Hybrídizace nejen pro mikroby doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. Bartoš.Milan@atlas.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2017 Obsah přednášky 1) Způsoby provedení hybridizace 2) Hybridizace v roztoku 3) Příprava značených sond 4) Hybridizace na pevném povrchu 5) Southernův přenos 6) Fluorescentní in situ hybridizace literatura Tentokrát se musíte spolehnout na základní literaturu + odkazy na odborné publikace uvedené v přednášce Hybridizace > reasociace dvou jednořetězcových DNA nebo RNA, pokud mají jejich sekvence úplně nebo částečně komplementární báze i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i j > nemyslí se jí ale spojování jednořetězců, které byly součástí téže molekuly = renaturace Hybridizace je založena na schopnosti NA denaturovat a renaturovat dvojšroubovice DNA teplota nebo vysoké pH denaturace na jednoduché řetězce (po narušení nukleotidových párů) renaturací se obnoví dvojšroubovice DNA (znovu se spojí nukleotidové páry) © Espero Publishing, s.r.o. Co to je denaturace DNA > oddělení komplementárních vláken DNA působením vysoké teploty (90-100°C), extrémních hodnot pH nebo denaturačních činidel (formamid, močovina) > Při denaturaci se zvyšuje absopce světla při vlnové délce 260 nm (tzv. hyperchromní efekt) > Je to důsledek změny v uspořádání bází Co to je hyperchromní efekt > Spojené řetězce snižují absorbanci > Při denaturaci absorbance stoupá o 30-40% > Řetězce drží pevně pohromadě dokud se nedosáhne Tm, pak se duplex rychle rozpadá Temperature, °C http://members.tripod.com/arnold_dion/RecD NA/Fig1-7.gif Co to je renaturace DNA > opětná tvorba dvou řetězcových struktur z jednořetězcových polynukleotidů za vhodných připojovacích („annealing") podmínek > nastává při pomalém ochlazování (65°C) roztoku teplem denaturované DNA > nenastává při prudkém ochlazení roztoku denaturované DNA > při renaturaci se mohou tvořit hybridní molekuly DNA/DNA, RNA/RNA i DNA/RNA > rozsah renaturace odpovídá rozsahu komplementarity sekvencí Faktory ovlivňující tvorbu hybridů > teplota > koncentrace solí > stupeň komplementarity > délka fragmentů DMA (a) DNA is denatured by heating G A C T (b) 5' (c) RNA (u) 5J G C A U DNA/ftNA hybrid RNA strand DNA strand Renaturation on cooling 3' I 5' 5'. Hybridization J 5' Nucleic flcid Hybridization Využití hybridizace > test komplementarity sekvencí (ve směsi mnoha molekul DNA budou hybridizovat jen ty, které jsou dostatečně komplementární) > detekce molekul DNA a RNA, které jsou komplementární k jakékoliv izolované nukleové kyselině > vyhledávání sekvencí v genových knihovnách > vyhledávání sekvencí v cytologických preparátech > charakterizace sekvencí > mapování genomu > při polymerázové řetězové reakci Typy hybridizací > hybridizace v roztoku > hybridizace na pevném povrchu > hybridizace in situ (FISH) - mapování chromozómů a specifických lokusů > DNA, RNA arrays Hybridizace v roztoku Samotná se téměř nevyužívá, většinou spojená s další detekční technikou > S1 mapování (detekce exonů a intronů hybridu D N A/m RNA) > Denaturační gradiendová gelová elektroforéza (DGGE) > Heteroduplexní analýza S1 mapovaní Význam pro mapování složených genů :: • "r T DNA-RNA hybrid S1 nuclease 4^ Single-stranded DNA regions %Í^ÍGijXim^nni^^ are digested Alkali to degrade RNA Single-stranded DNA fragments that were protected by the RNA http://bioweb.wku.edu/courses/Biol350/Transcriptome17/lmagees/F11_004.jpg Mají bakterie složené geny? Nemůžu žádný příklad najít. Ale naše přednáška je o mikroorganismech, nejen o bakteriích. A kvasinky složené geny mají! DGGE > Páry CG drží více pohromadě než páry TA i i i Heannealioy o< sngJe straods i homoduplox hoíerodupiex heteroduplex hornaM** JMamngb^iavtouř wrt/iMl wťm m/m l I-K.U..V.IÍ.0 .).'-: ■ ,.• lili Horririilupteíes (b) Podobně funguje TGGE Analýza heteroduplexů > Molekuly dsDNA vznikají z řetězců, které pocházejí z různých zdrojů > Výsledné struktury nejsou 100% komplementární, z toho plyne označení heteroduplex > Obsahují smyčky a bubliny v oblastech, kde se sekvence DNA liší > Struktury lze pozorovat mikroskopicky -heteroduplexní mapování Podívejte se na heteroduplexní mapování v základní učebnici Analýza heteroduplexů Heteroduplexy se pohybují pomaleji než homoduplexy Analýza heteroduplexů Homoduplexy a heteroduplexy lze rozlišit i kapilární elektroforézou Temperature M od u late d Heťeroduplex Analysis Wldtypé Mirtant Hedéřúduptexěs HorrodupLexes umu 4 S & Raíento lima (mih) Hybridizace na pevném povrchu > Probíhá na speciální membráně > Vzorek se nanáší přímo na membránu = tečková hybridizace (dot blot) > Vzorek se rozdělí na gelu a pak se přenese na membránu = Southernův přenos (Southern blot) > Základem hybridizace je obvykle značená sonda o známé nukleotidové sekvenci Blotting = přenos > Southern blotting (Dr. Edwin Southern) = DNA > Northern blotting = RNA > Western blotting = proteiny > southwesternový přenos - proteiny vázající se na DNA (sondou je DNA) > north westernový přenos - proteiny vázající se na RNA (sondou je RNA) K čemu se využívá Southernův přenos > Identifikace přítomnosti genu v materiálu vůbec > Identifikace genu za účelem jeho klonování > Využívá se tam, kde je dostupné pouze malé množství vstupního materiálu nebo je vysoké pozadí Příprava hybridizačních sond Sondy radioaktivně značené > Nick translace > Vyplnění jednořetězcových konců > Nahodilé značení > Zpravidla se využívá radioaktivní fosfor 32P Sondy fluorescenčně značené > Značení biotinem > Značení digoxigeninem > Značení křenovou peroxidázou > Citlivější, bezpečnější, dnes už používané častěji Nick translation Posun jednořetězcového zlomu DNase I pApGpCpTpApCpGpApCpGpCpTpApTpT pTpCpGpApTpGpCpTpGpCpGpApTpApA pol Nick mo Pancreatic DNase I pApG CpTpApCpGpApCpGpCpTpApTpT. pTpCpGpApTpGpCpTpGpCpGpApT pApA. 5 3 exonuclease \ E. coli DNA 5' 3' polymerase í polymerase dATR dCTP-» d G TP, dTTP t Nick p T t ? T pApGpCpTpApCpGpApCpGpCpT ApTpT PTpCpGpApTpGpCpTpGpCpGpApTpApA www.ncbi.nlm.nih.gov Zopakujme si: Klenowův fragment > syntéza ve směru 5'- 3' > exonukleázové odbourávání ve směru 3- 5 > tam, kde se neodbourává primer > sekvenování, značení DNA 5 3 Značení konců nukleových kyselin A) 5'(p): ] 3' ©= B) ť AATTCC ť AATTCĽ TTAAGC 41 5' AATTCC Polynucleotide kinase 3 3' Selected DNA Digest with restriction nuclease to give 5' aver hangs (e.g. EcaRI) □ CTTAA 3' Klencw DNA polyrn erase dATP-»d tJTTP tt □ GAATT $J : CTTAA 5J I Reslnclian nuclease cleavage at internal site ta give differen! sized fragments TT : GAATT TTAAGI-— Purify : CTTAA Furify Key: T Labeled nucleotide www.ncbi.nlm.nih.gov Nahodilé značení „random primer DNA labeling" = prostřednictvím náhodných hexanukleotidů I Denature and anneal in presence of mixture of random hexanucleotides 5 3 '3' 5 ?3 5 Klenow subunit of DNA polymerase ■f d ATP. dCTP dGTR dTTP 3 TT ě 1 17 3 ... .T TT t T TT k o. c. .TT T T T____ í>3' _ 5 Key: f Labeled nucleotide www.ncbi.nlm.nih.gov Značení biotinem > > > Lze využít všech tří základních postupu Nick translace Vyplnění jednořetězcových konců Nahodilé značení biotin-dUTP 11111111111 ........... 11111111111 ........... značeni detekce avidinem s fluorescenční značkou <- hybridizace 11111111111 iiiiiiiiiii 11111111111 11111111111 11111111111 11111111111 Praktická aplikace značení sond Příprava sond pro diferenciaci kmenů M. a. paratuberculosis Celkem 3 sondy detekující části inzerční sekvence \S900-inzerční sekvence specifické pro M. a. paratuberculosis i Pst\ -1045bp Pstl - IS900 RFLP profily I A1 B1 C1 D1 L1 Pstl - IS900 RFLP profily II Kbp Základní kroky při přípravě sond > Amplifikace specifických fragmentů PCR > Purifikace amplikonů > Značení sond peroxidázou > Kontrola koncentrace sondy Značení sondy *jft+ÍfcJť dsDNA povaření a ochlazení denaturovaná DNA negativně nabitá komplexy peroxidázy pozitivně nabité Značení sondy peroxidáza se váže k DNA špatně + + + glutaraldehyd peroxidáza se váže k DNA kovalentné Detekce peroxidázou značené sondy H202 detekční reagencie 1 o matricová DNA značená sonda °2 + H2° zesilovač o luminol detekční reagencie 2 NH2 I IH2 + světlo o o Postup při Southernově přenosu 1. rozdělení fragmentů DNA daného vzorku gelovou elektroforézou 2. denaturace DNA a přenos jednořetězcových fragmentů DNA na nylonový filtr („blotting") 3. inkubace filtru se značenou jednořetězcovou sondou: hybridizace sondy s komplementární sekvencí imobilizovanou filtru 4. odmytí nenavázané sondy 5. detekce navázané sondy - vizualizace hybridů Southern blotting fragmenty DNA na elfo gelu filtrační papír denaturace NaOH membrána pufr přenos DNA z gelu na membránu w otisk DNA na membráně inkubace se značenou cDNA vyvolání RTG filmu Southern blotting (A) neznačená DNA rozštěpená reštrikční nukleázou stoh papírových ručníků (B) \ (C) nitrocelulosová membrána gel odstranění nitrocelulosového papíru s pevně navázanou DNA značené DNA různé velikosti slouží jako standardy agarosovy gel FRAGMENTY DNA JSOU ODDĚLENY ELEKTROFORÉZOU NA AGAROSOVÉM GELU mycí houba alkalický roztok ODDELENÉ FRAGMENTY DNA (D) PŘENESENY NA NITROCELULOSOVOU MEMBRÁNU ZNAČENA DNA-SONDA JE HYBRIDIZOVANA S ODDELENOU DNA zalepený plastický sáček označená DNA-sonda v pufru OZNAČENÁ DNA-SONDA HYBRIDIZOVANA S KOMPLEMENTÁRNÍMI PRUHY DNA JE ZVIDITELNĚNA AUTORADIOGRAFlI (E) proužky značených standardů značené proužky z pokusu © Espero Publishing, s.r.o. Způsoby přenosu („blottingu") > kapilární přenos > elektroforetický přenos > vakuový přenos Kapilární přenos ŕ-\ filtrační papír Elektroforetický přenos Vakuový přenos Fluorescentní in situ hybridizace fluorescence in situ hybridization (FISH) Metoda sestává ze tří základních kroků > Fixace vzorku na mikroskopickém sklíčku > Hybridizace značené sondy k homologickým fragmentům na genomové DNA > Enzymatická detekce hybridů sonda-cílová sekvence > Sondy radioaktivně značené > Sondy fluorescenční: rychlejší, silnější signál, simultánní diferenciace různých cílů Ukázky FISH fluorescence in situ hybridization FISH v mikrobiologii > Umožňuje detekci i nerostoucích bakterií > Sonda je druhově specifická a míří zpravidla ke genu pro 16S rRNA > Metoda je vhodná pro fylogenetické, ekologické, diagnostické a environmentálni studie > Kombinuje preciznost molekulární biologie s mikroskopickým pozorováním > Je možno pozorovat výskyt bakterií v kontextu s morfologickou charakteristikou napadené tkáně > Citlivost až jediná bakterie, metodicky mimo PCR Typický FISH protokol 4 základní kroky 1) Fixace a permeabilizace vzorku 2) Hybridizace 3) Promývací kroky -odmytí nenavázané sondy 4) Detekce značených buněk mikroskopicky nebo průtokovou cytometrií Charakteristika sond Dlouhé 15 až 30 nukleotidů Fluorofor Barva Excitace Emise Alexa 488 zelená 493 517 Cy3 červená 552 565 Cy5 červená 649 670 DAPI modrá 350 456 Fluorescein zelená 494 523 Rodamin červená 555 580 TAM RA červená 543 575 Texas red červená 590 615 TAMRA Alexa 488 Cy3, Cy5 Zodpovězte otázku Jak dlouhá musí být minimálně sonda, aby našla jedinou specifickou sekvenci v bakterii, jejíž genom má velikost 4,0 x 106 bp? 4,0x106 = 4x ln(4,0x106) = Xln(4) X = ln(4,0x106)/ln(4) X = 11 Jak označit sondu? Přímé značení 5'- koncové značení 3'- koncové značení V4 Jak označit sondu? Nepřímé značení Reportérova molekula V 4 digoxigenin Značení enzymem v 4 V 4 , f 5 HRP Jak označit sondu? Nepřímé značení - polyribonukleová sonda Příklad použití polyribonukleotidové sondy Detekce a spočítání planktonních Archae a bakterií (na bázi 23S rRNA) o.io 80 58 J00 69 97 98 _U0_ 69 -Sulfolobus acidocaldarius (405018) ■ Stygiolobus azoricus (U32319) — Sulfolobus solfataricus (U32322) -Acidianus brierleyi (U32319) ~Desulfurococcus mobilis (X05480) -Thermoproteus tenax (Y00346) 'Thermofilum pendens (X14835) 100 ■ Cenarchaeum symbiosum (U51469) - fosmid 4B7 (UA39635) Archaeoglobus fulgidus (M64487) ■ Thermococcus celer (M67497) -Thermoplasma acidophilum (M32298) LSU clone 1A10 ■ Methanobacterium thermoautotrophicum (X15364) -Methanococus vannieli (X02729) 77 100 Natronobacterium magadii (X72945) —Halococcus morrhuae (X05481) Haloferax volcanii (D4BC5884) DeLong RE. et al. (1999): Visualization and Enumeration of Marine Planktonic Archaea and Bacteria by Using Polyribonucleotide Probes and Fluorescent In Situ Hybridization. Appl Environ Microbiol. 65(12): 5554-5563. Dvě hlavní oblasti využití FISH v mikrobiologii > Analýza vzorků potravin > Studium biofilmů • ' 1 V* :N • \ - * • v v % Sresr •'iLor~=-3rv3 cells Yelky* fluorescing eels {£. ooJD) (K. pneunontae) Red fluorescing cells |P aeruginosa) Voced Positive Varianty FISH ACM-FISH ■ e-FISH ■ QD-FISH armFISH ■ Fiber-FISH ■ Rainbow-FISH CARD-FISH ■ Flow-FISH ■ Raman-FISH catFISH ■ Fusion-Signal ■ ReD-FISH CB-FISH FISH ■ Reverse-FISH CO-FISH ■ Halo-FISH ■ RING-FISH COBRA-FISH ■ Harlequin-FISH ■ RNA-FISH COD-FISH ■ Immuno-FISH ■ RxFISH COMBO-FISH ■ LNA-FISH ■ Split-Signal FISH Comet-FISH ■ M-FISH ■ T-FISH Cryo-FISH ■ ML-FISH ■ 3-D FISH D-FISH ■ PCC-FISH ■ Zoo-FISH DBD-FISH ■ PNA-FISH ■ Q-FISH BioTechniques 45:385-409 (October 2008) Další čtení Bottari B (2006): Application of FISH technology for microbiological analysis: current state and prospects. Appl Microbiol Biotechnol (2006) 73:485-494 http://www.nottingham.ac.Uk/biosciences/divisions/food/r esearch/projects/foodmicrobiology.aspx http://www.rapidmicrobiology.eom/news/1431h22.php Vybrané aplikace hybridizačních technik v mikrobiologii > Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) > Ribotypizace > Metoda reverzní hybridizace > Metoda spoligotypizace A více se dozvíte v 5. ročníku Shrnutí 1) Způsoby provedení hybridizace 2) Hybridizace v roztoku 3) Příprava značených sond 4) Hybridizace na pevném povrchu 5) Southernův přenos 6) Fluorescentní in situ hybridizace Metoda RFLP > Reštrikční fragmenty rozdělené na gelové elektroforéze > Detekce vybraných polymorfních úseků značenou sondou > Rozdíly ve spektru jsou dány ztrátou nebo získáním restrikčního místa, delecí nebo inzercí > Jsou možné i změny v počtu repetitivních sekvencí nebo translokace > Sondy z náhodně vybraných sekvencí > Sondy ze specifických esenciálních genů nebo genů pro faktory virulence > Sondy z IS, transpozonů a repetitivních sekvencí > Sondy z genů pro rRNA Zjednodušený princip RFLP Porovnání elektroforézy a hybridizace DNA obarvená ethidium bromidem autoradiogram Naznačení analýzy RFLP profilu Analýza změn ve fragmentu 400 bp + RE - RE + 50 - 50 Velikosti fragmentů 600 500 400 400 250 600 450 350 150 i i 250 200 150 100 75 Počet změn 0 3 3 2 2 Využití RFLP v epidemiologii původců mykobakterióz > Epidemiologie paratuberkulózy, \S900 > Epidemiologie aviární tuberkulózy > Analýza kmenů MAC y rámci jednoho chovu > Analýza kmenů MAA \S901 u jedince > Analýza smíšených infekcí kmenů MAC Inzercni sekvence u vybranych mykobakterii M. avium subsp. avium serotypy 1-3, M. avium subsp. silvaticum \S901 IS 1245 M. avium subsp. hominissuis serotypy 4-6, 8-11 a 21 IS 1245 FR300bp M. avium subsp. paratuberculosis IS 900 M. intracellular serotypy 7,12-20, 22-28 Inzerční sekvence transponují > Kopie IS se chovají jako bodové mutace > Důsledkem transpozice jsou různé RFLP profily Pro studium epidemiologie MAA\e vhodná \S901 Pro MAP potom \S900 RFLP profily na bázi IS901 - MAA PvuW - \S901 RFLP profily ^- > 25 vícekopiových profilů > 3 profily o malém počtu kopií > celkem 28 RFLP typů Psfl - \S901 RFLP profily - > 4 vícekopiové profily > 1 profil o malém počtu kopií > celkem 25 RFLP typů Pvull - IS901 RFLP profily -1 kbp N A B C D E F G H I J K L M O P q] 10.0-► 8.0-► 7.0-► 6.0-► 5 0 -► ►— ►— _ w ■ ► w 4.0-► ►— >— 3.0-► — — — — —► ► — ►— ► ► — - - - 2.0-► — ► ► t ► £ A AUA -I I I A AAAA t 11 I AAA A I I I I I I ►_ — ► ► — — —► -w > w > ►- - ► ► Pvull - IS901 RFLP profily - 2 Vybrané Pstl - IS901 RFLP profily Fylogeneze na základě analýzy profilů Pvu\\ Psů 20 40 60 80 100 1 ■11" ■111 ■ ■ ■ I'1 " I■ ■ " I ■1 ■11 ■ ■ ■1!■1 ■■ I ■ ■ ■ ■ I ■1 ■ ■I HZ HZ HZ -Ľ L2 L3 LI A11 A3 A13 A12 A7 A15 A14 A6 B2 B1 C3 D1 C2 Cl A1fl A1 A2 AS A9 A4 A8 A16 V obou případech 2 clustery Využití při epidemiologických studiích Původ celkem 137 izolátů □ prasata ■ dobytek ■ ptáci □ lidé ■ daňci RFLP typy získané u ptáků, zvířat a lidí l ~m ô p Q~ t u kbp N B C D E F G H I Z AA AB 10.0 8.0 7.0 6.0 5.0 -► — — — —--— 4.0 ► ► 3.0 — > > > ►— ►- ► ► ►— ► ► 2.0 ► ► ► ► ► ► ► ► ► ► ► ► ► > Specifické profily u izolátů od lidí Standardizace metody Dvorská, L. - Bull, T.J. - Bartoš, M. -Mátlová, L. - Švástová, P. - Weston, T.R. -Parmová, I. - Van Soolingen, D. - Pavlík, I.: A standardised Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) method for typing Mycobacterium avium strains links \S901 with virulence for birds. Journal of Microbiological Methods; 2003, 55, 11-27 Analýza klinického případu u člověka Analýza primokultur m%\ny\ yoiujepunyies ezÁ/euv Pracovní hypotézy 1) Opakovaná infekce z vnějšího zdroje 2) Dočasné utlumení infekce a její reaktivace 3) Selekce rezistentních kmenů antituberkulotiky Studium přenosu MAA mezi různými farmami 5 km Farma A 14xC 2 km Farma B 3 km // 1 x C I Farma C 1 x D ? Zdroj Ke studiu epidemiologie M. a. paratuberculosis se používá \S900 RFLP profily na bázi IS900 - MAP BstEM - \S900 RFLP profily ..--- > 33 vícekopiových profilů > 3 profily s nízkýmpočtem kopií > celkem 35 vícekopiových profilů Psfl - \S900 RFLP profily > 24 vícekopiových profilů > 1 profil s nízkým počtem kopií > celkem 25 RFLP typů BstEII - IS900 RFLP profily I BstEII - IS900 RFLP profily II BstEII IS900 RFLP profily III Pstl - IS900 RFLP profily I A1 B1 C1 D1 L1 Pstl - IS900 RFLP profily II Kbp Paratuberkulóza u divokých přežvýkavců v ČR (1995-2000) • B-C1 Pavlik et al.. Veterinarv Microbiolos v. 2000. 231-251 Paratuberkulóza u faremně chovaných jelenů Detekce tří kmenů různých RFLP typů u jedné krávy V letech1995 až 2001 V roce 2002 ZZ7 C1 C9 C23 Rozklonování izolátu č. 23 Porovnání výsledných RFLP profilů Colony number Kbp 2 4 5 7 8 10 12 13 14 16 18 — I----mm — mm — .i— — — — — — — - i—— — — — — — — 8.8 7.0 5.2 4.1 1 11 B1 11 I I 1 1 1 1 i n B : I 1 II 11 ■ i 11 B ! l i i l D : ■ I I 1 1 I 11 1 M tBf MM Illllll 11 ill ilvi M 3.3 9m l 55 _ — — _ 2.8 ■> Z »J zz — — — — 2.4-> 2.1 1 fr» mm* 1 MM — — — — 1.6-► C23 C9C9C9 C9C9C1 C5C9 C1C9C1 C23 C9 C1 C5 Pro studium epidemiologie M. tuberculosis se používá \S6110 IS 6110 RFLP M. tuberculosis, M. bovis a M. caprae Std M.tbc M. bovis M. caprae Proč to celé neosekvenujete a hotovo! Není tato metoda dnes poněkud zastaralá? Sekvenování je příliš citlivá metoda a nesnadno odhaluje klonalitu Ribotypizace Varianta RFLP využívající sond připravených z genů pro 16S rRNA nebo 23S rRNA > Sekvence genu pro 16S rRNA se používají k fylogenetickým studiím > Počet kopií genu pro 16S rRNA je malý, do 6 ks > Výsledná spektra jsou jednoduchá > Popsáno u Listeria (80 spekter), Salmonella (97), Escherichia (65) a Staphylococcus (252) Zodpovězte otázku Kde se v buňce nachází 16S rRNA? A kde se nachází 23S rRNA? O O a: < CO CD q> ■5 c o S 3 Q> C | a CO .3 O CQ ■O O c serotype 12 | 10 | 9,11 8 7 5 4 2 ribotype pattern I I I II I 1,3, 6 | || I II ribotype H/ndlll/9 H/ndlll/8 H/nd Ml/7 H/nd Ml/6 H/ndlll/5 H/nd Ml/4 H/nd Ml/3 Hind Ml/2 H/'nd 111/1 co a> CAJ CD CD CO o Cvi CVJ O O .■9 < co ■5 c 0 S 3 c 1 (o .3 O o serotype 5 3,4,6,12 2,7 1,8,9,10,11 ribotype patem MIM III I I I I II II I I ribotype Cfol/4 Cfol/3 Cfol/2 Cfol/1 1011 12 t ta i in ii tt ii t 1 • • t t CD ti ii 1 • CO -t ii 11 a*M to l t • CO mmm t t • in ■nu f co mam i mmu • • 1 1 CM m m i • ii ii 1 • i f 23.1 9.4 6.6 ■ CO o OJ CM* Úkol Analýzou výše uvedených spekter ribotypů stanovte počet genů pro 16S rRNA u Actinobacillus pleuropneumoniae, jestliže ani HincňW ani Cfo\ neštěpí uvnitř genu. Ze spekter po štěpení Cfo\ vyplývá, že je zde 6 kopií genu pro 16S rRNA. » Spektra po štěpení H/n dl II nejsou čistá. A ještě jeden, komplikovanější úkol Analyzujte následující spektrum a odhadněte, co se mohlo stát M12345678 9 1011 12 1) Porovnejte vzorek č. 1 a 2 2) Najděte další podobné události 3) Co je méně pravděpodobné? Řešení? á ^^^0 Toto jsou možná vysvětlení, zájemci mohou i vypočítat délky změněných úseků M12345678 9 1011 12 1) U vzorku č. 2 došlo k deleci (nebo u vzorku č. 1 k inzerci) úseku DNA 23.1 9.4 6.6 4.4 — 2a) Podobné mohlo nastat mezi vzorky 3-8 (3-1, apod.) -2 události! 23 2b) Další možnost 4-7 Ľ2 m m tá "[fa* mm 1 mm. mm 26) A ještě jedna možnost 5-6 3) Dvě události versus jedna jsou méně pravděpodobné Odhadněte evoluci ribotypů -1 10 w w w 00 Vi *> * o -i. 1_l «< p to -g - I "O CD "D U Což třeba takhle * Cfol/4 (serotyp 5) í Cfol/3 (serotyp 3,4,6 a12) í Cfol/2 (serotyp 2,7) í Cfol/1 (serotyp 1,8,9,10 a 11) A podobně pro spektrum Haelll Analyzujte následující spektrum a odhadněte, co se mohlo stát 1) Porovnejte vzorek č. 4 a 8 2) Porovnejte vzorek č. 4 a 5 3) Co se stalo u č. 2? Řešení? Toto jsou možná vysvětlení, zájemci mohou i vypočítat délky změněných úseků 1) U vzorku č. 4 došlo k deleci (nebo u vzorku č. 8 k inzerci) úseku DNA 2a) U vzorku č. 5 se ztratilo jedno reštrikční místo oproti č. 4 (nebo opačně) 2b) Přibyl/ubyl počet kopií 3) ??? Metoda reverzní hybrídízace > „Sonda" je nanesena na pevný povrch > Cílová sekvence je v tekuté fázi, zpravidla ve formě amplikonu po PCR + cílové DNA sekvence -> sondy A B Tři jednoduché kroky > Izolace DNA ze vzorku > Amplifikace cílové sekvence (PCR) > Detekce značeného produktu na matrici Izolace DNA PCR Detekce Výsledky za (30 minut) (2 hodiny) (10 minut) 3 hodiny Detekční systémy pro mykobakterie I Conjugate Control (CC) Amplification Control (AC) M. avium M. intracellular M. kansasii M. malmoense M. tuberculosis complex http://www.hain-lifescience.de Detekční systémy pro mykobakterie 1 Conjugate Control 2 Unnerul Control 3 Genus Control 4 5 i 7 8 I 10 It 12 13 H IS u 17 J Spec it ic probes 11 Spent* may possibly be further differentiated with tha GefleType Mycobacterium AS 21 For further differentiation use the GenoTypc Mycobacterium AS 3) For further differentiation use the OeneTypc MTBC http://www.hain-lifescience.de Detekční systémy pro mykobakterie III http://www.hain-lifescience.de Diferenciace zástupců MT komplex ................... Conjugate Control Universal Control MTBC Specific gene probes for the differentiation of the Mycobacterium tuberculosis complex /0 http://www.hain-lifescience.de Detekce genů rezistence http://www.hain-lifescience.de Další systémy > Multirezistentní kmeny Staphylococcus aureus > Detekce Helicobacter pylori + rezistence > Detekce Chlamydia trachomatis > Detekce Bordetella pertussis a B. parapertussis > Clostridium dificille - diferennciace mezi nepatogenními, virulentními a hypervirulentními kmeny > Detekce desítek g ram pozitivních a gramnegativních druhů > Geny pro Shiga toxin > Vankomycin rezistentní enterokoky > Detekce periodontopatogenních bakterií http://www.hain-lifescience.de Spoligotypizace Mezerníky dlouhé 35-41 bp 43 specifických oligonukleotidových sond vázaných na membránu Membrána pro spoligotyping 1) Membrána se 43 specifickými sondami 2) Hybridizuje se s produktem PCR 3) Vyhodnotí se výsledky M. tuberculosis H37Rv M.africanun i"::"::" limu mni M. tuberculosis Beijing genotype n i-i i-, i-i 11 11 iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii iiii ..... M. bovis BQG M. bovis M. bovis subsp. caprae i-i i-i i 11 i n M. bovis subsp. caprae M. tuberculosis seal genotype i M. microti type vole A I: ill. M. microti type llama 11- ■ 11 L. j L . Hill Hill IHH llll i "i '"i i "i i" ....... llll mm nim iiiiii 1-, I", r-, 1-, 1-, 1-, 1-, 1-, 1-, I-I I I i I I I I I I I I I i I i I I I 11 1 L 1 i 1 'J llll llll immiiimiiii miiiimi iiiiiiiiiii iiiiiiiiiii llllllilll lillllllll im HIHIiEIIIIIIII r -| |-| 1-, r-| r-I i I i..... ! 1 ' 1 i I I 1-, I", I", i", I-........i I II III i- - i- - L J i i-, i-, i-, i-, i-, ........i i i II Profily zástupců komplexu M. tuberculosis M. tuberculosis H37Rv M.africanum M. tuberculosis Manila genotype M. tuberculosis Beijing genotype M. bovis BCG M. bovis M. bovis M. bovis subsp. caprae M. bovis subsp. caprae M. bovis subsp. caprae M. tuberculosis seal genotype M. microti type vole M. microti type llama M. canetti I I I ■ III ■ III II I II II Reálný záznam spoligotypizace íl • •■•■ • il mu it t* « u tt u Sl Ir U H w *f "Jí « 4< ^ * " •■■•••• •}• • •»••••••■•••• ••{•t^'tííisľ ■ ••••• • • •f • ••• • ■•• • "I ••••■• ••■•• • •>•••• • ■ • • • t • • • • f • • • Vyhodnocení spoligotypizace ii ■ I : ::::: •Slií • • li ::::::::: ■••••••■•• ■•• •■• ■•■••• liiiiiiiii ••••• liti III •••• Mtll •••• •••• III S4 Pavlik et al., Vet. Med. Czech, 2002,47,181-194 Profily izolátů M. bovis z let 1965-2002 1965 1966 1974 1989 1991 1992 1994 1995 1997 1999 □ □ □ □ □ III Hill UHU llllllllllllllllllllll s2 □ • Hill UHM lllllllllllimillllll s □ II IHM Uli» lllllllllllll lllllll s4 m i m i im n iiiiiiMiimmm Typový kmen □ i m i m u li iiiiiiimiimiiii s6 □ II Hill Hill llllllllllllll 1 87 □ □ □ □ □ 1 lllllimtl IHIMIHI Nej běžnější typ Jedinečný typ M. bovis caprae Spoligotypy izolátů M. bovis u zvířat Vyhodnoťte Proveďte analýzu spoligotypů podle předložené učební pomůcky Shrnutí 1) Způsoby provedení hybridizace 2) Hybridizace v roztoku 3) Příprava značených sond 4) Hybridizace na pevném povrchu 5) Southernův přenos 6) Fluorescentní in situ hybridizace 7) Příklady využití metod hybridizace v analýze mikroorganismů - RFLP, reverzní hybridizace, spoligotypizace