Angiogeneze a cévní endotel Využití mikrofluidních systémů pro studium funkcí cév Lukáš Kubala kubalal@ibp.cz Angiogeneze vs. vaskulogeneze Vaskulogeneze (neovaskularizace) = tvorba nových cév během vývoje zárodku • de novo vznik primárního cévního plexu • začátek 3. týden vývoje zárodku • endoteliální prekurzory – hemangioblasty Angiogeneze = tvorba nových cév větvením z existujících cév • angiogenní x angiostatické faktory rovnováha – angiogeneze neprobíhá porušení rovnováhy A) fyziologické situace (např. těhotenství – změny v děložní sliznici) B) patologické stavy • pozitivní (např. hojení ran) • negativní (např. retinopatie, nádory, lupénka) Etapy angiogeneze 1. Vazodilatace cév, zvýšení permeability (VEGFs, NO) 2. Destabilizace cév, degradace bazální membrány a ECM, uvolňování buněk, apoptóza EC (proteázy – aktivátory plasminogenu, chymázy, MMPs, Ang2, TGF-β) 3. Migrace a proliferace EC (VEGFs, PDGF, EGF, integriny) 4. Tvorba nových cév, změna tvaru buněk (VEGFs, PDGF, integriny) 5. Proliferace mezenchymalních buněk, vznik SMC a PC obklopujících EC (FGFs, PDGF, TNF-α) 6. Zastavení proliferace, vznik fukční cévy (TGF-β, PDGF, Ang1) 2. 4. 3. 5. 6.1. DISTLER et al. (2003) QJ NUCL MED 47:149-61 I. II. III. Angiogenní faktory Vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF; „Vascular Endothelial Growth Factor“) Fibroblastový růstový faktor (FGF; „Fibroblast Growth Factor“) Angiopoetin (Apo) Růstový faktor pocházející z destiček (PDGF; „Platelet-derived Growth Factor“) Transformující růstový faktor beta (TGF-β; „Transforming Growth Factor beta“) Faktor nekrotizující nádor alfa (TNF- α; „Tumor Necrosis Factor alpha“) CXC-chemokiny Angiostatické faktory Angiostatin Endostatin Tumstatin Trombospondin (TSP) „Pigment epithelium-derived factor“ (PEDF) Vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) VEGF je součástí rodiny angiogenních faktorů. Další členy rodiny jsou VEGF-B, C, D a E s 20- 50% homologií s VEGF. VEGF má 6 různých izoforem vážících se k různým receptorům. Různé izoformy mohou mít i protichůdné působení. Deregulace: • snížení/zvýšení exprese VEGF během embryogenze => letální poruchy vývoje orgánů • VEGF důležitý v růstu a fertilitě – inhibice VEGF vede k redukci výšky a neplodnosti Receptory: • tyrozinkinázové VEGF-R1, 2, 3 + další receptory, např. neurolipin • vysoce exprimované během embryogeneze, u dospělého omezeně: VEGF-R1 a 2 na EC krevních cév, VEGF-R3 na EC lymfatických cév • mutace v jediné alele VEGF nebo VEGF-R2/3 je letální již ve stadiu embryogeneze VEGF během angiogeneze: • počáteční vazodilatace – zvýšení tvorby NO • zvýšení permeability EC – tvorba speciálních transportních vakuol • stimulace exprese plasminogenových aktivátorů a MMPs (hlavně MMP-1) v EC • stimulace proliferace a migrace EC in vitro • stimulace větvení cév během in vivo testů Popsáno 20 různých FGF a 4 různé tyrozinkinázové FGF receptory. Nejdůležitější je FGF-1 (tzv. kyselý FGF) a FGF-2 (tzv. zásaditý FGF). Sekretovány jsou celou řadou různých typů buněk. Deregulace: • mutace FGF není letální • poruchy hojení v dospělosti FGF během angiogeneze: • stimulace proliferaci a migraci EC • zvýšení exprese VEGF a proteáz (urokinázy) • indukce exprese integrinů na EC • stimulace tvorby cév v 3-D kolagenové matrici in vitro Fibroblastový růstový faktor (FGF) Angiopoetiny (Apo) Popsány Angiopoetiny 1, 2, 3, a 4. Receptorem pro Angiopoetiny je Tie-2 (tyrosinkinázový). Angiopoetin 1: • sekretován periendoteliálními buňkami (např. buňkami hladké svaloviny) • stimuluje větvení cév • mutace vede k letálním endokardiálním a myokardiálním defektům během embryogeneze • nadměrná exprese způsobuje hypervaskularizaci Angiopoetin 2: • působí komplexně podle přítomnosti dalších stimulátorů angiogeneze → v nepřítomnosti VEGF stimuluje apoptózu EC a regresi krevních cév → v přítomnosti VEGF stimuluje proliferaci a migraci EC, větvení a zvětšení průměru cév in vivo a stimuluje tvorbu cév v 3-D kolagenové matrici in vitro Růstový faktor pocházející z destiček (PDGF) Exprimován a sekretován nejen destičkami, ale i např. fibroblasty a keratinocyty. PDGF receptory jsou homo či heterodimery exprimované na EC a jiných buňkách. PDGF stimuluje tvorbu a větvení cév in vitro. Stimuluje proliferaci SMC. Stimuluje expresi VEGF a VEGF-R2 na EC. Mutace PDGF nebo jeho receptoru je letální během embryogeneze. Transformující růstový faktor beta (TGF-β) Exprimován různými buňkami včetně EC. Sekretován neaktivní, nutná aktivace proteázami. TGF-β receptory jsou i na stejných buňkách => para- i autokrinní působení. TGF-β působí jak angiogenně, tak angiostaticky, např. nízké koncentrace TGF-β1 podporují proliferaci EC a tvorbu cév in vitro, vysoké koncentrace opak. Významně ovlivňuje diferenciaci EC a SMC. Stimuluje angiogenezi i nepřímo – stimuluje leukocyty, a ty pak produkují pro-angiogenní cytokiny. Faktor nekrotizující nádor alfa (TNF-α) CXC-chemokiny Pro-zánětlivý cytokin sekretovaný zejména monocyty a makrofágy, ale i fibroblasty i epiteliálními buňkami. TNF-α působí jak angiogenně, tak angiostaticky: nízké koncentrace podporují proliferaci EC a tvorbu cév, vysoké koncentrace inhibují angiogenezi. Jeho působení je významně inhibováno interferonem-γ. Protikladné působení záleží na chemické struktuře. IL-8 nebo „Granulocyte Chemoatractant Protein-2“ (GCP-2) mají chemotaktický efekt na EC a stimulují angiogenezi. „IFN-inducible Protein-10“ a „Platelet Factor 4“ jsou naopak inhibitory angiogeneze. Ostatní angiogenní faktory Epidermální růstový faktor (EGF) a Transformující růstový faktor alfa (TGF-α): • oba se váží na EGF receptor • stimulují proliferaci EC a tvorbu cév in vivo a in vitro X důležité faktory vyvolávající pathologickou tvorbu cév v rámci tvorbě nádorů Faktory stimulující růst kolonií granulocytů/granulocytů a makrofágů (G-CSF, GM-CSF): • stimulují proliferaci a diferenciaci prekurzorů (hemangioblastů, angioblastů) do EC Angiogenin a Angiotropin: • stimulují tvorbu cév a adhezi EC (ne migraci či proliferaci) Inzulinu podobný růstový faktor (IGF): • stimuluje syntézu VEGF Hepatocytární růstový faktor (HGF): • indukuje migraci, proliferaci a prevenci apoptózy u EC a SMC Placentální růstový faktor (PlGF): • stimuluje tvorbu cév a adhezi EC Tkáňový faktor a Faktor V: • stimulují tvorby cév Erytropoetin: • stimuluje proliferaci EC a formaci cév Angiogenní faktory Vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF; „Vascular Endothelial Growth Factor“) Fibroblastový růstový faktor (FGF; „Fibroblast Growth Factor“) Angiopoetin (Apo) Růstový faktor pocházející z destiček (PDGF; „Platelet-derived Growth Factor“) Transformující růstový faktor beta (TGF-β; „Transforming Growth Factor beta“) Faktor nekrotizující nádor alfa (TNF- α; „Tumor Necrosis Factor alpha“) CXC-chemokiny Angiostatické faktory Angiostatin Endostatin Tumstatin Trombospondin (TSP) „Pigment epithelium-derived factor“ (PEDF) Angiostatin Vzniká z plasminogenu štěpením různými proteázami (MMP) a následně cirkuluje v krvi. Blokuje proliferaci, migraci, diferenciaci EC a SMC. Blokuje tvorbu cév, neovaskularizaci a metastáze. Inhibuje efekt HGF a tvorbu ATP v buňkách Endostatin Tumstatin Vzniká z kolagenu podobně jako endostatin štěpením z ECM. Vzniká z kolagenu XVIII štěpením různými proteázami (elestáza). Blokuje proliferaci a migraci EC. Vyvolává apoptózu EC. Inhibuje efekt FGF-2 a VEGF zejména u nádorových buněk. Trombospondin (TSP) Rodina proteinů extracelulární matrix TSP-1 až 5. TSP-1 a TSP-2 mají silné angiostatické působení in vivo. TSP-1 in vitro inhibuje migraci a proliferaci EC, stimuluje apoptózu u EC a inhibuje tvorby cév. Dochází tak ke snížení četnosti a průměru cév nádorů. „Pigment epithelium-derived factor“ (PEDF) Produkován epiteliálními buňkami rohovky Blokuje proliferaci a migraci EC. Inhibuje angiogenezi vyvolanou FGF-2, VEGF a prozánětlivými cytokiny. Neutralizační protilátky proti PEDF způsobují invazi cév v rohovce Buněčné receptory klíčové v angiogenezi Integriny: • rodina adhezivních receptorů vážících proteiny ECM (např. kolagen) • exprese se zvyšuje u proliferujících EC (např. po VEGF) • inhibiční protilátky inhibují proliferaci EC a vyvolávají apoptózu EC VE-cadherin: • EC-specifický cadherin lokalizovaný v intercelulárních spojích • stimulace EC VEGF způsobuje modifikaci VE-cadherinu, uvolnění buněčných spojů a umožnění proliferace EC • po dosažení konfluence EC, zpětná modifikace VE-cadherinů a zpevnění vazby mezi EC „Platelet endothelial cell adhesion molecule 1“ (PECAM-1, CD31): • adheziny patřící do velké rodiny imunoglobulinů • stejně jako VE-cadherin ovlivňuje mezibuněčné spoje EC Apoptóza EC Nor at el. Angiogenesis 1999 Pro-apoptické stimuly: • TSP-1 • Angiostatin • TNF-α • TGF-β Anti-apoptické stimuly: • VEGF • FGF • NO • integriny => ztráta kontaktu s ECM = „anoikis“ • Iniciace angiogeneze • Remodelace cév • Regrese cévních struktur Patogenní angiogeneze Nor at el. Angiogenesis 1999 Retinopatie u předčasně narozených novorozenců Expozice vysokým hladinám kyslíku => masivní apoptóza EC v cévách sítnice. Po přechodu do prostředí s normální tenzí kyslíku => intenzivní neovaskularizace. Abnormální neovaskularizace => vážné poruchy zraku. Angiogeneze v patologii aterosklerózy Ribatti 2008 „Inflammatory angiogenesis in atherogenesis - a double-edged sword“Annals of Medicine Angiogeneze v patologii aterosklerózy Ribatti 2008 „Inflammatory angiogenesis in atherogenesis - a double-edged sword“Annals of Medicine Regulace angiogeneze v aterosklerotickém plaku přítomnými imunitními buňkami Virmani et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:2054-2061. Angiogeneze solidních nádorů Nádorové buňky produkují velké množství celé řady angiogenních faktorů, které stimulují angiogenezi. => Solidní tumory si tak vybudují svůj vlastní systém krevních cév pro nezbytné zásobení kyslíkem a živinami. Angiogenic factors Formation of new tumor vasculature Tumor Stádia vývoje nádorů Malignant cell Proliferation Angiogenesis Neovascular endothelial maintenance Invasion Metastatic cancer Invasion of other organs Dissemination of other organs Anti-angiogenics Vascular targeting agens Angiogenní terapie Inhibitory modifikace ECM: • inhibují rozklad ECM, syntézu a depozici kolagenu • př. Inhibitory MMP, uPA, kolagenáz Inhibitory adhesivních molekul: • blokují adhezi EC a indukují jejich apoptózu Inhibitory aktivovaných EC: • inhibují migraci a proliferaci EC • př. endostatin, angiostatin, INF-α a IFN-γ Inhibitory intracelulárního signálování EC: • inhibitory tyrozinkináz • př. genistein a lavendustin A Inhibitory angiogenních mediátorů a jejich receptorů • inhibitory FGF-2, VEGF, PDGF, COX Angiogenní terapie Kolodgie et al. Eliminating Plaque Angiogenesis. JACC Vol. 49, No. 21, 2007:2093–101 Endotelilální buňky Studium funkce cév pomocí mikrofluidních systémů Výstelka všech cév: endoteliální buňky = endotel Dospělý člověk: 1,5 kg 700 m2 Různé typy endotelu: ledviny x plíce x játra x střeva x kostní dřeň Endoteliální buňky Endoteliální buňky se aktivně podílejí na regulaci funkce cév: • bariérová funkce • protisrážlivé povrchové vlastnosti • regulace cévního tonu (vazokonstrikce, vazodilatace) • angiogeneze • imunitní reakce (adheze imunitních buněk během zánětlivého procesu) Funkce endoteliálních buněk Cévní systém Aorta Tepna Tepénka Kapilára Žilka Žíla Dutá žíla průměr tlak krve In vivo v cévě: • kruhový průřez a pružný/poddajný podklad, specifická extracelulární matrix • vystaveny působení proudící tekutiny => vytváří smykové napětí, tzv. shear stress Flow coplanar force area of the wall Proudění – laminární x turbulentní x pulsatilní Endoteliální buňky in vivo Smykové napětí = rychlost x viskozita krve (dyne/cm2) průměr => Vrstva endoteliálních buněk je nezbytnou součástí každé cévy. Smykové napětí ovlivňuje: • morfologii • genovou expresi • aktivaci eNOS a produkci NO • aktivaci membránových receptorů, integrinů, G-proteinů, iontových kanálů... Vliv smykového napětí na endoteliální buňky Současné in vitro modely pro studium endotelu Současné modely: A) statický: 2D na miskách Modely in vitro x fyziologický stav • intersticiální tok a gradient růstových faktorů • vysoké koncentrace růstových faktorů v séru • vyšší hladina kyslíku 3D v gelech B) v proudových podmínkách „Parallel-plate flow chambers“ plastový podklad, tužší než nativní tkáň nefyziologická porozita a složení Mikrofluidika Celá řada aplikací: • DNA čip • lab-on-chip nebo organ-on-chip technologie • toxikologie • chemotaxe • enzymologie • cévní biologie a endoteliání buňky Vznik 1980; multidisciplinární obor (inženýrství, biotechnologie, chemie, biochemie...). Výhody: • fyziologicky relevatní model pro kultivaci buněk • malý rozměr a použité objemy (μl, nl, pl, fl) • nízká spotřeba reagencií • proudění Mikrofluidika a cévní biologie vznik a udržitelnost mikrovaskulatury v biomateriálech Zájem: • cirkulace krve na úrovni mikrokapilár • chování endoteliálních a krevních buněk pod vlivem smykového napětí • angiogeneze pod vlivem definovaného gradientu růstových faktorů • vaskularizace mikrofluidních scafoldů výzkum hemodynamiky na úrovni kapilár, modulace toku krve r0 r1 r2 Proudění a smykové napětí Murrayho zákon r0 k = r1 k + r2 k k = 2 až 3 Reynoldsovo číslo d hydraulický průměr vs střední hodnota rychlosti proudění tekutiny v kinematická viskozita => Rozlišení laminárního a turbulentního proudění. Re = vs d v Jaké máme k dispozici mikrofluidní zařízení? Cellix • Čipy • Kima Pump • VenaFlux Platform IBIDI Vlastní výroba Cellix Čipy Vena8 Endo+/Fluoro+ Materiál – akrylový/topas Podklad – plastová fólie Napojení – osmicestný konektor/“jehličky“ Rozměry kanálku: délka 28 mm šířka 0,8/0,4 mm výška 0,12/0,1 mm Rozměry celého čipu: 50 x 40 mm Účel: Endo+: dlouhodobá kultivace EC, sledovaní interakcí imunitních buněk na EC Fluoro+: sledování vzniku thrombů a adheze lymfocytů uvnitř koutovaného kanálku Čipy Vena4Y Materiál – akrylový/topas Podklad – plastová fólie Napojení – osmicestný konektor/“jehličky“ Rozměry kanálku: délka 28 mm šířka 0,4 mm výška 0,1 mm délka větve 12 mm Rozměry celého čipu: 50 x 40 mm Účel: sledování vzniku thrombů na povrchu koutovaného kanálku v místě jeho větvení Video http://cellixltd.com/index.php/2013-09-13-12-10-06/2013-09-13-12-10-57/2013-09-13-12-12-29/pumps/kima Kima Pump Poloautomatická mikrofluidní platforma umožňující: • rolování buněk • adhezi buněk • migraci buněk pod vlivem smykového napětí Rozmezí smykového napětí pro buněčnou suspenzi: 0.05 - 10 dyne/cm2 steps of 0.05 dyne/cm2 (100 μL syringe) VenaFlux Platform Rozmezí smykového napětí pro plnou krev: 2.25 - 450 dyne/cm2 (1 mL syringe) „Steady flow“ precision, ability to aspirate and dispense microlitre sample volumes „Pulsatile flow“ investigation of effects of pulsatile flow on morphology and orientation of cells and subsequent integrin expression Princip: Adheze destiček a formace trombů je vyhodnocována na základě sledování migrace destiček v reálném čase. Mirus Evo Nanopump and MultiFlow8 IBIDI Video http://ibidi.com/xtproducts/en/Instruments-Accessories/Pump-Systems/ibidi-Pump-System µ-slide fluidní jednotka + perfuzní set pumpa + software IBIDI Pump System µ-slide I Luer Materiál – mikroskopický plast Podklad – tenká fólie Napojení – Luer Connector Rozměry kanálku: délka 50 mm šířka 5 mm výška 0,4 mm Rozměry celého čipu: 75,8 x 25,9 mm Účel: kultivace endoteliálních (a jiných) buněk v proudových podmínkách, výtěžek buněk Vlastní výroba Princip výroby: Materiál • kolagen • PDMS Metodiky pro výrobu mikrofluidních čipů silikon kolagen Vývoj nových, fyziologicky relevantních mikrofluidních čipů • Endoteliální buňky v zánětlivém procesu Náš výzkum Vznik prozánětlivého fenotypu statická kultivace, 48 h smykové napětí 15 dyne/cm2, 48 h HUVECMikrofluidní systém IBIDI: kanálky s obdélníkovým průřezem Vliv smykového napětí na morfologii endoteliálních buněk Kolářová H, Ambrůzová B et al. Modulation of endothelial glycocalyx structure under inflammatory conditions. Mediators of Inflammation 2014; ID 694312. Ambruzova et al. (2013) Use of microfluidics to achieve native phenotype of endothelial cells. GRC Research conference, Barga, Italy. Distribuce glykokalyx na povrchu HUVEC po 7-denní kultivaci HUVEC pod vlivem smykového napětí (15 dyne/cm2). Změna exprese vybraných genů významných složek glykokalyxu na povrchu HUVEC po 7-denní kultivaci EB pod vlivem smykového napětí (15 dyne/cm2). Vliv smykového napětí na endoteliální glykokalyx Endoteliální buňky (HUVEC) aktivované TNF-α Směr toku Smykové napětí 15 dyne/cm2 Mikrofluidní systém Cellix kanálky s obdélníkovým průřezem 0 10 20 30 40 50 60 0 50 100 NeutrophilnumberperFoV Time (s) Ctrl attached TNFa attached MPO attached Smykové napětí 15 dyne/cm2 Adheze neutrofilů k endoteliálním buňkám v proudových podmínkách Akumulace neutrofilů při krajích kanálku • Výzkum formace a degradace trombů v proudových podmínkách Náš výzkum biologické faktory chemické faktory fyzikální faktory Důležitá pro léčbu celé řady nemocí: mrtvice, infarkt myokardu, plicní embolie, žilní trombóza ucpání cévy obnovení průtoku Příprava trombu degradace trombu Trombolýza Fluidní in vitro model: • jednokanálkový model • systém větvených kanálků 8 kanálů: • hloubka 0,1 mm šířka 0,4 mm délka 28 mm • objem 1,12 μl • tloušťka substrátu na dně 0,17 mm • vWF, kolagen, fibrinogen Trombóza: Adheze destiček na biočip koutovaný vWF při napětí 60 dyne/cm² http://1url.cz/8wEs Trombóza: Adheze destiček z plné krve na biočip koutovaný kolagenem při napětí 30 dyne/cm² http://1url.cz/MwET Vena8 Fluoro+ Biočip – formace trombu in vitro 4 kanály: • hloubka 0,1 mm šířka 0,4 mm délka 28 mm • objem 1,6 μl objem větve 0,48 μl • tloušťka substrátu na dně 0,5 mm • vWF, kolagen, fibrinogen Vena4Y Flow Assay http://1url.cz/Hw2R Vena4Y Biočip – formace trombu in vitro První pokus: • koutování: lidský kolagen bovinní kolagen 100/250 μg/ml • promytí PBS • plná krev, destičky – kalcein • 120/60 dyne/cm2 Yohannes FG et al.; 2008 Formace trombu in vitro – statické podmínky