Po lym e rázová řetězová reakce doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph. D, Bartoš. Milan@atlas. cz Přírodovědecká fakulta MU, 2017 Obsah přednášky 1) Co je to PCR, princip, jednotlivé kroky 2) Technické provedení PCR 3) Fyzikální faktory ovlivňující PCR 4) Chemické faktory ovlivňující PCR Polymerázová řetězová reakce Dnes nejrozšířenější metoda molekulární biologie Kdo za to může ? Princip PCR Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction - PCR) umožňuje selektivní zmnožení (amplifikaci) určité oblasti DNA v podmínkách in vitro; a to procesem, který připomíná replikaci DNA in vivo nově syntetizovaný řetězec DNA matrice Komponenty PCR Thermus aquaticus, Thermococcus, Thermophilus, Pyrococcus DNA primery umělá syntéza Denaturace 92-96°C PCR probíhá v cyklech denaturace annealing extenze 7. PC R cyklus 1. denaturace (92-96°C) dsDNA 2. annealing (45-72°C) primární produkty 3. extenze (72°C) / Primární produkty nás nezajímají! 2. PCR cyklus sekundární produkty Jenže sekundární produkty nás taky nezajímají i 3. PCR cyklus A teď se podívejte, jak rychle se amplikony „množí", tedy amplifikují. Další cykly ■■■■■■■■■ IIIIIMIIIIIMIIIII lllllllllllllllllll IIIIIIIIIIIIIIIIMI lllllllllllllllllll IIIIIIIIIMIIIIIIII lllllllllllllllllll llllimilllllllMI Z každé molekuly amplikonu vznikají dvě nové Počet amplikonu vzrůstá geometricky „Zázrak" amplifikace > Každý amplikon je složen ze dvou řetězců = dvě matrice, které se v dalším cyklu zase zdvojí > Počet amplikonů extrémně vzrůstá oproti počtu primárních a sekundárních produktů > Po několika cyklech už amplikony v reakčních produktech naprosto dominují > Primární a sekundární produkty tvoří jen minoritní složku ve výsledných produktech PCR Množení amplikonů Cyklus č. Primární Sekundární Amplikony Celkem (proX=1) 0 0 0 0 1 1 2 0 0 2 2 2 2 0 4 3 2 4 2 8 4 2 6 8 16 5 2 8 22 32 Obecně 2x x(2n-2) (2n-2n)x (2n)x X = počet matríc na počátku, n = počet cyklů Množení amplikonů - pověst o vzniku šachové hry Výtěžek PCR Cyklus č. Primární Sekundární Amplikony Celkem 10 2 18 1 004 1 024 20 2 38 10 485 438 1 0242 30 2 58 ~ 1.1 x109 1 0243 40 2 78 ~ 1.1 x 1012 1 0244 50 2 98 ~ 1.1 x 1015 1 0245 nas ceka silene počítání! © Výtěžek PCR - příklad Kolik cyklů PCR musíte použít, aby bylo možno detekovat amplikony o velikosti 500 bp vzniklé z jedné kopie dsDNA? Zařízení (transluminátor) detekuje 5ng DNA. Výtěžek PCR - řešení Musí proběhnout alespoň 34 cyklů Řešení je uvedeno v samostatném souboru ve Word u Délka a specifičnost amplikonů je dána pozicí primerů na cílových sekvencích DNA-matrice tgatgcgttcgtatcatt.......................................AATCGATGGTTTCGTATcl forward reverse actacgcaagcatagtaa T T AGC T AC C AAAGC AT AG „Syntéza DNA probíhá jen ve směru 5'^ 3". Tak to příroda stvořila! Tedy primery musí začínat 5-koncem a končit 3'- koncem. Na 3 - konci je OH skupina, ke které se připojuje vstupující dNTP Narůstání nukleotidového řetězce o Primer forward > musí svým 3'- koncem směřovat „dovnitř" budoucího amplikonu > je komplementární ke „spodnímu" řetězci > ale má sekvenci „horního" řetězce tgatgcgttcgtatcatt.......................................AATCGATGGTTTCGTATcl forward Primer reverse > musí svým 3'- koncem směřovat „dovnitř" budoucího amplikonu > je komplementární k „hornímu" řetězci > ale má sekvenci „dolního" řetězce Primery se zapisují ve směru 5 ^3tedy 5'- konec nalevo a 3'- konec napravo Platí to jak pro primer forward (kde je to jednoduché), tak pro primer reverse - podívejte se na další snímek, jak to dopadne !!! Jak zapsat primery „na papír" Ačkoli na schématu leží primery takto: t gat gc gt t c gt at cat t..................., ....................aatcgatggtttcgtatc1 forward 5'-► 3' t t agc t ac c aaagc at ag ° reverse ° tgatgcgttcgtatcatt ac t ac gc aagc at agt aa..................., ....................ttagctaccaaagcatag| Napsat „na papír" je musíte takto forward reverse A co když se spletu? Podívejte se, co se stane Když napíšete primer reverse takto actacgcaagcatagtaa . , t t agc t ac c aaagc at ag Když napíšete primer reverse takto reverse tatgctttggtagct > polymerace z takového primem nemůže probíhat, řetězce nejsou antiparalelní atag forward ac t ac gc aagc at agt aa A tecT zase nějaká otázka!© Návrh primem - příklad Napište sekvenci primem, které by mohly amplifikovat vyznačenou část daného úseku dsDNA - znáte sekvenci jen jednoho z řetězců - primery pište ve směru 5'- 3' 5 TGA TGC AAA GTT CGC TCA GGT ACG ATT CCC AAA TGT GGA GCT TAG TCG ATG ATG GGC AAA TCT GTG ATT ATC CGA CGT CCC ATG TGC GTC AAA TGC CGT AGG ACC CTA TTT TGA CGT CCT GCT GGT ACG CAT CAT CCC TGG TGA CGT CCT ACG TGC TGC GCT CGC ACG ATG CGT ACG AAC GCT CGT CGG - 3 Jak dlouhý bude vzniklý amplikon? Návrh primerů - řešení Primer forward 5- AAA GTT CGC TCA GGT ACG - 3 Primer reverse 5- CGT ACG CAT CGT GCG AGC - 3' Amplikon bude mít délku 171 bp Vlastnosti primem I > zodpovědné za specifičnost PCR > délky 14 až 40 nukleotidů > obsah G+C od 40% do 75% > primery by měly být navrženy tak, aby se jejich cílové sekvence nacházely v konzervativních oblastech sledovaného genomu > 3 - konce jednoho primem by měly obsahovat takové sekvence nukleotidů, které nejsou komplementární k sekvencím druhého primem > pokud z primem vznikají tzv. dimery, znesnadňuje to annealing Vlastnosti primem II > žádné palindromy > žádné sekundární struktury > ne nebalancované rozložení domén bohatých na G/C a A/T > použití sekvencí oligo (dT) a poly (dC) ve struktuře primerů nemá na jejich funkci vliv > 5'- konec primem je méně citlivý k modifikacím > reštrikční místa, GC-svorky, sekvence promotoru > koncentrace v rozsahu 0,1 -1,0 Technické provedení PCR Termocyklery > mikroprocesorem kontrolované zařízení, které obsahuje kovové reakční bloky vyhřívané a chlazené polovodiči (Peltierova pumpa), vodou, vzduchem nebo mikrovlnami Termocyklery dokáží automaticky rychle měnit teplotu v reakčních blocích mezi třemi základními teplotami PCR cyklu Vlastnosti termocyklerů 1) Vysoká přesnost teploty v reakčním bloku, uniformita a reprodukovatelnost teplotního profilu v reakčním bloku 2) Uniformita a srovnatelnost teplotních profilů mezi jednotlivými reakčními bloky 3) Minimální „přestřelování" teplot při zahřívání a nebo chlazení 4) Vysoká reprodukovatelnost jednotlivých amplifikačních cyklů Co se děje uvnitř termocykléru? Výsledek PCR záznam z elektroforézy v agarózovém gelu 100 bp ladder Faktory ovlivňující PCR Faktory fyzikální 1) Počáteční denaturace 2) Připojení primerů 3) Syntéza nukleotidových řetězců 4) Počet cyklů 5) Závěrečná extenze Faktory chemické 1) Množství Taq polymerázy 2) Reakční pufr 3) Množství dNTP 4) Primery 5) Objem PCR reakce 6) Kvalita DNA Fyzikální procesy ovlivňující PCR 1) Počáteční denaturace 2) Připojení primem 3) Syntéza nukleotidových řetězců 4) Počet cyklů 5) Závěrečná extenze Počáteční denaturace > jednorázové zahřátí PCR směsi na teplotu 94-96°C po dobu přibližně 3-5 minut > dokonalá denaturace genomové DNA a odbourání všech struktur, které by bránily připojení primerů k cílovým sekvencím > následné připojení primerů je velmi efektivní > nesmí být příliš dlouhá - poškození řetězců DNA a ničení Taq polymerázy Horký start > denaturace po dobu 10-15min, > termolabilní komplex s jiným proteinem > rekombinantní připojení haptenů > vosk na rozhraní PCR směsi a Taq polymerázy > Taq polymeráza zalitá v agaróze ve víčku PCR zkumavky Připojení primem - annealing > rozhodující pro specifičnost > připojení primem závisí na teplotě, době annealingu, koncentraci matrice, koncentraci primem > vysoká teplota = primery se nepřipojí > nízká teplota = vznikají nespecifické produkty Ta = (počet G+C) x4 + (počet A+T )x2 Gradientovy termocykler Záznam z gradientového termocykleru teplota Syntéza nukleotidových řetězců > probíhá při 72°C > pro fragmenty o velikosti do 500bp se doporučuje ne delší než 20s > pro fragmenty do 1,2 kbp asi 40s > rychlost Taq polymerázy činí 150 připojených nukleotidů/sekundu Počet cyklů > analytická PCR - ne více než 40 > nejčastěji 25-35 cyklů > vyšší počet cyklů vznik nespecifických artefaktů > vyčerpávání komponent reakce > degradace polymerázy i DNA Například při vyčerpání primerů se zbývající nukleotidy účastní syntézy nespecifických produktů, které vznikají po vzájemném annealingu již vzniklých amplikonů a výsledkem jsou delší amplifikační produkty vytvářející „šmouhy" na elektroforetickém gelu Závěrečná extenze > slouží k dokonalému dosyntetizování všech produktů > probíhá po dobu 5-15 min. při 72°C > poté je možné produkty amplifikace uschovat a následně analyzovat Chemické procesy ovlivňující PCR 1) Množství Taq polymerázy 2) Reakční pufr 3) Množství dNTP 4) Primery 5) Objem PCR reakce 6) Kvalita DNA Množství Taq polymerázy > 0,5-2,5 jednotky, což odpovídá 25-125 fmol enzymu > zvýšená koncentrace Taq polymerázy v reakci snižuje specifičnost > v současné době je k dispozici řada různých Taq polymeráz a jejich směsí > vysoká termostabilita a přesnost začlenění správného nukleotidu do struktury DNA (tzv. fidelity) > fidelity je závislá na koncentraci volných Mg2+ a nukleotidů, na správném vybalancování podílu nukleotidů, na pH a podílu poškozené DNA v reakci Reakční puf r > kofaktor Taq polymeráz = ionty Mg2+ ve formě MgCI2 nebo MgS04 > Koncentrace Mg2+ se pohybuje v rozmezí 0,5-5,0 m M (1,5 m M) > lonty ovlivňují aktivitu enzymu, zvyšují Tm dvoušroubovicové DNA a tvoří rozpustné komplexy s nukleotidy, což je proces nutný k inkorporaci nukleotidů do DNA Množství dNTP > závisí na délce amplifikačních produktů > koncentraci Mg2+ > koncentraci primerů > nastavení teplotního profilu reakce > Tím, že se nukleotidy vážou na Mg2+, snižují hodnotu Ta > Do struktury DNA jsou v podmínkách in vitro účinně začleňovány při koncentracích kolem 10 uM, což jsou ale hodnoty nižší, než ty, které se používají při PCR (100-200 uM) Objem PCR reakce > ovlivňuje výsledek v míře menší než faktory uvedené doposud > objemy reakčních směsí 20 až 100 ul > PCR v kapilárách - reakční objemy až 10 ul Kvalita DNA > Jeden z rozhodujících faktoru > Přítomnost řady látek, které ovlivňují průběh PCR > Čistota DNA ovlivňuje zejména citlivost > V řadě případů působí jako negativní faktor už pouhé zmrazení vzorku, přičemž zvlášť negativní je jeho opakované zamrázování a rozmrazování > PCR je kompletně inhibována látkami jako jsou heparin, EDTA, porfyriny a jim podobné sloučeniny a ionty HxP04n" > Homogenita vzorku a množství DNA vložené do reakce Shrnutí 1) Co je to PCR, princip, jednotlivé kroky 2) Technické provedení PCR 3) Fyzikální faktory ovlivňující PCR 4) Chemické faktory ovlivňující PCR PCR před a po Kde si můžu přečíst více? www.farmakogenomika.cz A ještě něco pro ty, kteří rádi počítají Příprava příměrů - příklad V jakém množství rozpustíte lyofilizovaný vzorek primem, aby jeho koncentrace byla 100uM? Vzorek obsahuje 138,6 ug primeru Molekulová hmotnost tohoto primeru (o délce 18 nukleotidů) je 5 119 Príprava primeru - reseni ve 271iil Použití primem - příklad Jaké množství primeru ze zásobního 100uM napipetujete do PCR reakce o 20ul jestliže chcete do reakce dát primeru? roztoku objemu 10pmol Použití primerů - řešení 1M roztok.........1 mol částic / litr (1 umol částic / ul) 1mM roztok......1nmol částic / ul 1 uM roztok.......1 pmol částic / ul 100 m m roztok.......100pmol částic /ul 10pmol částic.....0,1 pl