Molekulární základy nádorového onemocnění Protoonkogeny a Onkogeny Nádorově supresorové geny Epigenetické mechanizmy Imortalizace buněk 2 Vědecký thriller o rakovině, „vládkyni všech nemocí“, udivuje čtenáře celého světa svým strhujícím tempem a hluboce lidským vyzněním. Jeho autor Siddhartha Mukherjee, lékař, vědec a oceňovaný spisovatel, se na nádorové onemocnění dívá s precizností buněčného biologa, s nadhledem historika a se zaujetím životopisce. Výsledkem je úžasně poutavá kronika nemoci, s níž lidé žijí a umírají více než pět tisíc let. Mukherjee byl za svou knihu oceněn Pulitzerovou cenou (2011) a cenou deníku Guardian. Časopis TIME dílo zařadil mezi sto nejvlivnějších anglicky psaných knih od roku 1923 a New York Times Magazine mezi sto nejlepších odborných knih všech dob. Přeložil prof. Jan Šmarda Molekulární podstata nádorového bujení Nádor vzniká ze společné buňky, ve které byl - mnohdy desítky let před vznikem viditelného nádoru - zahájen program neregulovaného dělení. Maligní transformace buňky probíhá přes akumulaci mutací ve specifických třídách genů. Existují dvě třídy genů (onkogeny a nádorově supresorové geny), které dohromady tvoří jen malou část celé genetické výbavy, ale hrají hlavní úlohu v zahájení procesu tvorby nádoru. Ve své normální konfiguraci řídí životní cyklus buňky, tj. sled dějů, při kterých se buňka zvětšuje a dělí. (klíč k porozumění procesů v základech lidské rakoviny) 3 Protoonkogeny jsou normální buněčné geny mající základní význam ve fyziologii buňky. Hrají úlohu především v regulaci životního cyklu buněk: • Buněčného cyklu • Buněčné proliferace • Diferenciace • Apoptózy V průběhu evoluce dobře konzervovány a jejich přítomnost v normálních buňkách všech vyšších organismů předpokládá, že mají základní význam v buněčné fyziologii. Kódují proteiny, které hrají klíčovou na různých úrovních integrace mitogenních signálů nesených růstovými faktory a hormony. Jsou-li modifikovány, ať na strukturální nebo kontrolní úrovni, začnou se chovat jako onkogeny a podporují vývoj nádoru. Onkogeny mutované nebo aktivované protoonkogeny Proces karcinogeneze zahrnuje změněné exprese nebo funkce protoonkogenů na různých stupních transdukce signálů. Nádorově supresorové geny (antionkogeny) zabraňují abnormální buněčné proliferaci a ztráta jejich funkce podporuje růst nádorů (pRB, p53). 4 V posledních desetiletích byla objevena řada genů odpovědných za vývoj nádorů. Na porozumění maligní transformaci má zásluhu zejména široká škála dřívějších prací s onkogenními viry. První tzv. Onkogen s r c (sarcoma) byl izolován z viru Rousova sarkomu u kuřat. Virus Rousova sarkomu má dvě rozdílné části: část kódující proteiny odpovědné za replikaci viru a část kódující s r c gen umoňující vznik nádorů in vivo u kuřat. Normální kuřecí genom obsahuje příbuzný gen c-src. Později se ukázalo, že řada retrovirů je onkogenních. Bylo též prokázáno, že src není jednoznačně retrovirový gen, ale spíše téměř přesná kopie genu nalezeného ve všech kuřecích buňkách. Tento normální gen, tzv. protoonkogen je v retroviru modifikován (aktivován) tak, že působí po přenesení do buněk nádor. Objev s onkogeny příbuzných sekvencí v eukaryotickém genomu stimuloval úsilí transformovat normální buňky DNA stejným způsobem jaký užívají retroviry. 5 Životní cyklus viru Rousova sarkomu The Rous sarcoma virus has only 4 genes (bottom panel): gag, which encodes the capsid protein pol, which encodes the reverse transcriptase env, which encodes the envelope protein src, which encodes a tyrosine kinase, an enzyme that attaches phosphate groups to Tyr residues on a variety of host cell proteins. In addition, each end of the RNA molecule has a set of repeated sequences of nucleotides ("R" and "P") that perform at least two important functions: they enable the DNA copies of RSV to insert into the host's DNA and they act as enhancers, causing the host nucleus to transcribe the RSV genes at a rapid rate. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/RSV.html Srovnání viru myší leukemie, viru Rousova sarkomu a inzerce c-src do hostitelské DNA Normální a transformované myší fibroblasty Protoonkogeny lze dělit podle : • lokalizace jejich produktu na ty, které kódují 1) sekreční proteiny 2) proteiny buněčného povrchu 3) cytoplasmatické proteiny 4) jaderné proteiny • funkce jejich produktů na 1) růstové faktory (např. sis, hst), 2) receptory pro růst. faktory (např. fms, kit, erb B), 3) cytoplasmatické proteiny - protein kinázy (např. raf) a G-proteiny (např. ras), 4) jaderné proteiny (např. myc, myb, fos, jun) Jaderné protoonkogeny jako jsou c-myc, c-fos, c-jun, c-myb - tzv. geny rané odpovědi (immediate early genes) a jejich produkty jsou proteiny vážící se na DNA a fungující jako tzv. transkripční faktory, které regulují transkripci pozdních genů. Jsou většinou aktivovány overexpresí, která může být indukována různými způsoby: • translokací (Burkitt lymphoma) • insercí retroviru (spíše v experimentálních systémech) • amplifikace genů - to je obecný mechanizmus aktivace jader protoonkogenů a byla pozorována u řady nádorů. 9 Růstové faktory Přenos signálů a růstová regulace v eukaryotických buňkách. Jsou znázorněny reprezentativní protoonkogeneny v signálních dráhách. Receptory pro růstové faktory • EGF • TGFα • TGFβ • IGF • EGF-R • NEU • PDGF-R Jaderné protonkogeny Geny pro růstové faktory myb myc fos jun G-protein Tyrozin kinázy Protein kináza C ras, rev src, abl 10(podle Miller D.M. et al, The American J Med Science 299, 1990:59-69) Onkogeny a nádorově supresorové geny Externí signály Přenos externích signálů Jaderné děje Růstové faktory Transmembránové receptory Tyrozinové kinázy GTP-vazebné proteiny Serin - treoninové kinázy Replikace DNA Metabolická odpověď Hlavní funkční skupiny onkogenních proteinů a jejich pravděpodobná vnitrobuněčná lokalizace. Nádorově supresorové geny jsou označeny červeně. sls hst erb B fms kit ros met neu trk src fgr fes lck yes ras rap GTP mos raf Rb myc sls ets p53 jun fos myb mas 11 (podle Rey I et al., Fundam Clin Pharmacol 4, 1990:401-422) Mutace protoonkogenu vedoucí k transformaci můžeme funkčně rozdělit do dvou tříd: • získání funkce (gain-of-function) aktivita protoonkogenu vzrůstá a má za následek abnormální nebo nadměrmou růstovou stimulaci • ztráta funkce (loss-of-function) vede k inaktivaci represorové složky, která normálně negativně ovlivňuje buněčnou proliferaci (nádorově supresorové geny - p53, RB, geny pro antiproliferační molekuly -TGF , TNF, interferon ) V obou případech je výsledkem nadměrná stimulace růstu. 12 Geny kritické pro vývoj nádorů spadají do dvou jasně rozlišitelných kategorií: dominantní a recesivní 13 Tři způsoby aktivace a změny protoonkogenu v onkogen 14 Šest způsobů ztráty zbývající dobré kopie nádorově supresorového genu 15 Spektrum účinků p53 v modulaci přežívání a frekvence změn genu p53 u lidských nádorů 16 RŮSTOVÁ STIMULACE A INHIBICE Mnoho protoonkogenů kóduje proteiny mající vztah k růstově stimulačním signálům přecházejících z vnějšího prostředí do nitra buňky. Růst buňky je deregulovaný, jestliže mutace v protoonkogenu způsobící trvalou aktivaci růstově stimulační dráhy. Toto souvisí se signály, které si navzájem předávají buňky v tkáních. Jedny buňky uvolňují růstové faktory, (glyko) proteiny, které se pohybují mezi buňkami a po vazbě na vhodný receptor na povrchu jiných buněk vyvolávají kaskádu dějů, které přenáší tento signál přes cytoplazmu až do jádra. V jádře pak proteiny nazývané transkripční faktory odpovídají tím, že aktivují řadu genů, které pomáhají buňce procházet buněčným cyklem. Podobně funguje i přenos růstově inhibičního signálu zprostředkovaného proteiny kódovanými nádorově supresorovými geny. V normální buňce je rovnováha stimulačních a inhibičních signálů pečlivě regulována, protože to souvisí s regulací buněčného cyklu, který je rozhodující pro buněčnou proliferaci a diferenciaci. V nádorové buňce je v důsledku změn v signálních drahách organizace buněčného cyklu narušena. 17 Autokrinní signál Při buněčné transformaci a karcinogenezi se uplatňují autokrinní mechanismy (vznik autokrinní smyčky) - neplánovaná produkce růstových faktorů buňkami nesoucími odpovídající receptory nebo aberantní exprese receptorů. Ve skupině stejně signálujících buněk dostává každá buňka silný autokrinní signál Signál pouze z jedné buňky – buňka obdrží slabý autokrinní signál 18 Buňka je vybavena také zpětnovazebnými mechanizmy, které mohou působit proti neobvyklým změnám v procesu bun. dělení. Apoptóza - schopnost buňky spáchat za určitých podmínek „sebevraždu“, tj. jestliže její základní komponenty jsou porušeny nebo jestliže je její kontrolní systém deregulován. Tak působí např. poškození chromozomální DNA. V tomto procesu se účastní také specifické geny např. p53 nebo bcl-2. Mutace těchto genů pak způsobují poruchy apoptózy. Bylo zjištěno, že neschopnost apoptózy přispívá ke vzniku nádorů a k jejich rezistenci k terapii. 19 Hawkins RA et al., J. Pathol. 185, 1998:61-70) Gap Junction -- A Normální, kontrolovaný růst Nádorově supr. geny Onkogeny ++ B Abnormální růst, ale ještě nějak kontrolovaný Nádorově supr. geny Aktivované okogeny Iniciace C Nekontrolovaný růst Ztráta nádorově supr. genů Aktivované onkogeny D Nekontrolovaný růst Aktivace více onkogenů Nádorově supr. geny Aktivované onkogeny Nefunkční mezibuněčná komunikace nebo -- -- ++ +++ ++ Gap Junction 20 Poznatky o molekulárně genetické podstatě nádorového onemocnění lze shrnout takto: • primární pro vznik nádoru jsou změny vyvolané jak genetickými (mutace v DNA) tak negenetickými příčinami (ovlivnění exprese genů) • karcinogeneze je několikastupňový proces založený na poruše genetické homeostázy a pouze dílčí změna v kterémkoliv článku ke vzniku nádoru nevede • ke vzniku nádoru může vést jen kombinace poruchy několika různých mechanizmů, přičemž cesty, kterými se tak děje mohou být velmi rozdílné • byly nalezeny velké individuální a mezidruhové rozdíly i tkáňová a orgánová specifita ve spojitosti se vznikem nádorů • na vzniku nádoru se mohou významně podílet látky z vnějšího prostředí 21 Počet somatických mutací u reprezentativních lidských nádorů Genomové sekvenovací studie A) Počet nesynonymních mutací (medián) u různých typů dětských či dospělých solidních nádorů B) Medián počtu nesynonymních mutací (horizontálně 25 a 75% kvartil) Synonymní mutace – nemění smysl kodonu a tak ani pořadí aminokyselin v proteinu Nesynonymní mutace – inzerce či delece nukleotidu způsobí „frameshift“ mutaci, která míchá kodóny a způsobí změnu proteinu (mohou hrát pozitivní úlohu v přírodním výběru) MSI – nestabilita mikrosatelitů SCLC – malobuněčný nádor plic NSCLC – nemalobuněčný nádor plic ESCC – karcinom jícnu EAC – adenokarcinom jícnu 22 Vogelstein B. et al. Science 2013 Celkové změny ovlivňující geny kódující proteiny u vybraných nádorů 23 SBS – záměna jedné báze Indels – malé inzerce a delece Počet a distribuce „driver gene“ mutací • „Driver“ versus „passanger „ genové mutace. „Driver geny“ příčinně souvisejí s rozvojem karcinogeneze (poskytují selektivní růstovou výhodu), kdežto „passanger“ geny ne a jsou pouze by-produktem genomové nestability. Jejich rozlišení genomovými analýzami je velmi důležité pro diagnostiku a terapii. 24 Vogelstein B. et al. Science 2013 Signální dráhy nádorových buněk a procesy, které regulují • Driver geny mohou být klasifikovány do 1 či více z 12 drah, které přispívají k selektivní růstové výhodě a můžeme je přiřadit ke 3 základním buněčným procesům (kontrola a udržení genomu, buněčné přežití a osud buněk). 25Vogelstein B. et al. Science 2013 Dráhy signální transdukce ovlivňované mutacemi u nádorových buněk • Dvě reprezentativní dráhy (RAS a PI3K) – proteinové složky kódované driver geny – červeně, místa fosforylace – žlutě. Znázorněny terapeutické látky zasahující některé signální složky. 26 RTK – receptorové tyrosin kinázy, GDP – guanosin difosfát, MEK – MAPK kináza, ERK – extracellular signal regulated kinase, NFkB – nukleární faktor kB, mTOR – mammalian target of rapamycin Vogelstein B. et al. Science 2013 4 typy genetické heterogenity nádorů Primární nádor pankreatu a jeho metastázy v játrech 27 Mutace primárního nádoru vytváří klonální heterogenitu (základní mutace a 4 subklony). A) Intratumorální heterogenita – mezi buňkami prim. nádoru B) Intermetastatická heterogenita – mezi různými metastázami téhož pacienta C) Intrametastatická heterogenita –mezi buňkami každé rostoucí metastázy D) Heterogenita mezi nádory různých pacientů. Mutace v základní buňce nádoru jsou zcela odlišné. Vogelstein B. et al. Science 2013 Genetické změny a progrese kolorektálních nádorů • Hlavní signální dráhy podporující karcinogenezi na přechodu jednotlivých stádií nádoru. 28 Vogelstein B. et al. Science 2013 Souhrn 29 Epigenetické změny v karcinogenezi Nádorová epigenetika Epigenetika – dědičné změny v genové expresi beze změn v sekvenci DNA Epigenetické změny hrají významnou úlohu v karcinogenezi. Savčí buňky mají schopnost epigeneticky modifikovat svůj genom prostřednictvím změn metylace DNA a acetylace histonů. Metylace DNA kovalentní přidávání metylových skupin do 5 pozice na cytosinovém kruhu v CpG dinukleotidu s účastí enzymu metyltranferázy. Přibližně 70% CpG zbytků v savčím genomu je metylováno, ale většina genomu je chudá na CpG (2-5%). Distribuce je nerovnoměrná – nahromaděny buď v rozsáhlých repetitivních sekvencích (satelity, centromerické repetice) nebo v krátkých úsecích bohatých na CG, tzv. „CpG islands“ (především v promotorových úsecích genů, blízko místa startu transkripce). Jsou normálně nemetylované a tak je umožněna transkripce genů za přítomnosti příslušného transkripčního faktoru. 31 Metylace cytosinových zbytků je spojena s • navázáním specifických proteinů (methyl-binding domain proteins) • aktivací histon deacetyláz (HDAC) a histon metyltransferáz • modifikací histonů • kondenzací chromatinu • transkripční inaktivací příslušného genu. Souhra metylace CpG ostrůvků pomocí metylačních a demetylačních enzymů je jednou z částí epigenetické kontroly zárodečné a tkáňově specifické genové exprese. Repetitivní genomické sekvence roztroušené mezi zbytkem genomu jsou naopak silně metylovány a hrají asi roli ve vývoji nekódujících oblastí DNA a v utlumení endoparazitických a retrovirových transpozónů. Metylace DNA tedy hraje zásadní úlohu v normálním vývoji, v inaktivaci chromozómu X a supresi tzv. parazitických sekvencí DNA. Umožňuje „zapínat a vypínat“ geny na správném místě a ve správné době. 32 Úloha v karcinogenezi Hypo- nebo hypermetylace DNA (obsah 5-metylcytosinu) patří mezi epigenetické mechanizmy karcinogeneze. Metylační struktura v nádorových buňkách se liší od normálních buněk. Globální hypometylace genomu je doprovázena místně specifickou hypermetylací. ● Hypermetylace promotorů pro nádorově supresorové geny v CpG „islands“ je doprovázena jejich utlumením a růstovou výhodou pro tyto buňky. ● Hypometylace DNA je naopak spojena se zvýšenou genovou expresí. ● Metylace DNA může usnadňovat mutagenezi (5MeC může spontánně deaminovat na tymin - hypermutabilita). 33 Inaktivace nádorově supresorových genů Klíčovým mechanizmem je aberantní metylace DNA v promotorové oblasti. Může způsobit zvýšení mutací a dědičně tlumí geny, jejichž promotory jsou asociovány s CpG „islands“ a které kontrolují buněčnou proliferaci. Zatím neznámé mechanizmy zabraňují de novo metylaci těchto promotorů u normálních buněk. Metody využívané pro analýzu metylace Důkazy spojitosti mezi metylací DNA a genovou expresí s využitím inhibitoru metylace - 5-azacytidinu (5-AZA) - mnoho genů může být reaktivováno – např. metylačně specifická PCR. Primery rozlišují metylovanou a nemetylovanou DNA v nádorových biopsiích nebo tekutině. Další metodou je v současnosti imunoprecipitace purifikované metylované DNA, umožňující detekovat metylační profil DNA celého genomu – DNA methylom). 34 Typické CpG ostrůvky nádorově supresorového genu v normální a nádorové buňce Normální buňka normální transkripce nemetylovaný promotor Nádorová buňka potlačení transkripce hypermetylace promotoru 35 Procento hypermetylace CpG 11 nádorově supresorových genů u různých typů lidských nádorů (A) a u 10 různých nádorově supresorových genů (B) 36 Vlastnosti nádorů a různé typy genů umlčených aberantní metylací DNA 37 genetické Rovnováha metylace DNA endogenní faktory environmentální a dietní faktory chemoterapeutika stárnutí genetické folát cholin aromatické uhlovodíky cisplatina 5-fluorouracil 5-aza-C methotrexát Hyper Hypo ethanol 38 Metylace reguluje expresi genových produktů Epigenetické faktory Genetické faktory Metylace podporuje vznik mutací deaminací Genové produkty katalyzují a regulují metylaci Nukleotidová sekvence určuje možná místa metylace Interakce genetických a epigenetických faktorů 39 Aberantní epigenetické a genetické děje mohou vést prostřednictvím nesprávné genové exprese k tvorbě nádorů 40 Acetylace histonů Genová exprese je regulována i strukturou chromatinu. Histony jsou považovány za důležité „překladatele“ mezi genotypem a fenotypem – mají dynamickou funkci v regulaci struktury chromatinu a genové aktivity. Mohou být modifikovány acetylací, metylací, fosforylací, ubiquitinací. Specifická modifikace konců histonů je přímo spojena s aktivní nebo utlumenou transkripcí – enzymy histon transferázy. Chromatin obsahující hypoacetylované lysiny v histonech má kompaktní strukturu represivní pro transkripci. Inhibitory histonových deacetyláz (HDAC) mohou vytvářet otevřené struktury chromatinu a aktivovat určité geny inhibující nádorový růst využití v terapii (butyrát, trichostatin). Histony se podílejí na tvorbě a udržování „epigenetické paměti“. Existuje významný „crosstalk“ mezi metylací DNA a acetylací histonů při aktivaci i tlumení (silencing) genové exprese. 5AZA a HDAC inhibitory v kombinaci způsobují reaktivaci nádorově supresorových genů 41 J. Lopez et al. Br J Cancer 100:571, 2009 Normální buňky promotory aktivně transkribující geny nemetylované v eurochromatinu potlačení exprese genů metylace promotorů a tvorba heterochromatinu Nádorové buňky deregulace – aberantní exprese normálně umlčených genů a potlačení exprese nádorově supresorových genů HAT – histon acetyltransferázy SWI/SNF – „switch/sucrose nonfermentable nucleosome remodelling complex“ MeCP2 – „methyl CpG-binding protein 2“ HDAC – histon deacetyláza Některé známé změny DNA a chromatinu v nádorových buňkách 42 Utlumení genové exprese aberantní metylací DNA a modifikací histonů Nukleozómy v promotorové oblasti. Proteiny vážící se k 5MeC (MeCP2) se váží k metylovaným CpG místům a způsobují tlumení genové exprese histon deacetylázou (HDAC). Přítomnost tohoto komplexu, deacetylace lysinu v histonech a metylace histon-3 lysin-9 histon metyltransferázou přeměňuje nukleozóm v kompaktní konfiguraci, která zabraňuje vazbě transkripčních faktorů. Demetylace a deacetylace způsobuje pak zase uvolnění inhibičního proteinového komplexu a tvorbu otevřené struktury nukleozómu, která umožňuje transkripci. 43 mikro RNAs Důležitou součástí epigenetické regulace jsou tzv. malé regulační RNA – mikroRNA (miRNA). Jsou to vysoce konzervované malé molekuly RNA (19-30 nukleotidů) nekódující proteiny, ale regulující genovou expresi na translační úrovni. Tvoří asi 1% lidského genomu!!! Hrají úlohu ve vývoji, buněčné proliferaci i apoptóze. Genovou expresi regulují rovněž siRNA (short interfering RNA). V tzv. RISC komplexu se miRNA vážou na částečně komplementární cílová místa genů a mohou řídit buď translační inhibici nebo degradaci mRNA. Tato represe prostřednictvím miRNA je další cestou jak může byt modulována genová exprese. miRNAs jsou deregulovány u řady nádorových typů a mohou fungovat jako onkogeny nebo nádorové supresory. Hypermetylace CpG islands spojených se specifickými miRNAs může být jedním z mechanismů, kterým může být miRNA selektivně snižována. V případě, že je miRNA situována v kódující oblasti genu, metylace může zároveň tlumit expresi jak genu kódujícího protein tak příslušné miRNA.s 44 Regulace cílových genů microRNA Lynam-Lennon N. et al, Biol Rev 2009, 84:55 45 46 Lynam-Lennon N. et al, Biol Rev 2009, 84:55 Biosyntéza microRNA Imortalizace buněk Imortalizace buněk je nedílnou součástí karcinogeneze a zajišťuje neomezenou proliferaci buněk. Existuje obranný vestavěný buněčný mechanizmus proti neustálé proliferaci, který sčítá a limituje celkový počet dělení buňky. Normální somatická buňka má omezený počet dělení, tj. limitovanou schopnost proliferovat a nastává ireverzibilní zástava růstu, tzv. replikativní stárnutí (senescence) a smrt. Molekulárním nástrojem tohoto sčítaní jsou segmenty DNA na koncích chromosomů tzv. telomery. Ty se při každém dělení zkracují a když dosáhnou kritické délky dochází k stárnutí a krizi. Jestliže tento sčítací systém funguje v nádorové buňce řádně, její nadměrná proliferace je přerušena předtím, než je nádor příliš velký. 48 Aktivací genu, který kóduje enzym telomerázu, který není v normálních buňkách, ale byl nalezen v nádorových buňkách, však dochází k obnově telomerických segmentů a to umožňuje buňce se nekonečně množit, tj. stát se nesmrtelnou. Imortalizace zahrnuje také inaktivaci specifických nádorově supresorových genů jako jsou RB a p53, které se účastní regulace přechodu G1-S fáze buněčného cyklu a indukce apoptózy i dalších genů spojených s buněčným cyklem a apoptózou. 49 Telomery vysoce konzervované nukleoproteinové komplexy přítomné na koncích chromozómů a obsahují tandemové opakující se sekvence DNA bohaté na guanin (TTAGGG) obalené specifickými na DNA se vázajícími proteiny. Telomery tvoří protektivní čepičku kolem genomové DNA a zabraňují chromozomálním ztrátám a aberantním fúzím během mitotického cyklu. Telomery se zkracují s dalšími buněčnými děleními, což může způsobit genovou nestabilitu a změněnou genovou expresi. Buňky procházejí krizovým stadiem (Hayflickův limit) nebo umírají. Zkracování telomer vybudí proliferativní stárnutí přes aktivaci kontrolních bodů pRB a p53, což vede u divokých typů p53 k zástavě proliferace. Dochází k bariéře v proliferaci charakterizované dysfunkcí telomer, extrémní genomovou nestabilitou a rozsáhlou smrtí buněk mechanismy závislými i nezávislými na p53. Délka telomer koreluje s buněčným stárnutím, ale neexistují žádné důkazy pro jasnou korelaci na organizmální úrovni a korelace s délkou života člověka či jiných druhů. 50 Heterogenita průměrné délky telomer odráží genetické rozdíly a komplexní rovnováhu mezi procesy, které vedou k degradaci a těmi, které prodlužují telomery. Např. buňky se sebeobnovnou kapacitou mají delší telomery než diferencované nebo telomery lab. myší jsou delší než u člověka. Telomery jsou kratší u lidských somatických tkání ze starších lidí než u mladších jedinců nebo u zárodečných buněk. Děti s genetickými nemocemi projevujícími se rychlým stárnutím tzv. progerickým syndromem (Down, Werner, At. telangiectasia) umírají v raném věku s tělem 90ti letých a jejich telomery jsou drasticky zkráceny. 51 Imortalizace buněk Imortalizované buňky vznikající z krizového stadia (inaktivací p53 a pRB, overexpresí cMyc a Ras a v důsledku vážné genové nestability) obnovují funkci telomer aktivací telomerázy, alternativním telomery udržujícím mechanizmem (ALT) nebo jiným adaptivním mechanizmem. Ve skutečnosti mají nádorové buňky kratší telomery než jejich odpovídající normální buněčné typy. Tyto telomery se dále zkracují během progrese nádoru a u myších exp. modelů, jsou zkrácené telomery spojeny se zvýšenou genetickou nestabilitou a zvýšenou nebo redukovanou spontánní malignitou v závislosti na genetickém kontextu. Mnoho faktorů (genetických, nutričních, hormonálních, environmentálních, farmakologických) může modulovat udržování telomer a potenciál buněčného života. 52 TELOMERÁZA Telomery nejsou udržovány normálním replikačním procesem. U kmenových, nádorových a imortalizovaných buněk, je zkracování telomer zastaveno aktivací TELOMERÁZY - reverzní transkriptázy, která rozšiřuje telomerické TTAGGG opakované sekvence. 3 hlavní složky: • s telomerázou spojený protein TLP1 • telomerázovou RNA -hTR • telomerázovou katalytickou jednotku TP2 - lidská telomerázová reverzní transkriptáza. Telomeráza používá svou RNA k navázání na telomery, zatímco katalytická proteinová jednotka syntetizuje DNA přímo na koncích chromozómů reverzní transkripcí templátu RNA. 53 Rozšiřování na guanin (G) bohatých telomerových vláken telomerázou Holoenzym telomeráza obsahuje proteinové subjednotky včetně katalytické subjednotky s aktivitou reverzní transkriptázy a molekulu RNA, která slouží jako templát pro přidání opakujících se motivů TTAGGG 54 Stadium terminální proliferační zástavy (TPA) Normální buňky absolvují určitý počet dělení než navždy opustí buněčný cyklus a zůstanou ve viabilním neproliferujícím stavu – senescence. Při inaktivaci p53 se tyto buňky ještě nějakou dobu dělí a pak zastavují buněčný cyklus (p53-minus TPA). Při narušení jak p53 tak pRb/p16 (např. přítomností virových onkoproteinů), buňka obejde stav senescence a následně je zastavena ve stavu krize. Vyjímečně (1 buňka z 107 ) může překonat krizi a stát se nesmrtelnou. Transdukce několika normálních buněk s expresním konstruktem hTERT může vyústit v expresi telomerázy a obejít stav senescence. 55 ZMĚNY TELOMERÁZOVÉ EXPRESE A AKTIVACE Telomeráza je vysoce exprimována ve většině nádorů a kmenových buněk, středně v hyperplastických buňkách a velmi nízká nebo žádná v normálních diferencovaných tkáních a postupně se snižuje s věkem. Její exprese je spojena s vysokým proliferačním indexem a obnovným tkáňovým potenciálem, agresivitou nádorů, vysokým histopatologickým gradem a s proliferací cévního endotelu. Telomerázová aktivace a overexprese je často nezbytným a raným dějem v mnohastupňové karcinogenezi: vzrůstá rychle při chemické karcinogenezi a po zkrácení telomer. Telomeráza není ani onkogen ani nádorově supresorový gen, ale je regulována nahoru nebo dolů mnoha faktory a stává se důležitým predisponujícím dějem u karcinogeneze nebo cílené nádorové terapie. 56 Homeostáza systému telomery – telomeráza je komplexní a je svázána s genetickými a environmentálními faktory. Řada faktorů telomerázovou aktivitu • snižuje (diferenciační činidla, epigallocatechin gallate (z čaje), antineoplastické látky - cisplatina, doxorubicin, protein fosfatáza 2, MAPK, tamoxifen, androgeny, volné radikály, inhibitory reverz. transkriptázy) • nebo zvyšuje (chemické karcinogeny, mutace telomerických sekvencí, gamma záření, PKC, EGF, estrogeny). Vztahy mezi telomerázovou aktivitou a nádorovým onemocněním jsou složité a jen částečně objasněné. Telomeráza může paradoxně buď podporovat nebo inhibovat tvorbu nádorů v závislosti na genetickém kontextu. U nádorových buněk jsou telomery kratší a telomerázová aktivita obvykle následuje po zkracování telomer. Ztráta funkce telomer při raném dělení zahajuje genetickou nestabilitu, zatímco v pozdějším bodě progrese nádoru absence telomerázy inhibuje růst. Tak zatímco inhibice telomerázy u ustanovených nádorů může být cenným terapeutickým přístupem, na věku závislé zkracování telomer může být rizikovým faktorem pro nádory tím, že umožňuje obejít kontrolní bod mortality. Systém telomery-telomeráza představuje komplexní skupinu molekul interagujícíh navzájem a modulujících věk buněk, genetickou stabilitu a nádorovou transformaci. Vnější zásahy mohou modulovat žití zvyšováním nebo snižováním délky života, ale s tímto přístupem jsou spojeny také odpovídající problémy. 58 Udržování telomer by mohlo být důležité pro prodloužení života, ale vzhledem ke složitosti fyziologických mechanismů na buněčné a zejména organizmální úrovni, nelze tento problém zjednodušovat. Z onkologického hlediska, může nadměrná rexprese telomerázy zvyšovat riziko vzniku nádorů. Ačkoliv normální buňky s delší dobou života a udržovanými telomerami se nejeví jako neoplastické, zpoždění fyziologické smrti může zvyšovat pravděpodobnost kontaktu s karcinogeny. Telomeráza sama také zvyšuje onkogenní potenciál predisponovaných buněk a je cílem protinádorových terapií. Zatím se pozornost soustřeďuje na zvýšení doby života několika cílových buněk nebo snížení proliferujících nádorových buněk. Málo pozornosti je věnováno organizmální úrovni, mikro- a makroprostředí, ve kterém tyto buňky rostou jako normální nebo imortalizované nádorové buňky: tj. angiogenezi, růstovým a diferenciačním faktorům, cytokinům, hormonům, imunitnímu systému a environmentálním faktorům. Zbývá odpovědět na otázky: ? - Je bezpečné prodlužovat lidský život použitím terapeutických látek? ? - Je lepší prodlužovat lidský život nebo zlepšovat kvalitu života? 59 Zkracování telomer může vést k chromozomální nestabilitě a vzniku nádoru 60 Imortalizace je nutná,ale ne dostačující pro maligní transformaci A) U řady modelů in vitro se ukázalo, že onkogeny (např. aktivovaný ras) mohou způsobit maligní transformaci imortalizovaných, ale ne normálních buněk. Aktivovaný ras způsobuje maligní transformaci SV40-imortalizovaných fibroblastsů, ne však normálních fibroblastů nebo SV40-transdukovaných fibroblastů, které nebyly imortalizovány. (B) Myší fibroblasty transdukované aktivovaným proteinem ras získávají konstitutivně aktivní signální dráhu MEK. U imortalizovaných buněk to může vyústit v maligní transformaci, kdežto u normálních buněk dochází k upregulaci p53 a p16INK4a a předčasnému stárnutí (premature senescence). 61 Adenovirová terapie využívající promotoru pro telomerázu selektivně usmrcuje nádorové buňky 62 Shay JW and Wright WE, Cancer Cell 2, 2002:257-65 Inhibitory telomerázy a konvenční terapie 63 Shay JW and Wright WE, Cancer Cell 2, 2002:257-65 Výukovou pomůcku zpracovalo Servisní středisko pro e-learning na MU http://is.muni.cz/stech/