Studium mikrobiálních genomů elektromigračními metodami doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. Přírodovědecká fakulta MU, 2017 bartos.milan@atlas.cz Obsah přednášky 1) Elektroforéza – základní informace 2)Typy elektroforéz 3)Stanovení velikosti fragmentů elektroforézou 4)Různé typy barvení gelů 5)Pulsní gelová elektroforéza 6)Denaturační elektroforéza 7)Kapilární elektroforéza Doporučená literatura Brown (2010): Gene Cloning & DNA Analysis. Wiley-Blackwell, Sixth edition MCj03701400000[1] Green and Sambrook (2012): Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, USA, 4. vydání Elektroforéza nukleových kyselin Studenti0001 Princip elektroforézy •Pohyb nabitých molekul v elektrickém poli - + •Dělení molekul na základě rozdílných pohyblivostí, které závisí na: náboji, velikosti (hmotnosti) a tvaru Dělení podle prostředí •Volná elektroforéza (v roztoku) •Zónová elektroforéza (na nosiči, gelová) Volná elektroforéza + - A + B + C - + A + B + C A + B A C B + C Zónová elektroforéza + - A+B+C + - C B A Dělení podle uspořádání •Vertikální •Horizontální + - + - •Kapilární Vlastnosti elektroforézy ØZ praktických důvodů se elektroforéza neprovádí přímo v roztoku, ale na vhodném nosiči (většinou gel) ØPro přípravu gelu jsou výhodné látky, které samy gelují a mají různou porozitu v závislosti na koncentraci gelu Gely a pohyb částic v nich Øagaróza nebo polyakrylamid Øsíťovitá struktura – koncentrace polymeru Øagarózové gely = stovky až 50 kbp Øpolyakrylamid = 10 až 1 000 bp - + > Co musí splňovat gely ØHomogenní ØInertní, tj. bez nespecifických interakcí ØMechanicky pevné ØTransparentní ØReprodukovatelná a snadná příprava Výhody elektroforézy ØElektroforetické metody nahradily ultracentrifugaci ØAparatury jsou levné, často je lze vyrábět svépomocí ØDělit lze všechny důležité biomakromolekuly ØZměnou podmínek lze dělit podle různých hledisek ØRychlost ØLze pracovat s malými množstvími nebo preparativně v mikrogramových množstvích ØRozdělené molekuly lze snadno prokázat a ve funkční formě izolovat z gelu Ø Elektroforéza nukleových kyselin •Optimální velikost separovaných molekul Øje nepřímo úměrná logaritmu velikosti molekul => nutné porovnání s velikostními standardy Øagarózové gely 100 bp až 50 000 bp Øpolyakrylamidové gely 10 až 1 000 bp •Rychlost pohybu makromolekul Ø Vztah mezi velikostí DNA a pohyblivostí při elektroforéze BEZJMÉ~2 •Čím menší molekula, tím dál uběhne Ø MCj03701400000[1] •Pohyblivost závisí na hustotě gelu Ø –Zkuste stanovit MCAN00610_0000[1] •Zadání je zde Elektroforézu budeme dělat ve cvičení a tam si i započítáte, teď si zkuste velmi jednoduchou úlohu [USEMAP] 257 bp Vizualizace nukleových kyselin Øethidiumbromid ØSYBR GREEN Østříbro UV (256,312nm) Ethidiumbromide 590nm ELFO Vlastnosti ethidiumbromidu ØVáže se jak na DNA, tak i na RNA ØPo vytvoření komplexu EtBr-DNA je pozorována ~20 – 30x vyšší fluorescence ØCitlivost 1-5 ng DNA, 5 ng RNA (256 nm) ØPolyakrylamid zháší fluorescenci EtBr, není možné detekovat méně jak 10 ng DNA Interkalace ethidiumbromidu Navlékání interkalátorů Interkalátor GelRedTM GelRed_chemical_structure Wikimedia Commons © Barvivo SYBR Green I Ø vysoká afinita k NA Ø 1000x vyšší fluorescence po vazbě na NA Ø 25 - 100x citlivější než EtBr ob124a12 Ø vhodné pro dsDNA, ssDNA a RNA Ø 60 pg dsDNA nebo 1 ng RNA (při 300 nm) Ø mnohem méně mutagenní než EtBr Srovnání citlivosti SYBR Green I a EtBr SYBR EtBr Barvení stříbrem ØBarvení NA stříbrem má mírně vyšší citlivost než barvením EtBr ØLepší citlivost u polyakrylamidových gelů (100 pg DNA) než u agarózových Ø vhodné pro dsDNA, ssDNA a RNA • silver Využití elektroforézy Ø separace molekul Ø studium struktury DNA Ø studium interakcí mezi NA a proteiny Plasmidové formy L-forma CCC-forma Elektroforéza - animace •http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html Pulsní gelová elektroforéza - - - + + + Øurčena k dělení velkých fragmentů DNA a chromozómů (nad 50 kbp, stovky kbp, megabáze) - + Aparatura na PFGE Snímek 003 •Pěkná animace znázorňující pohyb DNA v pulsním poli je na http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/pulse_field.html Jak se provádí PFGE •1) Buňky se naředí na vhodnou koncentraci •2) Buňky se zalijí do agarózy •3) Agarózové bločky se opracují enzymy – lyze, deproteinace •4) Na genomovou DNA v bločcích se aplikují restriktázy Jak se provádí PFGE •5) Bločky s rozštěpenou genomovou DNA se nanesou na elektroforézu - + Příklad aplikace PFGE •Diferenciace mykobakterií po štěpení NotI DNA fingerprint Ønástroj pro epidemiology a epizootology Ønezbytná počítačová analýza dat Østanovení fylogenetické příbuznosti •! porovnej s RFLP ! Jiný příklad aplikace PFGE •Diferenciace Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis po štěpení SnaBI, SpeI • ØPokus odlišit RFLP typy B-C1 PFGE2 •Diferenciace Mycobacterium avium subsp. hominissuis po štěpení XbaI, DraI • ØStudium genetické diversity kmenů izolovaných u pacientů s AIDS Jak se vyhodnocují fragmenty získané po PFGE? Analýza změn ve fragmentu 4 000 bp Velikosti fragmentů Počet změn 0 3 3 2 2 6000 5000 4000 2500 2000 1500 1000 750 + RE - RE 4000 2500 1500 6000 4500 3500 +500 -500 C:\Program Files (x86)\Microsoft Office\MEDIA\CAGCAT10\j0195384.wmf Vliv mutace na PFGE spektrum •Mutace •Výsledek Øbodová +RE Øztráta fragmentu + 2 nové Øinzerce Østejný počet fragmentů, ale jeden se „prodlouží“ o délku inzerce Øbodová -RE • Øztráta 2 fragmentů + 1 větší nový Ødelece Østejný počet fragmentů, ale jeden se „zkrátí“ o délku delece Ø Kritéria pro epidemiologii •Tenover et al. (1995): Journal of Clinical Microbiology 33 (9), 2233-2239 Kategorie Počet genetických změn Počet změn v PFGE Epidemiologie Neodlišitelné 0 0 Součást ohniska Blízce příbuzné 1 2-3 Pravděpodobně (probably) součást ohniska Asi příbuzné 2 4-6 Možná (possibly) součást ohniska Odlišné ≥ 3 ≥ 7 Mimo ohnisko Tenover et al. (1995): Interpreting Chromosomal DNA Restriction Patterns Produced by Pulsed-Field Gel Electrophoresis: Criteria for Bacterial Strain Typing. Journal of Clinical Microbiology 33 (9), 2233-2239 Denaturační gelová elektroforéza ØV přítomnosti denaturačního činidla (formamid, močovina) během elektroforézy DNA zvolna denaturuje ØVznikají lokální větvené struktury s jednořetězcovou strukturou ØStejně dlouhé molekuly o různé sekvenci vytvářejí rozdílné struktury a pohybují se různou rychlostí ØLze dosáhnout detekce rozdílů až jediného bp •Podobný efekt má gradient teploty Elektroforéza se uplatňuje při sekvenování nukleových kyselin Ødesítky až stovky párů bazí Ødenaturující polyakrylamidové gely (močovina) Ømoderní metody využívají kapilární gelové elektroforézy Sekvenator1 Sequencing gel Existuje taky elektroforéza proteinů Øpolyakrylamidové gely denaturující a nedenaturující Ørůzné způsoby detekce – Comassie briliant blue, stříbro Fig1 •Více si o elektroforéze proteinů řekneme ke konci semestru Příklady využití elektroforézy •Jsou obsahem přednášky pro 5. ročník MCAN00610_0000[1] ØPolymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) ØPolymorfismus délky amplifikvaných fragmentů (AFLP) ØPolymorfismus délky fragmentů DNA vytvořených cleavázou (CFLP) ØPolymorfismus konformace jednořetězců (CSCP) ØPolymorfismus konformace dvouřetězců (DSCP) A tak to někdy taky chodí … A tak to někdy taky chodí … A tak to někdy taky chodí … A tak to někdy taky chodí … A tak to někdy taky chodí … A tak to někdy taky chodí … A tak to někdy taky chodí … A tak to někdy taky chodí … Shrnutí 1) Elektroforéza – základní informace 2)Typy elektroforéz 3)Stanovení velikosti fragmentů elektroforézou 4)Různé typy barvení gelů 5)Pulsní gelová elektroforéza 6)Denaturační elektroforéza 7)Kapilární elektroforéza MCj03701400000[1]