídos de la muestra total del líquido amniótico durante 7
minutos a 180xg, extraiga con cuidado el sobrenadante sin afectar al sedimento
celular.
2. Resuspenda el sedimento en 2ml de KCl a 0,075M. Deje reposar a temperatura
ambiente (TA) durante 5 minutos.
3. Añada 2ml de fijador reciente (metanol:ácido acético glacial en proporción 3:1) a las
células/solución hipotónica, agregando el primer ml gota a gota mientras se sigue
mezclando sin parar. Mezcle bien.
4. Centrifugue la suspensión durante 5 minutos a 280xg, retirando con cuidado el
sobrenadante y resuspendiendo el sedimento en 2ml de fijador reciente.
5. En este punto, las muestras fijadas pueden almacenarse en un congelador a -20ºC.
6. Si la muestra no va a congelarse, centrifugue el tubo a 280xg durante 5 minutos. Retire
todo el sobrenadante que pueda sin afectar al sedimento celular. Sacuda el tubo para
resuspender el sedimento en la pequeña cantidad de líquido restante.
7. Para preparar los portaobjetos para FISH, vierta la suspensión celular directamente
sobre el portaobjetos. Deje que se seque al aire.
Pretratamiento del portaobjetos recomendado:
1. Sumerja el portaobjetos preparado a partir de amniocitos no cultivados en 2xSSC
durante 2 minutos a 37ºC.
2. Coloque el portaobjetos en solución de trabajo de pepsina recién preparada (5mg de
pepsina añadidos a 100ml de HCl a 0,01M) durante 13 minutos a 37ºC.
3. Sumerja el portaobjetos en solución salina con tampón fosfato (PBS) a TA durante 5
minutos.
DS154/CE v002.00/2014-09-15
Page 6 of 6
4. Sumerja el portaobjetos en solución de posfijación (formaldehído a 0,95%: 1,0ml de
formaldehído a 37%, 0,18g de MgCl2 y 39,0ml de PBS) durante 5 minutos a TA.
5. Sumerja el portaobjetos con PBS a TA durante 5 minutos.
6. Sumerja el portaobjetos en etanol al 70% a TA. Deje el portaobjetos sumergido en el
baño de etanol durante 1 minuto.
7. Retire el portaobjetos del etanol al 70%. Repita el paso 6 con etanol al 85%, seguido
de etanol al 100%.
8. Deje secar al aire.
Protocolo para la FISH
(Observación: asegúrese de limitar la exposición de la sonda a las luces del laboratorio en
todo momento)
Preparación de los portaobjetos (omita este paso si el portaobjetos ha sido pretratado
según el protocolo anterior)
1. Vierta la muestra de células sobre un portaobjetos. Deje secar.
2. Sumerja el portaobjetos en 2xSSC durante 2 minutos a TA sin agitar.
3. Deshidrate en soluciones graduales de etanol (70%, 85% y 100%), durante 2 minutos
en cada una a TA.
4. Deje secar.
Antes de la desnaturalización
5. Saque la sonda del congelador a -20ºC y deje que se caliente a TA.
6. Asegúrese de que la solución de la sonda queda homogéneamente mezclada con una
pipeta.
7. Extraiga 10µl de la sonda por análisis e introdúzcalos en un tubo de
microcentrifugación. Rápidamente vuelva a almacenar el resto de la sonda a -20ºC.
8. Precaliente la sonda y el portaobjetos de la muestra en una placa calefactora a 37ºC
(+/- 1ºC) durante 5 minutos.
9. Vierta 10µl de la solución de la sonda sobre la muestra de células y coloque
cuidadosamente un cubreobjetos. Selle con pegamento de solución de caucho y deje
que el pegamento se seque completamente.
Desnaturalización
10. Desnaturalice la muestra y la sonda simultáneamente calentando el porta sobre la
placa calefactora a 75ºC (+/- 1ºC) durante 2 minutos.
Hibridación
11. Introduzca el porta en un recipiente húmedo y opaco a 37ºC (+/- 1ºC) y déjelo 2 horas.
Lavados posthibridación
12. Quite el cubreobjetos y los restos del pegamento cuidadosamente.
13. Sumerja el portaobjetos en 0,4xSSC (pH 7,0) a 72ºC (+/- 1ºC) durante 2 minutos sin
agitar.
14. Deje escurrir el portaobjetos y sumérjalo en 2xSSC, 0,05% de Tween-20 (pH 7,0) a TA
durante 30 segundos sin agitar.
15. Escurra el portaobjetos y añada 10µl de DAPI antifade sobre cada muestra.
16. Coloque un cubreobjetos, extraiga las burbujas y deje revelar el color en un lugar
oscuro durante 10 minutos.
17. Visualice con un microscopio de fluorescencia.
Estabilidad de los portaobjetos terminados
Los portaobjetos sometidos a la técnica FISH pueden analizarse durante 1 mes si se
conservan en un lugar oscuro y a TA o inferior.
Recomendaciones para los procedimientos
1. No se recomienda calentar ni dejar envejecer los portaobjetos ya que se podría reducir
la fluorescencia de la señal.
2. Las condiciones de hibridación pueden verse afectadas negativamente si se emplean
reactivos distintos de los suministrados o recomendados por Cytocell Ltd.
3. Se recomienda encarecidamente el uso de un termómetro de precisión para medir las
temperaturas de soluciones, baños maría e incubadores ya que estas temperaturas
son cruciales para un resultado óptimo del producto.
4. Las concentraciones de los lavados, el pH y las temperaturas son importantes ya que
unas condiciones poco rigurosas pueden provocar una hibridación inespecífica de la
sonda y unas condiciones demasiado rigurosas pueden derivar en una falta de señal.
5. Una desnaturalización incompleta puede provocar falta de señal y una
desnaturalización excesiva también puede originar una hibridación inespecífica.
Interpretación de los resultados
La sensibilidad y la especificidad de la FISH dependen de varios parámetros, que difieren
dependiendo del tipo celular, de la sonda, de las técnicas celulares y del laboratorio en que
se realice. Por lo tanto, a la hora de emplear el kit prenatal, se recomienda que cada
laboratorio prepare su propio material estándar y que determine sus propios valores de corte
de la prueba FISH para las muestras cariotípicamente normales y aneuploides (si desea que
se le faciliten pautas, póngase en contacto con Cytocell).
Resultados esperados
Una célula femenina normal debe mostrar 2 señales verdes y 2 azules (2V, 2A). Una célula
masculina normal debe mostrar 1 señal verde, 1 naranja y 2 azules (1V, 1N y 2A). Las
células con trisomía del cromosoma 18 deben mostrar 2 señales verdes y 3 azules (2V, 3A)
para las muestras femeninas y 1 verde, 1 naranja, 3 azules (1V, 1N, 3A) para las muestras
masculinas. Existen muchas combinaciones diferentes de patrones de señales posibles
para los cromosomas X e Y además de los patrones normales indicados anteriormente
Limitaciones
Esta prueba no detecta las anomalías cromosómicas estructurales ni el mosaicismo.
Tampoco detecta las anomalías numéricas de los cromosomas que no se analizan.
La prueba no está diseñada para valorar el riesgo de trisomía.
Los informes y la interpretación de los resultados de los análisis FISH deben respetar las
normas de la práctica profesional y deben tomar en consideración otros informes clínicos y
diagnósticos.
Este kit se ha concebido como una prueba complementaria a otros análisis de laboratorio y
no deben tomarse medidas terapéuticas basándose únicamente en el resultado de la FISH.
Información adicional
Si desea obtener información adicional sobre el producto, póngase en contacto con el
Departamento de soporte técnico de Cytocell.
T: +44 (0)1223 294048
E: techsupport@cytocell.com
W: www.cytocell.com
References/Bibliographie/Bibliographia/Literatur/Bibliografía
1. http://www.ojrd.com/content/7/1/81/abstract
2. Cereda and Carey. Orphanet J Rare Dis 2012; 7:81
3. Visootsak and Graham. Orphanet Journal of Rare Diseases 2006, 1:42
REF
EN: Catalogue number
DE: Bestellnummer
FR: Référence du catalogue
IT: Numero di catalogo
ES: Número de catálogo
EN: In vitro diagnostic device
DE: In-vitro-Diagnostikum
FR: Dispositif médical de diagnostic in vitro
IT: Dispositivo medico-diagnosticoin vitro
ES: Producto sanitario para diagnóstico in vitro
EN: Batch code
DE: Ch.-B.
FR: Code du lot
IT: Codice lotto
ES: Código de lote
EN: Consult instructions for use
DE: Gebrauchsanweisung beachten
FR: Consulter la notice d'utilisation
IT: Consultare le istruzioni per l'uso
ES: Consulte las instrucciones de uso
EN: Manufacturer
DE: Hersteller
FR: Fabricant
IT: Prodotto da
ES: Fabricante
EN: Use by
DE: Haltbarkeitsdatum
FR: A utiliser avant
IT: Scadenza
ES: Fecha de caducidad
EN: Temperature limitation
DE: Temperaturbegrenzung
FR: Limites de température
IT: Limiti di temperatura
ES: Limitación de temperatura
EN: Sufficient for <n> tests
DE: Ausreichend für <n> Tests
FR: Suffisant pour <n> tests
IT: Sufficiente per <n> test
ES: Válido para <n> análisis
EN: Contents
DE: Inhalt
FR: Contenu
IT: Contenuto
ES: Contenido
Patents and Trademarks
Aquarius and Cytocell are registered trademarks of Cytocell Ltd.
Cytocell Ltd.
3-4 Technopark
Newmarket Road
Cambridge, CB5 8PB, UK.
T: +44(0)1223 294048
F: +44(0)1223 294986
E: probes@cytocell.com
W: www.cytocell.com
CONT