Úkol č. II Identifikace transgenních rostlin Arabidopsis thaliana
Agrobacterium tumefaciens T-DNA
Geny selekční NPT, HYG, Bašta
Geny signální GUS, GFP
Bum
Metody identifikace transgenních rostlin
1) Selekce na médiu s antibiotikem -kanamycin,
Gen NPT (neomycin phosphotransferase)
2) Polymerázová řetězová reakce
3) Southernova hybridizace
Southernova hybridizace a počet inzertů
R6-5	R6-9	R6-14	R4-1	R4-37	R4-79		R5-13	R5-15	R5-20	R5-24
B H	B H	B H	B H	B H	B H		B H	B H	B H	B H
		i								
	* *	* a	* •		M					
		4 1		■				-		-
-3
1    copy # 1
1-2
Transgenní rýže, linie R
Značená sonda pro gen HP71I Restriktázy B - BamM, H - HindW
Selekce na médiu s antibiotikem
Postup
Materiál:
Kontrola Wassilevskaja transformované linie - RJG, ER4
1. Příprava selekčního média s antibiotikem a bez antibiotika (kanamycin)
2. Sterilizace semen, metodika
3. Výsev na misky
4. Vyhodnocení klíčních rostlin KanR, Kans
5. Vyhodnocení počtu inzertů   KanR : Kans
6. Přesazení rostlin KanR, důkaz PCR
Vyhodnocení počtu inzertů
Rezistence ke kanamycinu je dominantní znak
• 1 inzert    3 :1  KanR : Kans
• 2 inzerty 15 :1
• 3 inzerty 63 :1
1. Jak se změní štěpné poměry, jestliže 2 a více inzertů je ve vazbě?
2. Určení počtu inzertů u testovaných inzerčních i n 11.
3. Přesazení rostlin a identifikace inzertu PCR.
PCR pro NPT Postup
Polymerázová řetězová reakce Primery pro NPT
5' CCCGCTCAGAAGAAGAACTCGTCA 3' 5' TGGCTGCTATTGGGCGAAGTG 3'
Program pro amplifikaci genu NPT (94C 45s, 60C 45s, 72C 60s) 35x
Složení reakční směsí
dH20 5,6 ul
dNTP 0,25     200 uM
5x PCR pufr 2,0 Primer-1 0,5 Primer-2 0,5 Go Taq-polymeráza 0,15     0,75 U Rostlinná DNA 1,0
10,0