Protokol č.1: Imunologie hmyzu – hemocyty
1. Úvod: hemocyty = krevní buňky hmyzu, slouží především k pohlcování cizorodých
částic (jednoduchý imunitní systém) a hojení ran.
Typy: prohemocyty, plazmatocyty, granulocyty, sferulocyty, adipohemocyty,
oenocytoidy, koagulocyty. Mají různé funkce (fagocytóza, koagulace), mohou být
sesilní (usedlé) x volné (cirkulující), odlišné zastoupení během vývoje, infekce atd.
2. Odběr hemolymfy larev VII. instaru zavíječe voskového Galleria mellonella a larev
III. instaru Drosophila melanogaster, fenylthiomočovina jako antikoagulant, naředění
vzorku 20x v pufru (fosfátový pufr, pH=7,0), fotodokumentace (Olympus SZX9 +
Nikon D3100).
Obr. Drosophila melanogaster: zleva kukla a larva, samotná larva III. instaru, více larev.
3. Počítání hemocytů v Bürkerově komůrce, porovnání s počtem lidských krvinek:
Počet buněk v 1 mm3
(µl) suspenze lze určit vzorcem: z
hvc
n
b *
**

b...počet buněk v 1 mm3
n...celkový počet napočítaných buněk
c...počet čtverců ve kterých se počítalo (nejčastěji 25 nebo 50)
v...plocha použitého čtverce (malý nebo velký)
h...hloubka komůrky
z...použité ředění suspenze (uvádí se kolikrát byla suspenze ředěna např. 20x, tedy 20)
Hloubka: 0,1 mm
Plocha malého čtverce: 1/400 mm2
= 0,0025 mm2
Plocha velkého čtverce: 1/25 mm2
= 0,04 mm2
Počítáme ve 20 velkých čtvercích.
Počet hemocytů G. mellonella uvádí Chapman1998: 4 mil./celá larva VII. instaru,
Shapiro 1968: průměr ± SD: 33693 ± 3300 v mm3
Počet hemocytů D. suzukii: Kacszoh et al. 2012: 150-200 /larvu III. instaru, která obsahuje cca 2.5 µl
hemolymfy
Lidské erytrocyty: 3-6.106/ mm3
Lidské leukocyty: 4-9.103/ mm3
Výsledky:
G. mellonella: 27 500 hemocytů v 1µl
Drosophila: 57 800 hemocytů v 1µl (během ředění se stala chyba, což vysvětluje abnormální
koncentraci hemocytů)
4. Specifické barvení hemocytů G. mellonella 0.05% akridinovou oranží (granulocyty),
fotodokumentace (Olympus BX43 + kamera Infinity 2, Quick Photo Micro software).
Výsledky: 6 500 granulocytů v 1µl.
Obr. hemocytů G. mellonella po obarvení, přičemž granulocyty získají výraznou
oranžovou barvu
5. Adherence plasmatocytů G. mellonella pomocí přidaných vápenatých iontů (CaCl2,
0.022g v 10 ml H2O) fotodokumentace.
6. Hemocyty D. melanogaster značené RFP (hml-Gal4;UAS-RFP), fotodokumentace.
Výsledky: hemocyty značené RFP pod fluorescenčním mikroskopem svítí výrazně rudě.
7. Závěr
V dnešním cvičení jsme s použitím bürknerovy komůrky počítali hemocyty odebrané
z Galleria mellonella. Vyšlo nám, že v přepočtu na jeden μl je v hemolymfě 27500
hemocytů. Dále jsme u G. mellonella pozorovali adherenci plazmatocytů pomocí přidaných
vápenatých iontů a hemocyty značené RFP.