Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
1
prof. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc.
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta MU
NÁDOROVÉ KMENOVÉ BUŇKY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
2
▪ Hypotéza CSCs
▪ Biologické vlastnosti CSCs
▪ Markery CSCs a možnosti jejich detekce
▪ Funkční testy fenotypu CSCs
▪ Terapie cílená proti CSCs
Program přednášky:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
3
HYPOTÉZA CSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
4
Nádorové kmenové buňky:
cancer stem cells, CSCs / tumor-initiating cells, TICs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
5
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
6
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
7
Zásadní změna pohledu na biologii nádorů:
A. stochastický/klonálně evoluční model
B. CSCs model
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
8
Heterogenní prostředí solidního nádoru
TICs = tumor initiating cells (= CSCs)
TACs = transiently amplifying cells
TD = terminally differentiated cells
C = kapilára
N = nekróza
CAF = cancer-associated
fibroblasts
TAM = tumor-associated
marcophages
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
9
BIOLOGICKÉ
VLASTNOSTI CSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
10
▪ specifické mikroprostředí (niche)
▪ schopnost sebeobnovy (self-renewal)
▪ proliferační potenciál / schopnost asymetrického
dělení
▪ diferenciační potenciál
▪ vysoká telomerázová aktivita
▪ specifické markery, resp. jejich kombinace
▪ specifické signální dráhy (Wnt, Notch, SHH)
▪ rezistence vůči apoptóze
▪ metastatický potenciál / schopnost EMT, resp. MET
Přehled biologických vlastností CSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
11
Mikroprostředí (niche) CSCs v solidních nádorech:
hypoxie, ECM, mezibuněčné interakce, extracelulární
(secernované) faktory a signály = "tissue makeup"
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
12
Diferenciace CSCs z nádoru mozku
v podmínkách in vitro:
neurony
astrocyty
nediferencované CSCs
Diferenciační potenciál CSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
13
Metastatický potenciál CSCs
▪ změny interakcí s ECM
▪ vytváření invadopodií (participace CD133?)
▪ u CSCs karcinomů schopnost EMT/MET
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
14
Epiteliálně mezenchymální tranzice (EMT)
= biologický proces, při němž polarizovaná epiteliální
buňka, která svým bazálním povrchem interaguje s
bazální laminou (ECM), prochází řadou
biochemických změn, díky nimž získá
mezenchymální fenotyp (zesílená schopnost
migrace, invazivita, vyšší rezistence k apoptóze a
zvýšená produkce komponent ECM)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
15
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
16
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
17
▪ nádorová transformace embryonálních SCs
(aberantní depozity embryonálních SCs v
organismu)
▪ nádorová transformace adultních SCs, resp.
progenitorových buněk v příslušné tkáni
▪ nádorová transformace diferencovaných buněk
ve tkáni (mutace podmiňující dediferenciaci na
fenotyp CSCs)
Hypotézy vzniku CSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
18
Hypotézy vzniku CSCs:
hCSCs
hESCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
19
SCs normální tkáně:
▪hematopoetické SCs
▪neurální SCs
▪neuroektodermální SCs
▪epiteliální SCs prsní žlázy
▪epiteliální SCs renálních
tubulů
▪SCs jaterní tkáně
▪ovariální epiteliální SCs
▪cervikální epiteliální SCs
▪epiteliální SCs sítnice
Odpovídající typ nádoru:
▪leukemie
▪nádory mozku
▪neuroblastom
▪nádor prsu
▪Wilmsův tumor
.
▪hepatoblastom
▪karcinom vaječníků
▪karcinom děložního krčku
▪retinoblastom
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
20
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
21
Vznik nádoru
v důsledku
transformace ASCs
nebo progenitorů:
karcinom prsu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
22
MARKERY CSCs A
MOŽNOSTI JEJICH DETEKCE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
23
▪ membránové / povrchové proteiny:
CD15, CD24, CD44, CD133, CXCR4, NCAM,
ABC transportéry
▪ cytoplazmatické proteiny:
nestin, Musashi-1, ALDH
▪ jaderné proteiny (transkripční faktory):
Sox2 , Oct3/4, Nanog
Kategorie markerů CSCs u různých typů malignit
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
24
Markery CSCs u nádorů dětského věku:
Friedman and Gillespie, Cancers 2011
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
25
▪ transkript:
RT-PCR / Real-time PCR
▪ protein:
imunodetekční metody
(imunohistochemie, imunocytochemie,
imunofluorescence, imunoznačení pro ELM,
imunoblotting, flow cytometrie / FACS)
detekce "side population" (SP)
Metodické možnosti detekce markerů CSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
26
Detekce "side population" (= SP):
▪ barvivo Hoechst 33342
▪ hodnocení při dvou emisních délkách:
450 nm (Hoechst blue) a 670 nm (Hoechst red)
▪ aktivita transmembránových ABC-transportérů
v CSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
27
Multiformní glioblastom
▪ nejčastější zhoubný nádor mozku u dospělých
(30-40 případy na 1 milion obyvatel ročně)
▪ CD133, CD15 (SSEA1), Sox2, Musashi-1, nestin
Meduloblastom
▪ nejčastější zhoubný nádor CNS u dětí
(2-6 případů na 1 milion dětí do 15 let ročně)
▪ CD133, CD15 (SSEA1), nestin
Neuroblastom
▪ nejčastější extrakraniální solidní nádor u dětí
(6-8 případů na 1 milion dětí do 15 let ročně)
▪ CD133, nestin
Markery CSCs u neurogenních nádorů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
28
CD133 (Prominin-1)
▪ membránový glykoprotein (5-TM family)
▪ 865 AA, 97 kDa
▪ apikální strana epitelií, membránové vezikly
▪ SCs i CSCs: organizace membránových protruzí
▪ účast v regulační dráze potlačující diferenciaci (?)
30 AA 30 AA
85 AA
50 AA
290 AA
255 AA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
29
CD133 (Prominin-1)
▪ AC133 – glykosylovaná forma
▪ epitop AC133: specifický pro CSCs
přístupný v závislosti na glykosylaci
CD133 / DNA AC133 / DNA
Osteosarkomová buněčná linie OSA-02
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
30
Nestin
= Neuronal Stem Cell Protein
▪ třída VI intermediárních filament
(1621 AA, 177 kDa)
▪ proliferující neuroepitelium během vývoje
▪ v dospělosti exprese za patologických podmínek
nestin / DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
31
Osteosarkom
▪ zhoubný nádor skeletu
(4-5 případů na 1 milion obyvatel ročně)
▪ CD133, nestin, Oct3/4, Nanog, ALDH, ABCG2,
CXCR4(?)
Rhabdomyosarkom
▪ zhoubný nádor svalové tkáně,
nejčastější u dětí
(5-8 případů na 1 milion dětí do 15 let ročně)
▪ CD133, nestin, ALDH, ABCG2, CXCR4(?)
Markery CSCs u sarkomů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
32
CD133Osteosarkom (tkáň)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
33
M/15 , Nestin
Osteosarkom (tkáň)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
34
Osteosarkom (tkáň)
F/14 , Nestin
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
35
Buněčná linie Saos-2 (ATCC) – osteosarkom
CD133 / DAPI Nestin / DAPI
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
36
Identifikace markerů CSCs v sarkomových buněčných liniích
OsteosarkomRhabdomyosarkom
CD133
Nestin
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
37
FUNKČNÍ TESTY
FENOTYPU CSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
38
▪ tvorba agregátů (aggregation assay)
▪ tvorba kolonií (colony forming assay)
▪ tvorba sfér (sphere formation assay)
▪ testy klonogenity (clonogenicity assay)
▪ testy tumorigenicity (tumorigenicity assay)
CSC
Základní funkční testy fenotypu CSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
39
Tvorba agregátů (aggregation assay)
▪ kultivace buněčných suspenzí v nádobkách s
neupraveným povrchem nebo metoda visících kapek
(hanging drops)
Linie OSA-02
(osteosarkom)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
40
Tvorba kolonií (colony-forming assay)
▪ vysetí naředěné buněčné suspenze na kultivační
misky  vytváření kolonií
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
41
Tvorba sfér (sphere-formation assay)
▪ vysetí naředěné buněčné suspenze do měkkého
agaru  vytváření kolonií
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
42
Testy klonogenity (clonogenicity assay)
▪ inokulace izolovaných buněk do 96-jamkových
destiček, proliferace a tvorba kolonií (>50 buněk)
▪ holoklony, meroklony, paraklony
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
43
Testy tumorigenicity (tumorigenicity assay)
▪ subkutánní injekce buněčné suspenze myším
▪ monitorování růstu nádorů, histologická analýza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
44
Buněčná linie NSTS-11 (rhabdomyosarkom):
pozitivní test tumorigenicity v NOD/SCID myších
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
45
CD133
nestin
M3A138 M3B138 M3C138
Buněčná linie NSTS-11 (rhabdomyosarkom):
imunohistochemická (IHC) analýza xenograftů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
46
M3A138
Buněčná linie NSTS-11 (rhabdomyosarkom):
imunohistochemická (IHC) analýza xenograftů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
47
Příklad komplexní
analýzy CSCs
in vitro
(osteosarkom)
(Tirino et al.,
FASEB J, 2011)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
48
Příklad komplexní analýzy CSCs in vitro (osteosarkom)
(Tirino et al., FASEB J, 2011)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
49
TERAPIE CÍLENÁ
PROTI CSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
50
Důsledky "paradigmatu CSCs" pro léčbu nádorů:
▪ selhání konvenční protinádorové léčby
(chemorezistence a radiorezistence CSCs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
51
Konvenční vs. cílená protinádorová léčba:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
52
Mechanismy chemorezistence CSCs:
▪ účinná schopnost reparace DNA
▪ variabilní exprese a fosforylace kináz
▪ nízká proliferační aktivita (Ki67 index)
▪ aktivní mechanismy "multidrug resistance"
(exprese ABC transportérů)
Mechanismy radiorezistence CSCs:
▪ účinná schopnost reparace DNA
▪ nízká proliferační aktivita (Ki67 index)
▪ overexprese antiapoptotických genů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
53
Možné strategie léčby cílené proti CSCs:
▪ ovlivnění interakcí mezi CSCs a mikroprostředím
▪ indukovaná diferenciace
▪ ovlivnění signálních drah udržujících sebeobnovu
Riziko: poškozeních adultních SCs v nenádorové tkáni
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
54
Příklady konkrétních strategií léčby cílené proti CSCs:
▪ onkolytická virová terapie s využitím
modifikovaných adenovirových vektorů proti
CD44+/CD24- buňkám – karcinom prsu
▪ anti-EpCAM monoklonální protilátka – karcinom
pankreatu
▪ ATRA-indukovaná diferenciace – neuroblastom
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 08 / 10.4.2017
55