Moderní laboratorní přístupy v cytogenetice člověka DNA čipy a metoda MLPA Jan Smetana a kol. Ústav experimentální biologie PřF MU v Brně Odd. lékařské genetiky FN Brno Joe Hin Tjio (1919 - 2001) Tjio, T.H., Levan, A.: The chromosome number of man. Hereditas 42:1, 1956 ěk má v jádře každé své tělní buňky 23 párů chromozomů, celkem má tedy 46 chromozomů Albert Levan (1905 -1998) 1956 - spočítání lidských chromozomů In situ hybridizace ■ . ■Rudkin GT, Stollar BD. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 1977 Feb 3;265(5593):472-3. 80 léta – fluorescenční in situ hybridizace 80 léta – objev PCR reakce /K. Mulvis ■Vytvoření (amplifikace) identických kopií určitého úseku DNA za specifických podmínek (Termocyklery) Možnosti vyšetření karyotypu člověka ■ Metafázní cytogenetika ● Interfázní cytogenetika ● Cytogenetika založená na izolaci DNA Mikročipové technologie MLPA SKY Molekulární karyotypování – 1000x citlivější než klasická cytogenetika Komparativní genomová hybridizace (CGH) Science, 1992 zelená - zisk červená - Referenční DNA Testovaná DNA Komparativní genomová hybridizace (CGH) ▪ umožňuje během jedné hybridizační reakce stanovit ztráty (delece) či zisky (duplikace, amplifikace) sekvencí DNA v celém genomu ▪rozlišovací schopnost – 10 Mb, klonální zastoupení – 50 % ▪ nevyžaduje mitotickou aktivitu zkoumaných buněk HR-CGHCGH rev ish enh (17,Y) rev ish dim (14) rev ish enh (1,2,6,7,12q,17,19,22,Y) rev ish dim (3,4,8,9,10,11,14,15,20,21) Výsledek vyšetření pacienta s neuroblastomem pomocí CGH a HR-CGH - profily ■ Array- CGH CG H Technika array-CGH aneb rozdíl je jen v podkladě… Solinas-Toldo et al., Genes, Chromosomes, Cancer (1997): Matrix - CGH nahrazení chromozomů separovanými klony - BAC, PAC, c-DNA klony, oligonukleotidy ~ 35 kb Typy DNA čipů Zdroje cílových DNA Agilent Technologies CGH microarrays http://www.youtube.com/watch?v=eSr5CxAdiww • Fotolitotrofické spotování – technologie Inkjet Printing technology • Postup používaný při mikrovýrobě pro selektivní opracování částí tenkých vrstev nebo materiálu podložky • Pro přenos geometrických obrazců (motivů) do chemicky aktivované vrstvy nanesené na podložce se používá světlo Formáty DNA čipů Agilent Příprava DNA čipů pro techniku array-CGH 5. Scanner www.agilent.co m Kontrola kvality (QC metrics) ■ DLRSpread - odchylka od průměru intenzity signálu v jednom spotu - výše „šumu (noise)“ na vzorek (DLRs < 0,3) ■ Signal Intensity – pro kažý fluochrom (Cy3 > 250, Cy5 > 350) ■ Backgronud noise – intenzita nespecifických signálů pozadí (< 10) ■ Signal to Noise Ratio – vzdálenost hodnoty signálu od hodnoty pozadí = s jakou jistotou je SW schopen odečíst intenzitu spotu od pozadí Princip hodnocení CGH dat Hodnotíme rozdíl mezi intenzitou fluo signálu mezi vzorkem DNA a referencí vyjádřený jako log2X(= vzorek / reference). Data jsou lehce komprimovaná kvůli biologické variabilitě vzorku Description Average Sample CN Ref CN Ratio (S/R) Ideal Log2(Ratio) Actual data Diploid 2 2 1 0 0 Deletion 1 2 0.5 -1 -0.9 Trisomy 3 2 1.5 +0.58 +0.53 50% mosaic deletion 1.5 2 0.75 -0.41 -0.37 50% mosaic trisomy 2.5 2 1.25 +0.32 +0.29 20% mosaic Princip hodnocení CGH dat „matematika cgh“ Description Average Sample CN Ref CN Ratio (S/R) Ideal Log2(Ratio) Actual data Diploid 2 2 1 0 0 Deletion 1 2 0.5 -1 -0.9 Trisomy 3 2 1.5 +0.58 +0.53 50% mosaic deletion 1.5 2 0.75 -0.41 -0.37 50% mosaic trisomy 2.5 2 1.25 +0.32 +0.29 20% mosaic deletion 1.8 2 0.9 -0.15 -0.13 20% mosaic trisomy 2.2 2 1.1 +0.14 0.12 Princip hodnocení CGH dat „matematika cgh“ Hodnotíme rozdíl mezi intenzitou fluo signálu mezi vzorkem DNA a referencí vyjádřený jako log2X(= vzorek / reference). Data jsou lehce komprimovaná kvůli biologické variabilitě vzorku Analýza oblastí UPD /LOH Analýza oblastí UPD /LOH Analýza oblastí UPD /LOH Analýza oblastí UPD /LOH Historie array CGH v Laboratoři molekulární cytogenetiky 300 BAC array GenoSensorAbbott-Vysis 105K a 244K oligo arrayAgilentTechnologies 44K CytoSureOGT 15K oligo arrayAgilentTechnologies Custom čip pro MM 44K oligo arrayAgilentTechnologies 2005 2007 2008 2009 2011 CGH a SNP 180K oligo arrayAgilentTechnologies Využití array CGH v klinické diagnostice na OLG FN Brno Klinická cytogenetika Postnatální vyšetření pacientů OLG (pacienti s MR/VVV) ▪ Od roku 2007 ▪ 44K Agilent Technologies ▪ 44K CytoSure OGT (Syndrome Plus) ▪ 105K, 244K Agilent Technologies ▪ 180 K Agilent Technologies Nádorová cytogenetika Vyšetření pacientů KDO (neuroblastom) ▪ Od roku 2009 ▪ 44K Agilent Technologies Vyšetření pacientů s mnohočetným myelomem ▪ Od roku 2009 ▪ 44K Agilent Technologies Neuroblastom ▪ pevný dětský nádor sympatického nervového systému ▪ 5–10 případů /106 dětí/rok ▪ 10 % rakoviny v dětském věku; 50 % do 2 let; 90 % do 6 let ▪ klinická stádia (1,2 / 3,4; 4S) (International Staging System for Neuroblastoma) G.M.Brodeur et al., 1995: Molecular Basis for Heterogeneity in Human Neuroblastomas Charakteristika TYP I (LR) Typ II (IMR) TYP III (HR) N-myc normální normální amplifikováno 1p36 LOH ne ±ano obvykle ano Ploidie hyper2n / 3n 2n / 4n 2n / 4n Věk* obvykle < 1rok obvykle = 1 rok obvykle 1-5 let Stadiumo obvykle 1, 2, 4s obvykle 3, 4 obvykle 3, 4 Pravděpodobnost přežití 3 roky 95% 25-50% < 5% * v době stanovení diagnózy • International Staging System for Neuroblastoma Význam array CGH u dětských pacientů s neuroblastomem Mnohočetný myelom (MM) ➢ hematoomkologické onemocnění, jehož podstatou je maligní transformace B-lymfocytů na maligní plazmocyty - akumulace plazmocytů buněk v kostní dřeni ➢ klinické projevy: destrukce kostí, anemie, porucha protilátkové imunity, myelomová nefropatie ... ➢ Postihuje zejména starší osoby, v současné době nevyléčitelný x udržitelnost ➢ Výrazně geneticky heterogenní – aCGH screening + FISH (IgH) Array CGH u pacientů s MM Status 5 Year Survival (%) Pseudodiploid 49.9 Near-tetraploid 34.6 Hyperdiploid 33.5 Hypodiploid 10 Debes-Marun CS et al. “Chromosome abnormalities clustering and its implication for pathogenesis and prognosis in myeloma”. Leukemia (2003), 17:427- 436 Hyperdiploidie u MM Non-hyperdiplodní MM Význam array CGH u pacientů s MM Hyperdiploidní MM + chromotripsis 18 Mentální retardace (MR): příčiny ■ Výskyt MR u 2-3 % populace ■ 17- 20% pacientů s idiopatickou PMR kauzální nebalancované aberace celogenomový screening pomocí array-CGH Častý nález CNV - mikrodelecí/mikroduplikací v genomu - mohou být postiženy různé chromozomy Array-CGH a variabilita v počtu kopií (CNVs) • doposud detekováno 29 133 CNV • 12 % lidského genomu obsahuje CNV • 0,12 – 7,3 % rozdíly v CNV mezi jedinci • 41 % všech CNV pokrývá geny CNV patogenní x benigní CNV nejasného významu CNVs – segmenty DNA větší než 1 kb přítomné ve variabilním počtu kopií v porovnání s referenčním genomem Array-CGH u pacientů s MR - korelace genotypu s fenotypem Databáze jsou důležité pro: ■ klinickou interpretaci výsledků array-CGH ■ identifikaci kauzálních regionů pro nové chromozomové syndromy ■ možnost vyhledat stejnou či podobnou aberaci a srovnat fenotypové projevy ■ možnost rozlišení benigních CNVs ■ odhad prognózy dle typu a funkce genů nacházejících se v sledované oblasti Array-CGH u pacientů s MR - korelace genotypu s fenotypem Využití web. databází k interpretaci výsledků ■ DECIPHER: ■ ECARUCA: ■ GENOGLYPHIX: ■ CARTAGENIA BENCH: Syndrom AMME Alportův syndrom s mentální retardací, mid-face hypoplazií a eliptocytosou. Vyřešení neobjasněné kazuistiky z r. 2005 ■ první popsaný případ v ČR Vranová, V., Hladílková, E., Hořínová, V., Kuglík, P.: Chromosome Xq22.3 gene deletion syndrome (ATS-MR) in a Czech family: additional characterization of the clinical and molecular aspects. O.M. nar. 2005 ■ Na JIP v Brně 3 měsíce: ■ Dg.: Sepse, respirační selhání, neonatální hepatitida nejasné etiologie, zdvojení ledv. pánvičky vlevo, hyperechogenita ledvin, DAP s plic. hypertenzí a chlopenní insuficiencí, aortopulmonální kolaterály ■ Genetické vyšetření: stigmatizovaný novorozenec – plochý obličej, hypertelorismus, epicanthy, vpáčený široký kořen nosu, dyspl. nízko posazené ušní boltce, krátký hrudník, mikropenis, kryptorchismus, opičí rýha ■ karyotyp 46,XY ■ CGH negativní Strýc R.V. nar. 1988 sy Wiedemann-Rautenrausch ■ Ze II. gravidity, nekomplikované, porod ve 39. t.g., s.z., p.v. 2900/49cm, hosp. v DN po porodu s dg. stigmatizace, glykosurie, hyperbilirubinemie, plicní hypertenze, neprospívání. ■ II. hospitalizace ve VÚPs dg. stigmatizace, hepatopatie, snížená funkce levé ledviny, PMR. ■ Vyšetřen na OLG: plochý obličej, hypertelorismus, epicanthy, hypoplasie nosních kostí, kapří ústa, opičí rýhy, náznak srůstů 2-3. prstů DK, mikropenis, kryptorchismus. ■ Karyotyp 46,XY Strýc v roce 2006 Naše rodina Velikost delece – naši pacienti Alport syndrome with Mental retardaton, Midface hypoplasia and Elyptocytosis ■1. publikace 1998 J.Johnsson, F.Vitelli, Piccini M. a spol.: Delece COL4A5 genu ■Do r. 2008 popsané 2 rodiny ■Xq22.3 ■COL4A5 a FACL4 geny ■Pojmenovali gen AMMECR1 Konsangvinita – CGH+SNP arrays Konsangvinita – CGH+SNP arrays ■ Parciální UPD > 10 Mbp na chr 1pq, 2p,5q, 7pq, 11q, 12q, 14q, 16q Konsangvinita – CGH+SNP arrays Preimplantační genetický screening pomocí array-CGH Preimplantační genetický screening pomocí array-CGH Preimplantační genetická analýza „Single cell genomics“ pomocí oligo aCGH • Využití technik single cell amplifikce (Rubicon) – z 5 -15 pg DNA amplifikovat 1,5 – 2 ug gDNA • Potřeba ideální poměr cena / rychlost analýzy / objem a reprodukovatelnost dat • Agilent 8x60k - rámci jednoho experimentu detekce aneuploidií, strukturních CNAs (> 1,5 Mbp), i nebalancovaných translokací Časová kalkulace Příjem vzorku Den 1 Amplifikace a přečištění vzorku 4 hodiny (den 1) Array-CGH protokol (značení, příprava čipu) 5 hodin (den 1) Hybridizace 20 hodin Odmývání, skenování 3 hodiny (den 2) Softwarová analýza (kontrolní čtení výsledků) 4 hodiny (den 2) Celková doba do vydání výsledku (protokol) 36 hodin Array-CGH – standardní validovaný protokol DNA čip 8x60K – 8 vzorků 5. denní embrya - odběr - vitrifikace Obecné schéma: pokud jsou vzorky ráno v připraveny v laboratoři, druhý den odpoledne jsou k dispozici výsledky ▪ nejčastější monozomie: chromozom 22, 7, 16, 8 ▪ nejčastější trizomie: chromozom 15, 20, 21, 22, 13, 16 PGS shrnutí array-CGH za 2013-2014 PGS shrnutí array-CGH za 2013-2014 ■ Mitotické poruchy = STRUKRURNÍ CNAs ■ cca10% případů ■ medián velikosti 26,2 Mbp ■ 2 případy nebalancované translokace Preimplatntační genetická analýza „Single cell genomics“ pomocí oligo aCGH ■ Genomový profil z buněk trofoektodermu 5 denního embrya. Nalezené aberace: +3,+14,- 19. Basic Research Pre-Clinical Toxicology Quality Control Clinical Trials Diagnosis Prognosis Rx Choice Expression Variability (mRNA Analysis) Sequence Variability (DNA Analysis) A/A B/BA/B Resequencing A C G T A A A T A G G A T T G G C A T Multiple Formats Multiple Questions Multiple Apps Mikročipy Affymetrics Array-CGH vs. SNP mikročipy Affymetrics SNP mikročipy 6.0 Affymetrics SNP mikročipy 6.0 Genová exprese = množství RNA produkované aktivitou genu 0 100 200 300 400 500 Intensit y Normal Cell Line 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 1 63 65 67 69 71 73 787 89 91 93 95 97 Genes 0 100 200 300 400 500 Intensit y Malignant Cell Line 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 56 5 67 69 Genes DNA RNA Proteins Nucleus Cell membrane DNA RNA Proteins Nucleus Cell membrane Expresní mikročipy Affymetrics Struktura Affy GeneGenechip 5” 5” Up to ~6,500,000 features/chip 1.28c m 1.28c 5µm 5µm ** * *** Millions of identical probes/feature Affymetrix GeneChip® ArrayStruktura Affy GeneGenechip Využití GeneChip technologie v praxi Agricultural biotech Livestock diagnostics or grading Human diagnostics Environmental testing Food testing Basic Research Identity testing Individualized medicine Klasifikace leukémií pomocí expresních mikročipů GeneChip ALL AML Který typ leukémie ? Golub, T.R., et al. Science 286: 531-537, 1999; Armstrong, S.A., et al. Nature Genetics 30: 41- 47, 2002 MLL Děkuji za pozornost