Diagnostika a léčba nádorových
onemocnění
Diagnostika,
Léčebné metody
Chemoprevence
Nutriční onkologie
Mechanizmy působení protinádorových léčiv
Léková rezistence
Prediktivní markery, bioinformatika
Dědičnost nádorových onemocnění
Genetika, mutace specifických genů způsobují zvýšenou náchylnost
(susceptibility) k určitým typům nádorů
2
Incidence a úmrtnost na nádorová onemocnění (USA)
3
Scharlau D et al., Mutat Res 2009, 682:39
Prevence a terapie
Chemoprevence a chemoterapie
5
OBR. 4
Greenwald P., Scientific American 1996: 96-99
Přírodní nebo syntetické látky, zasahující v ranných fázích karcinogeneze.
Aktivují detoxifikační enzymy, antioxidační účinky - laboratorní a
epidemiologické studie
• -tokoferol, -karoten , vitamin A a retinoidy - zelenina, ovoce
• Dithiolthiony, sulforaphan - brokolice, květák, kapusta
• Genistein - sója
• Epigallocatechine gallate - zelený čaj
• Curcumin - curry
• Tamoxifen - antiestrogen - prevence u žen se zvýšeným rizikem vzniku
nádoru prsu
• Nesteroidní antiflogistika (NSAID) - aspirin, piroxicam, sulindac prevence
kolorektálních nádorů
• Finasteride (blokuje přeměnu testosteronu na androgen) - prevence
nádorů prostaty
• DFMO - difluorometylornitin (blokuje aktivitu ornitin dekarboxylázy) prevence
různých typů nádorů
6
Chemoprevence
Příklady syntetických chemopreventivních látek
- Selektivní inhibitory
COX-2
- Ligandy receptoru
pro retinoidy
- sLigandy pro PPARγ
7
Oleanolic and ursolic acids, which have been used as chemopreventive agents, are
both derived from squalene. Note that the two structures differ only in the location of
the two methyl groups in the E-ring.
Nové látky vznikající na základě
strukturálních studií
8
• Laboratorní vyšetření ( sedimentace erytrocytů, hematologické
vyšetření, biochemická vyšetření)
• Cytologické a bioptické vyšetření (pre- nebo postoperační)
• Nádorové markery – laboratorně prokazatelné známky projevu
specifických nádorových onemocnění (antigeny, emzymy, hormony a
jejich receptory)
Mohou odrážet proliferační aktivitu, mohou být sdružené s diferenciací
nebo vznikají při destrukci buněk.
Patří sem i pro nádor charakteristické chromozomální abnormality.
• Biochemické metody detekce: radioimunologická (RIA), enzym vázající
imunosorpční (ELISA) (většinou komerční kity a automatické
analyzátory)
9
Diagnostika
• Vyšetření stavu buněčné kinetiky
Morfologie, sledování počtu mitóz – mitotický index
Metody autoradiografické (inkorporace 3H-tymidinu)
Metody cytochemické (speciální barvení, speifické protilátky proti
antigenům spojeným s proliferací (Ki-67, PCNA), stanovení AgNOR
Průtoková cytometrie
Buněčný cyklus, ploidita, specifické markery, imunotypizace (CD
antigeny)
• Molekulárně biologické metody (Southern, Nothern a Western blotting
pro analýzu DNA, RNA a proteinů), polymerázová řetězová reakce –
amplifikace malých fragmentů DNA, vytváření cDNA knihoven z malého
množsví mRNA (PCR, RT-PCR, real-time PCR)
Hybridizace in situ, microarrays
10
název CA je odvozen z komerčních setů pro jeho určování (carbohydrate
antigen)
hlavně z nádorů žlázového epitelu a epitelu mléčné žlázy.
CA 15-3: zvýšen u karcinomu prsu – senzitivita 75 %, specifita 90 %,
některé nádory GIT. Falešná pozitivita možná u hepatopatií,
cholangoitidy, plicních nemocí, renálních poruch, gravidity.
CA 19-9: zvýšen u karcinomu pankreatu, žaludku, prsu, kolorekta.
Falešná pozitivita – obstrukční ikterus
CA 72-4: zvýšen u karcinomu žaludku, jícnu, plic a ovárií.
Antigen mucinózních karcinomů (MCA): marker karcinomu prsu, jeho
vzestup je dříve než CA 15-3. Užívá se jako potvrzení při zvýšeném CA 15-
3.
AFP: α-fetoprotein - zvýšen u nonseminomů, u ostatních germinálních
nádorů (testikulární nádory, teratom) a u hepatocelulárního karcinomu
(hCC), kde je až 95% senzitivita. Zvažuje se screeningové vyšetřování u
rizikových skupin (cirhotici, hepatitida B aj.).
CEA: karcinoembryonální antigen – zvýšen u nejčastějších typů nádorů
PSA: prostatický specifický antigen – zvýšen u nádorů prostaty
NSE: neuron specifická enoláza – zvýšena u neuroblastoů, retinoblastomu,
maligního melanomu, malobuněčného karcinomu plic
Příklady nádorových markerů
Buněčné nádorové markery
• HER2/neu stanovení u karcinomu prsu. Zvýšená exprese značí zvýšenou
proliferační aktivitu – horší prognóza.
• Je cílem monoklonální protilátky trastuzumab (Herceptin), který se aplikuje na
základě zjištěné HER2/neu pozitivity nádoru.
Genetické nádorové markery
• p53 "strážce genomu" nádorově supresorový gen regulující buněčný cyklus.
• Účastní se zástavy –buněčného cyklu, reparace DNA a indukce apoptózy.
• Mutace se vyskytuje u více než 50% nádorů.
• Li Fraumeni syndrom – zděděná mutace, zvýšený výskyt ca prsu, sarkomů
apod.
• BRCA 1,2 (nádorově supresový gen) karcinom prsu a ovárií
Biochemická klasifikace nádorových markerů (TM)
• Humorální TM (detekovatelné v tělních tekutinách)
• onkofetální antigeny (CEA, AFP, CA 15–3 atd.)
• enzymy (PSA, NSE, TK, LD atd.)
• hormony (hCG, PRL, PTH, ADH atd.)
• plazmatické proteiny (ferritin, β2M, paraproteiny
aj.)
• ostatní (HIAA, VMK atd.)
• Buněčné TM (ER,PR, HER2/neu atd.)
• Genetické TM (ATM, BRCA1/2, p53, Rb1 atd.)
Karcinoembryonální antigen CEA
• rodina 36 glykoproteinů na povrchu membrán buněk řady
orgánů ektodermálního původu, zejména GIT
• běžně vytvářen v epiteliálních buňkách během fetálního
vývoje, ovlivňuje buněčnou adhezi, funkce není plně známa
• má nepřímý imunosupresní vliv na T lymfocyty
• poločas 7–14dní
• norma do 3 mg/l u kuřáků do 5 mg/l
• může být zvýšen u cirhóz a u zánětů GIT
• produkce u kolorektálního, prsního, plicního a ovariálního
karcinomu a metastatického postižení jater
• pokles CEA po 4. týdnu po zákroku svědčí o úspěchu
PSA prostatický specifický antigen
• biochemicky se jedná o serinovou proteázu
• produkován normálními i nádorovými buňkami prostaty
• naprostá většina secernována do tekutiny produkované
semennými váčky, kde přispívá ke zkapalnění ejakulátu
• zvýšen u karcinomu prostaty, ale i při/po jiných
fyziologických/patofyziologických jednotkách (nejčastěji
ejakulace, p.r. vyšetření před odběrem)
• referenční hodnoty stoupají s věkem (<2,5 μg/l< 50let; <5
μg/l 50-60let; 8,5< μg/l>60let)
• hodnoty nad 10 μg/l – 50% riziko karcinomu
• v plazmě přítomný jak volný PSA(fPSA) tak vázaný PSA, jejich
součet se nazývá total PSA (tPSA) – poměr fPSA/tPSA
usnadňuje diagnostiku → nad 25 % – pravděpodobně benigní
léze; pod 10 % spíše maligní etiologie; 10-25 % zóna překryvu
• asi 20 % ca prostaty má PSA v normě!!!
• Ultrasonografie – vyšetření ultrazvukem, neinvazivní
• Rentgenové vyšetření – kontrastní vyšetření, mamografie –
screening a diagnostika rakoviny prsu
• Počítačová tomografie (CT) - odhalí až 90% ložisek menších
než 1 cm
• Magnetická rezonance (MR) – zejména vyšetření mozku
a míchy
• Radionuklidové vyšetřovací metody – využití izotopů
(scintigrafie, emisní tomografie
• Endoskopické vyšetření – nádory v tělních dutinách
16
Zobrazovací metody
Určení rozsahu onemocnění důležité pro volbu léčebné strategie a pro
odhad prognózy onemocnění.
Jednotný klasifikační systém TNM
• T (tumor) 1-4 – rozsah primárního nádoru
• N (noduli) 1-3, 0, X – stav regionálních mízních uzlin
• M (metastases) 0, 1 – informace o metastázách
Histopatologický grading G1 – 4, X – stupeň diferenciace
Další nezávazné deskriptory
Stadium choroby (staging) I. – IV.
Hodnocení tělesné zdatnosti (funkční staging)
U některých nádorů formulován soubor prognostických znaků, tzv.
mezinárodní prognostický index (IPI)
Vznik a vývoj nádorů je složitý děj, který závisí na překonání řady
restrikčních mechanismů na úrovni genomu, buňky, tkáně i celého
organismu a který pro svou komplexnost vyžaduje při plánování terapie
individuální přístup (tailoring therapy) - využití poznaných biologických
charakteristik
17
Klasifikace nádorových onemocnění
• Klinické – staging (jeden z nejsilnějších prognostických faktorů),
sledování přežití a léčebné odpovědi
• Orgánové – sledování odpovědi nádoru na léčbu
• Tkáňové – histologická charakteristika, grading, tkáňová architektonika,
vaskularizace, expresní profily-imunohistochemie, in situ hybridizace
• Buněčná – funkční testy, obsah DNA, proliferační a apoptická aktivita
• Molekulární – cytogenetické a genetické charakteristiky nádorových a
somatických buněk
Incidence nádorových onemocnění se stále zvyšuje. Přesto je dlouhodobá
mortalita téměř konstantní díky výrazným léčebným a diagnostickým
pokrokům.
Nové léčebné postupy, nová chemoterapeutika, kombinovaná terapie a
aplikace nových poznatků o biologii nádorové buňky.
Hledají se nové prognostické/prediktivní faktory umožňující přesnější
rozdělení nemocných do rizikových skupin.
18
• Chirurgie
• Ozařování
• Chemoterapie
• Biologická terapie
Chemoterapeutické látky
• platinové deriváty
• antimetabolity (metotrexat, fluorouracil)
• inhibitory topoizomeráz (doxorubicin, etoposid)
• alkylační činidla (cyklofosfamid)
• rostlinné alkaloidy (vinblastin, paclitaxel)
Biologická terapie - hledání nových přístupů na základě poznání
mechanismů
• Stimulace obranných mechanismů hostitele včetně specifických a
nespecifických imunologických přístupů (imunoterapie)
19
Léčebné metody
• Strategie cílené přímo na změnu nádorového růstu a diferenciace využití
růstových faktorů, genetické inženýrství - ovlivnění klíčových
genů.
• Angiogenní terapie – cílená proti vaskularizaci nádorů
Podpůrná (symptomatická) léčba
Nemá za cíl smrt nádorových buněk, ale usiluje o co nejlepší kvalitu života
nemocných (zmírnění obtíží vyvolaných nádorem a léčbou)
Paliativní léčba – komplexní podpůrná léčba u pacientů s pokročilým
nevyléčitelným onemocněním
Kurativní léčba – cílem je vyléčení nemocného
Nekurativní léčba – cílem je zabíjet nádorové buňky, ale nemá ambice vyhubit
všechny (pokročilé onemocnění, rezistence na léčbu atd.)
Adjuvantní léčebné postupy – chemo- nebo radio-terapie – u těch nádorů, kde
je předpokládána přítomnost mikrometastáz, nutná chemosenzitivita nádoru
Neoadjuvantní postupy – předoperační léčba s cílem zmenšit primární nádor
před chirurgickým výkonem
20
Cílem je přímo a cíleně zasáhnout do klíčových mechanismů
karcinogeneze na buněčné úrovni (targeted therapy).
Často v kombinaci s konvenčními léčebnými postupy.
• Anti-EFGR terapie – monoklonální protilátky s vazbou na receptor
epidermálního růstového faktoru (EGF), inhibitory tyrozinových kináz,
„antisense“ nukleotidy, vakcína proti receptoru nebo ligandu
• Diferenciační terapie (kyselina all-trans retinová, vitamin D3)
• Inhibitory přenosu signálů
 Inhibitory tyrozinových kináz
 Inhibitory cyklin-dependentních kináz – ovlivnění buněčného cyklu
 Inhibitory jiných kináz – např. MAP kinázy, JNK
 Inhibitory farnesyltransferázy – inhibují onkoprotein ras – spojen
s vnitřní stranou plazmatické membrány izoprenoidní lipidovou
skupinou – farnesylem
Mutace protoonkogenu ras - častá u nádorů - vede k nekontrolované
proliferaci, inhibici apoptózy a zvýšení angiogeneze
21
Nové směry vývoje protinádorové léčby
• Genová terapie
Postup mající za cíl napravit genetickou odchylku
způsobující vývoj nádorové buňky (p53, geny
rezistence, sebevražedné geny, cytokiny)
• „Antisense“ oligonukleotidy
• Angiogeneze a antiangiogenní terapie
 inhibitory proteáz
 inhibitory migrace a proliferace endotelu
 inhibitory angiogenních růstových faktorů
22
intervence do imunitních mechanizmů s cílem obnovit nebo
modifikovat funkce imunitního systému (substituční, supresivní
nebo stimulační, aktivní vs. pasivní, specifická a nespecifická)
Buněčná imunoterapie – podání buněk imunitního systému
s protinádorovou aktivitou – cílené zasažení nádorové tkáně a
překonání tolerance a imunosuprese vyvolané nádorem.
Nádorové antigeny – vznik nových antigenů, kterými se nádorové
buňky liší od normálních – terč pro imunitní reakci
Nespecifická buněčná imunoterapie – posílení protinádorové
imunity nezávisle na specifických nádorových antigenech
23
Imunoterapie
Princip: kultivace efektorových buněk ex vivo
s látkami, které aktivují nebo posilují jejich protinádorový účinek
(LAK buňky, NK-buňky, aktivované monocyty-makrofágy
Zkoušeno přes 30 let – malé uplatnění v praxi
Specifická buněčná imunoterapie – adoptivní imunoterapie
využívající specifický převod buněk (TIL)
Protinádorové vakcíny – navozují specifickou imunitní odpověď
proti nádorovým buňkám v prim. nádoru i metastázách
Dendritické buňky
24
J.Krejsek, O. Kopecký: Klinická imunologie, 2004
25
klinicky orientovaný onkologický výzkum využívající metod buněčné a
molekulární biologie.
Hledání nových léčebných postupů a léčiv směrovaných na klíčové genetické
změny umožňující transformaci normální somatické buňky v nádorovou.
Jsou to především
• poruchy buněčného cyklu,
• poruchy v aktivitě/množství receptorů pro růstové faktory,
• exprese protiapoptických faktorů a
• nesmrtelnost nádorových buněk vázaná či nevázaná na expresi
telomerázy.
Chromozomální a genetická analýza nádorových buněk je důležitým
faktorem pro prognózu a individualizaci léčby. Problémem jsou zvláště
solidní nádory, kde jsou cytogenetické znalosti minimální např. ve srovnání
s hematologickými malignitami.
V praxi se jedná o stanovení ploidity DNA, chemosensitivity in vitro,
cytogenetické a genetické vyšetření atd.
26
Prediktivní onkologie
studium procesů související se vznikem a rozvojem chorob, a to
na úrovni nukleových kyselin a proteinů, respektive jiných
molekul, které jsou jimi regulovány.
Využívá technik molekulární biologie a výsledky jsou dávány
do kontextu s nálezy dalších biomedicínských oborů.
Umožňuje odhalovat počátky nemoci a nahlédnout až na genovou
úroveň.
Zpětně přispívá k vývoji nových léčebných přístupů.
27
Molekulární patologie
Transplantace
Autotransplantace
Před plánovanou radio- či
chemoterapií nádorů
(nehemopoetických).
Odběr zdravé kostní dřeně
nebo krve – izolace
kmenových buněk či
progenitorů (někdy
s podporou příslušných růst.
faktorů). Po léčbě zpětná
transplantace pro obnovu
krvetvorby.
Transplantace od vhodného
dárce – u hemopoetických
malignit.
28
Využití transplantace tkáňově specifických
kmenových buněk
Možnost kultivace in vitro. Hemopoetické kmen. buňky z kostní dřeně (rekonstituce poškozené
krvetvorby), epiteliální kmen. buňky (popáleniny, poškození kůže), dopaminergní neurony
odvozené z embryonálních kmen. buněk (Parkinsonova choroba).
29
Tvorba emryonálních kmenových
buněk přenosem jádra somatické
buňky do enukleovaného oocytu
Buňky získané z takto vytvořené
blastocysty lze využít
k transplantaci, příp. s využitím
předchozí genové terapie
k nápravě genetických poškození.
30
Mechanismy působení
protinádorových léčiv
31
Chemoterapeutické látky
Chemoterapeutika zabraňují množení buněk nebo indukují apoptózu různými
mechanismy.
Antimetabolity, inhibitory topoizomeráz a alkylační činidla blokují syntézu DNA
Rostlinné alkaloidy blokují mitotické dělení
32
Hellman S and Vokes E.E., Scientific American 1996:118-123
Schéma drah cytotoxického působení cisplatiny a
faktory uplatňující se v rezistenci (červeně)
Kohno K. et al, European Journal of Cancer 2005:2577
Molekulární interakce spojené s DNA
a genovou expresí
Cisplatina aktivuje transkripční faktory, faktory reparace DNA, faktory rozeznávající poškození,
nádorové supresory a faktory remodelující chromatin, které interagují a tvoří komplexy, které fungují
v jádře. Léky mohou měnit interakční profily.
Kohno K. et al, European Journal of Cancer 2005:2577
Chemoterapeutika vyvolávající oxidativní stres
35
Chemoterapeutika aktivují apoptózu přes mitochondriální dráhu nebo
přes aktivaci receptorů smrti („death receptors)
Dvě dráhy aktivace apoptózy chemoterapeutiky
36
Signální dráhy apoptózy indukované chemoterapeutiky
37Debatin KM and Krammer PH, Oncogene 23, 2004:2950-2966
38
Expozice buněk velmi nízkými dávkami chemoterapeutik má minimální
efekt na viabilitu nebo bun. cyklus díky dostatečným schopnostem
reparačního systému opravit poškození.
Ve vyšších koncentracích v závislosti na přítomnosti nebo nepřítomnosti
kontrolního bodu v G1 (souvisejícího s expresí p53) se vyskytují 2 typy
odpovědi:
• v případě funkčního kontr. bodu je bun. cyklus zastaven v G1 dokud
nedojde k opravě poškození nebo dochází ke spuštění apoptózy při
velkém rozsahu poškození (po vysokých konc.) nebo neúspěšné
reparaci.
• jestliže je kontr. bod nefunkční (např. při mutaci p53) buňky vstupují do
S fáze, ale postup (DNA replikace) je suprimována podle konc. látky.
- v případě buněk „primed“ k apoptóze, dojde k apoptóze rychle (3-6 h,
„immediate apoptosis“) u prahových hodnot konc., slabě nad těmi, které
kompletně inhibují progresi S fáze.
39
Dávková závislost
- v případě non-primed buněk prodloužená suprese průchodu bun.
cyklem (defective progression) vede k růstové nerovnováze,
sekundárním změnám, následnému nastartování a pozdní apoptóze.
Tato apoptóza vykazuje často atypické vlastnosti, komlikované růstovou
nerovnováhou a sekundárními změnami metabolismu.
- při ještě vyšších konc. překračujících farmakologickou dávku dochází
k nekróze.
Nádorové tkáně mají, analogicky jako normální tkáně, proliferující část
populace a část populace neproliferující, která se skládá z klidových
buněk v G0 fázi nazývané někdy také populace kmenových
neoplastických buněk.
Tyto buňky je obtížné zničit, protože jsou rezistentní k cytostatickému
působení záření nebo chemoterapeutik.
Určitou dobu po ozáření nebo chemickém působení vstupují znovu do
cyklu a jsou zdrojem obnovy nádorového růstu.
40
(s využitím humorálních faktorů, imunologickou indukcí, atd.)
představují hlavní přístupy jak dostat do cyklu i klidové buňky, a pak
účinně inhibovat jejich růst.
Klíčovou otázkou však zůstává volba nejvhodnějšího časového intervalu
mezi jednotlivými aplikacemi (matematické modely).
Klidové buňky přežívají mnohem lépe, protože během dlouhého
časového intervalu mezi cytostatickým působením, replikací DNA a
dělením chromosomů je poškozený genetický materiál reparován.
Rychle rostoucí nádory jsou citlivé na cytostatickou terapii, frakce
neproliferujících buněk je malá, buňky mají krátkou generační dobu.
41
Opakovaná cytostatická terapie a
kombinovaná terapie
Opakovaným působením lze převést G0 buňky do cyklu a účinně
inhibovat růst (lymfomy, seminomy, některé leukémie).
Pomalu rostoucí nádory mají přechod buněk z G0 zásobní populace
řízen negativní zpětnou vazbou.
Tento mechanismus udržuje vždy minimální hladinu G0 buněk,
ze kterých se populace vždy obnovuje.
Tyto nádory jsou rezistentní na cytostatickou terapii a je velká
pravděpodobnost vzniku rezistentních klonů.
Buňky mají dlouhou generační dobu (karcinom tlustého střeva,
žaludku, plic, sarkomy).
42
Wicha MS et al., Cancer Res. 2006:1883-1890
Klinická implikace modelu nádorových kmenových buněk (CSC)
CSC jsou důležité pro snížení rizika nádoru, brzkou detekci, prevenci i terapii. Redukce
normálních kmenových buněk (SC) – snížení rizika nádoru. Detekce faktorů sekretovaných
iniciovanými SC – brzká detekce. Indukce apoptózy či diferenciace SC – prevence. Selektivní
eliminace CSC – úspěšnější terapie.
43
Obecné schéma účinků vzrůstající koncentrace protinádorových látek poškozujících DNA na
buněčný cyklus a apoptózu.
Velmi nízké koncentrace – žádné či minimální účinky díky dostatečné kapacitě reparačního
systému
Vyšší koncentrace:
- funkční kontr. bod v G1- zástava a reparace poškození nebo apoptóza (při vysoké konc. léčiva
nebo při neúspěšné reparaci).
- nefunkční kontr. bod (mutace p53) – vstup do S-fáze – průchod brzděn podle konc. léčiva
„primed cells“- apoptóza během 3-6 h (immediate apoptosis) při hraniční koncentraci. Spojeno s
dalšími faktory, např. konstitutivní expresí c-myc.
Prolongovaná suprese průchodu bun. cyklem („nonprimed cells“) vede k růstové nerovnováze,
sekundárním změnám a zpožděné apoptóze (delayed apoptosis). Ta má často řadu atypických
znaků.
Po příliš vysokých dávkách dochází k nekróze.
Průchod buněčným cyklem
Normální (delayed apoptosis)Defektní
Žádný účinek
(reparace)
Nekróza
(„Primed“
cells)
Cytostat. účinky Immediate
Apoptosis
Koncentrace léčiva0
44
Typy buněčné smrti po působení protinádorových terapeutik
jsou závislé na dávce
45
Blagosklonny M.V., Oncogene 23, 2004:2967-2975
Vhodná strategie pro úspěšnou nádorovou terapii
Optimální terapie – zvýšená apoptóza nádorových buněk a snížení
toxicity pro normální buňky
46
Léková rezistence
47
Xenobiotikum (z řeckého xenos - cizí, bios - život), cizorodá umělá
sloučenina. Látka, která není vytvářena přírodními procesy.
Xenobiotika jsou tělu cizí (léčiva, jedy, průmyslové a jiné chemikálie) a
jsou vylučovány z těla ven.
Rezistence může být důsledkem:
• snížené vnitrobuněčné koncentrace látky díky změněnému příjmu do
nitra buňky, zvýšenému vylučování z buňky nebo rozložení v buňce
• zvýšené buněčné detoxifikace (inaktivace)
• kvalitativních nebo kvantitativních změn buněčného cíle (enzymu)
• neschopnosti přeměňovat látku na aktivní formu
• zvýšené inaktivace látky
• zvýšené reparace DNA
• poruch v drahách apoptózy
Mnoho těchto mechanismů může působit současně a jsou buď přirozeně
přítomny v buňce nebo vznikají de novo během choroby a léčení.
48
Mechanismy rezistence ke xenobiotikům
Vylučování látky z buňky je spojeno s aktivitou specifických proteinů nebo
proteinových komplexů uvnitř cytoplasmatické membrány.
MDR - "multidrug resistance" k nádorové chemoterapii
spojené se zvýšenou expresí Pgp (P170) glykoproteinu - membránová
adenosin trifosfatáza (ATPáza) se širokou specifitou.
Transportuje endogenní substance (toxiny, metabolity, odpad, hormony
atd.).
Farmakologická funkce spočívá v protekci proti cytotoxickým látkám.
Mechanismus MDR je posledních 10 let intenzívně studován. Byl izolován
lidský gen MDR1 na chromosomu 7. Tento gen kóduje Pgp a jeho exprese
je spojena s MDR fenotypem.
49
Léčivo
Aktivované léčivo
Inaktivované léčivo
Detoxifikace léčiva
Buněčné mechanizmy lékové rezistence
Cíl
Snížený příjem
léčiva
Obvyklá dráha inhibice cíle Různé typy rezistence
Aktivace léčiva Inaktivace léčiva
Absence
aktivace léčiva
Změna cíle
Amplifikace cíle
Detoxifikace
Seqestrace
Reparace
Inhibice cíle
Modifikace cíle
Zvýšené vylučování
léčiva
50
(podle Saves I. and Masson J.M.
Cell Mol Life Sci 54, 1998:405-426)
Základní roli v rezistenci nádorových buněk k různým cytotoxickým
látkám hraje glutation (GSH) - vnitrobuněčný tripeptid obsahující cystein
a přítomný v savčích buňkách ve vysokých koncentracích.
Zvýšená konjugace s GSH je hlavním mechanismem vývoje rezistence.
Glutation-S-tranferázy (GST) - čtyři známé izoenzymy - jsou hlavní
skupinou detoxifikačních enzymů. Protože katalyzují konjugaci s GSH, je
hladina jejich exprese hlavním faktorem určujícím senzitivitu buněk.
GSH i GST mohou způsobovat rezistenci i jinými mechanismy než
konjugací, např. GSH může modulovat reparační funkce DNA a tak
kontrolovat rezistenci např. k cisplatině.
Využití inhibitorů GSH - indometacin, piriprost
Rezistence k chemoterapii zprostředkovaná změnami
buněčného cíle
Změny topoizomerázy - topoiz. II je zásadní pro replikaci DNA - cíl
interkalačních látek jako je adriamycin, actinomycin D nebo
neinterkalačních látek jako jsou etoposide nebo teniposide.
51
Buněčná detoxifikace
Rezistence může být způsobena změnou hladiny topoiz. II nebo expresí
mutovaného enzymu.
Změny DHFR (dihydrofolátreduktázy) - cíl antifolátových látek - metotrexát.
Zvýšená hladina DHFR je příčinou rezistence.
Změny tymidilát syntázy - cíl 5-fluorouracilu. Dva mechanismy rezistence změny
afinity TS k lékům díky substituci jedné aminokyseliny nebo zvýšená
TS aktivita.
Zvýšené reparační funkce DNA
DNA je cílem různých cytotoxických látek. Přímou nebo nepřímou vazbou k
DNA způsobují tyto látky změny v DNA a genomové poruchy vedoucí k
buněčné smrti.
Jednoduchá alkylační činidla se kovalentně váží k DNA - vnitro- i
meziřetězcové vazby.
Deriváty kovů jako je cisplatina tvoří také podobné vazby. Cisplatina obecně
porušuje DNA indukcí vnitrořetězcových vazeb mezi N7 atomy dvou
sousedních guaninů a v menší míře indukcí meziřetězcových vazen a
monoaduktů.
Další cytotoxické látky jsou schopny nekovalentně se vmezeřovat do DNA.
Ačkoliv všechny tyto interakce s DNA jsou potenciálně letální, rozsah
buněčné smrti je ovlivňován rozdíly v rozsahu reparace.
52
Existuje inverzní vztah mezi buněčnou reparací a cytotoxickou
senzitivitou.
Reparační procesy DNA jsou velmi komplexní a závisí na typu
poškození. Jejich regulace se účastní na 200 různých genů. Mají velký
význam pro nádorovou chemoterapii, protože jsou zahrnuty v
rezistenci k velkému počtu cytotoxických látek, zejména těch, které
nejsou ovlivněny MDR fenotypem.
Tři hlavní typy reparace DNA:
Reverze poškození - nejjednodušší biochemický pochod obnovující
integritu DNA. O6 - alkylguanin DNA alkyltransferáza přispívá hlavním
dílem k rezistenci k alkylačním činidlům - inhibice enzymu významně
zesiluje cytotoxické účinky látek.
Bohužel, tento zásah může na druhé straně indukovat nádory, protože
tento enzym zabraňuje karcinogenním účinkům řady molekul.
Excise pošlození specifickými glykosylázami po specifickém poškození
bazí s následným vyříznutím DNA a doplněním pomocí polymeráz a
ligáz. Exprese těchto enzymů je u rezistentních buněk pozitivně
regulována.
53
Postreplikační reparace umožňuje nápravu vážných poškození DNA.
Jestliže nejsou před replikací opraveny, způsobují tato poškození
replikační blok. Buňky obnovují syntézu DNA v jiném replikačním
bodě.
Využití inhibitorů reparace DNA může zlepšit terapii. Inhibice
specifických enzymů jako je DNA polymeráza nebo topoizomeráza II.
K úspěšnosti chemoterapie přispívá řada faktorů. Jsou to
farmakologické faktory, které zabraňují adekvátní expozici látkou v
místě působení:
• způsob podávání léku - koncentrace a doba
• morfologické podmínky - absorpce, metabolismus, vaskularita a
okysličování tkáně.
Kromě těchto faktorů, které mohou být ovlivněny přizpůsobením
režimu, existují různé buněčné mechanismy odpovědné za nízkou či
vysokou hladinu rezistence.
54
Některé parametry lékové rezistence
Vnitřní (intrinsic) a získaná (acquired) rezistence
55
Mechanizmy lékové rezistence: selekce a indukce
K. Kohno et al. European Journal of Cancer 2005
Příklady transkripčních faktorů spojených s lékovou rezistencí
K. Kohno et al. European Journal of Cancer 2005
Různé modely lékové rezistence
a) genetická změna v nádorové buňce
indukuje MDR (multidrug resistance) a
vytváří se rezistentní klon.
b) malá populace kmen. buněk v nádoru
exprimující transportéry léčiva přežívá
chemoterapii a repopuluje nádor.
c) získaná rezistence - kmenová buňka
exprimující transportéry přežívá terapii,
kdežto komitované buňky hynou.
Mutací pak vzniká v populaci
přežívajících kmen. buněk rezistentní
fenotyp.
d) Vnitřní rezistence – jak kmen. buňky
tak různě diferencované buňky jsou
dědičně rezistentní, takže terapie má
malý efekt.
58
Dean M. et al. Nature Reviews Cancer 5, 2005:275-284
Determinanty dodání léku do cílového místa
59
Roden D.M. and Geirge A.L., Jr., Nature Rev Drug Discovery 1, 2001:37-44
Determinanty působení léku v cílovém místě
60
Roden D.M. and Geirge A.L., Jr., Nature Rev Drug Discovery 1, 2001:37-44
Neonkogenní a onkogenní léková rezistence
61
Blagosklonny M.V., Oncogene 23, 2004:2967-2975
Dvě cesty překonání lékové rezistence
62
Blagosklonny M.V., Oncogene 23, 2004:2967-2975
Antiangiogenní terapie
Cílená proti tvorbě nových cév v nádoru (proti endoteliálním
buňkám). Výhodná kombinace antiangiogenních a antihypoxických
látek posiluje smrt nádorových buněk.
63
Blagosklonny M.V., Oncogene 23, 2004:2967-2975
Cykloterapie
cílená na buněčný cyklus
Modulací pomocí inhibitorů kináz se stává nádorová buňka citlivá
k apoptóze. Zároveň je normální buňka zastavena v buněčném
cyklu a chráněna před účinky léčiva. 64
Blagosklonny M.V., Oncogene 23, 2004:2967-2975
Centrální úloha dráhy PI3K v buněčném růstu,
proliferaci, přežívání a motilitě
Marone R et al. Biochimica et Biophysica Acta 2008
Kombinované přístupy využívající inhibitory
dráhy PI3K/Akt/mTOR
Liposomy a genová terapie
Liposomy jsou využívány k cílenému dodání látky k nádorovým buňkám
(majícím příslušné povrchové receptory či antigeny).
67
p53 je 53-kD jaderný fosfoprotein (393 aminokyselin) - funguje jako
transkripční faktor
produkt 20-kb genu lokalizovaného na krátkém rameni lidského
chromosomu 17 - nádorově supresorový gen
Hlavní fyziologické funkce:
• regulace bun. cyklu v kontrolních bodech G1/S a G2/M
• indukce apoptózy
• stabilizace genomu
p53 kontroluje odpověď buněk na genotoxický stres indukovaný různými
podněty.
Ovlivňuje růst a viabilitu přes transkripční aktivaci nebo represi řady genů
p21 (zástava růstu), gadd-45 (reparace DNA), Bax, bcl-2, bcl-x, CD95
(apoptóza), mdm2 (zpětnovazebná regulace aktivity p53).
68
Úloha p53 v predikci odpovědi k chemoterapii
p53 zvyšuje chemosenzitivitu podporou apoptózy na transkripci
nezávislými nebo závislými mechanismy - aktivuje transkripci
proapotických genů bax nebo suprimuje transkripci
antiapoptických genů bcl-2.
p53 může snižovat chemosenzitivitu podporou
a) zástavy růstu závislou nebo nezávislou na p21,
b) reparace DNA a diferenciace,
c) zvyšováním transkripce antiapoptických genů jako je bcl-x
Ukazuje se, že účinky změněného statusu p53 na chemosenzitivitu
závisejí na buněčném kontextu.
69
Asi 60 % nádorů obsahuje mutovaný typ p53 - zvýšená stabilita,
neaktivní
Porucha funkce p53 u normálních buněk může spíše zvyšovat než
snižovat chemosenzitivitu.
Transformované buňky, které mají wild-type p53 mají tendenci
stát se rezistentními.
Ztráta divokého typu (wild-type) aktivity p53 je hlavním
prediktorem absence odpovědi na radioterapii a chemoterapii u
různých typů nádorů.
70
Figure 9.4 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Frekvence mutovaného p53 u různých typů nádorů
71
Účinky ionizujícího záření na normální (A) a
nádorové buňky (B)
72
Figure 9.5 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Přežívání u nádorů s různou formou p53
73
Table 9.2 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Cílové geny působení p53 a jejich funkce
74
Využití funkce p53 proteinu k selektivní likvidaci nádorových buněk
pomocí geneticky modifikovaného viru
75
Oliff A. et al., Scientific American 1996:144-149
Proliferační aktivita a nádorový růst
Růst vyjadřuje celkové zvýšení počtu buněk jako výsledek nárůstu buněk
proliferační aktivitou a ztráty buněk apoptózou nebo nekrózou.
Proliferační aktivita je výsledkem průchodu buněk bun. cyklem.
Mechanismus odpovědný za proliferační aktivitu (P) je rychlost buněčného
cyklu, která je v inverzním vztahu ke generační době (T) na jedné straně a
na druhé straně je ve vztahu k podílu buněk vstupujících do cyklu - růstová
frakce (G).
Matematické vyjádření vztahu je P = G/T
Vysoká proliferační aktivita je tak důsledkem buď velké růstové frakce nebo
krátké gener. doby nebo obojího.
Čas zdvojení (Td doubling time) nádoru (bez ztráty buněk) je definován jako
Td = T (log 2/log (G+1)
Krátký čas zdvojení je tedy výsledkem buď krátkého bun. cyklu nebo vysoké
růstové frakce nebo obojího.
76
Prediktivní markery
• techniky inkorporace značených analogů nukleotidů do DNA
3H tymidin (autoradiografie) nebo bromdeoxyuridin (BrdU,
imunohistochemie),
markery buněk v S-fázi bun. cyklu, tj. syntetizujících DNA.
Nevýhody: omezené použití in vivo, radioaktivita, dlouhé časy pro
vyhodnocení, subjektivní kriteria
• mitotický index (MI) - nejstarší metoda vyhodnocování proliferace mikroskopické
počítání mitotických figur na preparátech, do budoucna markery
pro FCM.
Mitózy však představují jen část proliferujících buněk a délka mitózy je
variabilní zejména u aneuploidních nádorů.
MI jen částečně koreluje s dalšími markery proliferace
• procento buněk v S-fázi - flow cytometrie - fluorescenční barvení DNA měření
fluorescence v suspenzi buněk
image (static) cytometry - absorpční barvení (Feulgenova reakce) - měření
buněk na sklíčku
77
Proliferační markery
Histogramy vyjadřující obsah DNA – ploidita, vyhodnocování % buněk
v jednotlivých fázích bun. cyklu - počítačové programy
SPF - S-phase fraction - celkem koreluje s dalšími markery (např. MI
nebo Ki67)
• imunohistochemické stanovení antigenů spojených s proliferací
PCNA - proliferating cell nuclear antigen - zvýšená exprese u
proliferujících buněk - koreluje s ostatními markery, ale ne vždy. Nepříliš
vhodný u nádorů, zvýšený i při reparaci DNA.
Ki67 - kódovaný genem na chrom. 10 je exprimován v G1, S a G2 fázi u
proliferujících buněk - částečně koreluje s dalšími markery.
DNA topoizomeráza II - exprese se rychle zvyšuje při přechodu S a G2 a
snižuje se na konci mitózy.
Organizátory jadérka (NORs) - segmenty DNA spojené s jadérky, které
obsahují geny kódující ribozomální DNA. Přispívají k regulaci syntézy
proteinů. Jsou vizualizovány barvením stříbrem - metoda AgNOR.
Koreluje s SPF, Ki67 a MI
78
Markery buněčné smrti
AI - apoptický index
Metody detekce apoptózy: morfologické hodnocení - světelná a
fluorescenční mikroskopie,
flow cytometrie (subdiploidní pík bun. cyklu, annexin V, TUNEL)
Další markery:
Molekuly na buněčném povrchu:
proliferace: CD71 - receptor pro transferin, receptory pro specifické
růstové faktory
apoptóza: CD95 (Fas)
Změny protoonkogenů a nádorově supresorových genů - fosforylace RB
proteinu, p53 (wild type, mutace), antiapoptický bcl-2 a proapotický bax
Změny cytoskeletonu
Markery neproliferujících a klidových buněk: statin
79
• Otázka interpretace a klinické využitelnosti jednotlivých
markerů
• Standardizace metod a hodnocení mezi laboratořemi
• Problematika heterogenity nádorů
• Statické vs. dynamické stanovení parametrů, časový rozvoj
• Exprese a změny různých onkogenů mohou podmiňovat též
citlivost nádorových buněk k chemo- a radioterapii
• Postižení vzájemných vztahů jednotlivých markerů
• Predikce odpovědí na léčbu
80
Důležité aspekty
Srovnávací genomová hybridizace a expresní
microarray analýza
Základní komponenta je fluorescenční poměrná hybridizace
In these processes, two nucleic acid samples to be compared are differentially
labeled with reagents that fluoresce at different wavelengths. They are then
hybridized along with excess, unlabeled repeat rich DNA, to the representation
of the genome onto which information is to be mapped. In CGH, the
representation may be either metaphase chromosomes or arrays of cloned
probes. In expression microarray analysis, the representation may be arrays of
cDNA clones or oligonucleotides.
81
Fluorescenční mikrofotografie z výsledků CGH analýzy lidské
línie z nádoru prsu MCF7
CF7 DNA was labeled
green and normal
reference DNA was
labeled red.
The chromosomes were
counterstained with DAPI.
Thus, regions of weak
hybridization appear blue,
regions of increased copy
number appear green and
regions of decreased copy
number appear red.
82
CGH analýza pokročilého nádoru prsu
The data are arranged along the x-axis with chromosome 20pter to
the left and chromosome 22qter to the right. The green:red CGH
ratio is plotted along the y-axis. The gray band indicates the region
of normal variability. Thus, values above the band show significant
increases in copy number and values below the band show
significant decreases in copy number.
83
Průnik metod molekulární biologie do onkologické diagnostiky
vyžaduje zpracování multiparametrických (vícerozměrných)
souborů dat.
Bioinformatika – data z „array“ analýz (DNA, proteiny),
lipidomická data
Využití multivariačních analýz pro predikce - analýza základních
(principal) component a diskriminační analýza.
Biomarkery, „surrogate biomarkers“ – „náhradní“ biomarkery
Patří mezi ně:
• důležité genetické a cytogenetické markery,
• exprese významných regulačních genů,
• aktivity enzymů,
84
Hodnocení dat – vícerozměrné analýzy
• cytokinetické parametry,
• parametry angiogeneze, atd.
Vyšetření na chemorezistenci v testech in vitro (MTT test) a
související znaky (exprese MRP, PGP).
Doplňují standardní klinická vyšetření a nespecifické ukazatele
imunologického a fyziologického stavu pacienta.
Je nutné vytvořit systém hodnocení takovýchto dat s cílem určit
jejich prognostický význam a zajistit zpětnou vazbu lékaře
k těmto hodnoceným datům – individualizace léčby – prospěch
pro pacienta
85
A B
E C
D
prognóza
A
E C
multi-
variační
analýza
86
prognóza
Schéma postupu vyhodnocování
závěry
sporné
výsledky
zobecnění pro jiné
situace, jiné typy
nádorů, zlepšená
predikce a terapie
existující informace pro
různé typy nádorů
(experimentální data I,
databáze), empirická
zkušenost
experimentální
verifikace částečných
nesrovnalostí na
modelech in vitro
vícerozměrné
analýzy
konstrukce
modelu
doplňování
klinických dat
přehodnocení
pomocí
biomatematických
přístupů
87
experimentální
data II
Získávání dat (experimenty, klinika)
a jejich vyhodnocování
Důležitá je zpětná vazba, kontrola, doplňování a přehodnocování získaných dat
Výukovou pomůcku zpracovalo
Servisní středisko pro e-learning na MU
http://is.muni.cz/stech/
88