^ E R S/j,
-5s
S? >
i—«
J
'IVA ^
Metodika sledování vrozené imunity ptáků
PROKOPOVÁ L. (1), VINKLEROVÁ J. (2), VINKLER M. (2), HYRŠL P. (1)
(l)Oddělenífyziologie a imunologie živočichů, Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Kotlářská 2, Brno; (2) Katedra zoologie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze, Praha 2 prokopova. I @ centrum, cz
diäter a&xř
Uvod
Imunitní systém ptáků jakožto jeden ze základních homeostatických mechanismů organismu zahrnuje stejně jako u ostatních živočichů imunitu nespecifickou a specifickou. Předmětem našeho zájmu se stala imunita nespecifická neboli vrozená, jež je evolučně starší a neměnná. Mechanismy této imunity, jejichž aktivace je v případě potřeby takřka okamžitá, dělíme na složku humorální a buněčnou.
Humorální složku zde představuje především komplementový systém a lysozym, mimo to také různé druhy interferonů, lektinů Či sérových proteinů. Složku buněčnou reprezentují fagocytující a cytotoxické buňky. Pro měření imunitních parametrů jsme jako modelové organismy vybrali následující druhy ptáků: křepelka japonská (Coturnix japonica), kur domácí (Gallus gallusf. domestica) a sýkora koňadra (Parus major).
Obr. ]: Modelové organismy. Zleva: křepelka japonská (Coturnix japonica), kur domácí (Gallusgallusf. domestici sýkora koňadra (Parus major)
Vrozená I (nespecifická) [ imunita ptáků J
Humorální složka
Lysozym
Komplement
Bunecna	I - Fagocytóza
složka	
L J	
Obr.2: Námi studované mechanismy vrozené imunity ptáků
Komplementový systém ptáků
Komplementový systém představuje hlavní komponentu humorální nespecifické imunity. Jako takový se skládá z 25-30 sérových a membránových proteinů kooperujících jak mezi sebou, tak i s dalšími imunitními mechanismy jako je například fagocytóza.
Složky komplementu se v reakci na cizorodý podnět kaskádovitě aktivují a tím spouštějí imunitní reakci. Terminálním produktem této kaskády je tzv. MAC (membráne attack complex). Ten perforuje membrány některých mikroorganismů a způsobuje tak jejich lýzi.
K aktivaci komplementového systému dochází 3 možnými způsoby - klasickou, alternativní a lektinovou cestou. Dříve se vědci domnívali, že ptáci jsou schopni pouze klasické cesty aktivace, nedávno však byly konkrétně u kuřat objeveny i další dvě cesty, tedy alternativní a lektinová.
Stanovení aktivity komplementového systému
Obr.č.3: Stanovení aktivity komplementu křepelky japonské, jejíž plazma byla před hlubokým zamražením (-S0°C) skladována při různých podmínkách apo různě dlouhou dobu. Blank - PBS (pH 7,4). Z grafu je patmé, že stáří plazmy či teplota při skladování neměly na aktivitu komplementu vliv, jaký by se dal očekávat -tedy čím starší krev či vyšší teplota, tím nižší aktivita. Naopak, naměřené hodnoty plazmy, jež byla zamražena v nejkratších známi zvolených intervalů (0 hodin, 6hodin) vykazují překvapivě nejnižší aktivitu komplementu.
Relativně nová metoda stanovení bakteriolytické aktivity komplementu využívá bioluminiscenční bakterie Escherichia coli (K12pGFPluxBAmp). Bakteriální luminiscence (viz rovnice) je přitom přímo úměrná jejich viabilitě.
ATP + D-luciferin + 02 -> ADP + PPi + oxyluciferin + H20 + světlo
Princip metody je založen na měření kinetiky bioluminiscence v závislosti na baktericidních účincích komplementového systému, odečítáme čas potřebný pro usmrcení 50% bakterií.. Čím vyšší je tedy aktivita komplementu, tím více bakterií zlyzuje a tím nižší bioluminiscenční signál získáme. V průběhu měření se postupovalo dle Buchtíková et al. (2011) za použití luminometru Immunotech LM - OlT .
Stanovení lysozymu v plazmě
Lysozym patří do skupiny hydrolytických enzymů. Jako takový rozkládá základní komponentu bunečných sten bakterií - polysacharid murein. Lýzi podléhají především grampozitivní bakterie, jejichž mureinová vrstva na rozdíl od gramnegativních bakterií postrádá vnější lipopolysacharidovou membránou. U ptáků, stejné jako u všech obratlovců je lysozym součástí krevní plazmy Či slin, dále také vaječného bílku a žloutku.
Množství lysozymu lze stanovit metodou radiální difúze v agaróze s přídavkem Micrococcus luteus dle Laemmliho (1970) modifikovaná podle Hyršl & Simek (2005). V rámci metody dochází k difúzi lysozymu do okolního gelu a následné interakci s M. luteus, jež se projevuje vyČeřením okolí jamky, do které byl nanesen vzorek. Plocha prosvětlení přitom odráží aktivitu lysozymu.
Obr.č.4: Agarózový gel s difúzními zónami - po obvodu lysozym pro kalibraci, uvnitř vzorky slepičí plazmy.
Koncentrace lysozymu v plazmě kura domácího byla z kalibrační křivky přepočtena jakožto hodnota 0,1 mg/ml, tedy o něco nižší než u savců, u kterých se koncentrace lysozymu pohybuje s mezidruhovými rozdíly mezi 0,3 a 0,5 mg/ml. Plazma byla připravena centrifugací krve při 2500 x g/10 min, poté zamražena při-20°C. Množství lysozymu nanášené do jamek bylo 50\i\.
Fagocytóza
Fagocytóza je u ptáků zprostředkována funkčními ekvivalenty savčích neutrofilů označovaných jako heterofily. Průběh fagocytňzy je zpočátku stejný u obou typů těchto granulocytů, avšak konečné fáze, tedy likvidace pohlceného mikroorganismu je značně odlišná.
Savčí neutrofily využívají primárně oxidativních mechanismů známých také pod názvem respirační vzplanutí. Tento proces je zahájen aktivací membránového enzymu NADPH oxidázy a postupnou produkcí reaktivních kyslíkových intermediátů. Výsledkem je myeloperoxidázou katalyzovaný vznik baktericidních chlornanových aniontů.
Ptačí heterofily však myeloperoxidázu postrádají, přesto však k respiračnímu vzplanutí dochází, avšak v daleko menší míře než u savčích neutrofilů. Prvotně jsou proto využívány mechanismy na kyslíku nezávislé, tedy neoxidativní. Za ty je zodpovědný především beta-defensin, který je hlavní komponentou heterofilních granul.
Stanovení respiračního vzplanutí fagocytů
Stanovení respiračního vzplanutí čili baktericidní schopnosti fagocytů je založeno na chemiluminiscenční analýze. Ta je zprostředkována luminoforem, který je excitován prostřednictvím volných kyslíkových radikálů. Během návratu luminoforu z excitovaného do základního stavu dochází k emitaci světla, jehož hodnota je přímo úměrná míře fagocytňzy.
K běžnému stanovení respiračního vzplanutí neutrofilů savců Či ryb se jako luminofor používá luminol. Z důvodu nízké hladiny produkovaných kyslíkových radikálů je však v případě ptáků nutno použít mnohem citlivější luminofor. Takovým se osvědčil být Pholasin - fotoprotein extrahovaný z mořských měkkýšů rodu Pholas dactylus (Sild and Horák , 2010 ).
1) Stanovení senzitivitv fagocytů k různým typům aktivátorů
Modelový organismus: křepelka japonská, staří krve: 18 hodin. Zvolené aktivátory: LPS (lipopolysacharid), PMA (forbol-12-myristát-13-acetát), ZP (zymosanové partikule), fMLP (formylmetionylleucinfenylalanin)
Obr.č.5: Reakce křepelky japonské na různé druhy aktivátorů.
Z výše uvedeného grafu vyplývá, že nejrychlejší je reakce s LPS, k té dochází během několika málo vteřin, kdy dosahuje maxima a poté prudce klesá. Intenzivní reakce byla zaznamenána také u reakce s PMA, křivka má však tentokrát charakter postupného růstu s maximem dosaženým až po několika minutách. Naopak velmi slabou reakci vykazuje ZP, kde takřka nedochází k žádnému nárůstu intenzity. Stejnou situaci jsme zaznamenali také v případě fMLP, která se však díky absenci receptoru pro tento typ aktivátoru dala očekávat (Kogut et al. 1998).
2) Aktivita respiračního vzplanutí mláďat sýkory koňadry v reakci na LPS S. enterica a E. coli
LPS bakterií ředěny s pufrem (DPBS, pH 7,4) v poměru 1:1, staří krve : 2-6 hodin
Obr.č.6: Respirační vzplanutí sýkory koňadry v reakci na LPS E.coli a S.enterica
Reakce fagocytů s LPS E. coli je v porovnání se S. enterica znatelně vyšší, což koreluje s výsledky Sild a Horák 2010. Křivka vykazuje trend růstu s maximem dosaženým po několika málo sekundách. Následně dochází k pozvolnému klesání, které se přiblíží k hodnotě blanku až po více než hodině. Naopak reakce se S. enterica dosahuje maxima ihned po jejím přidání. Stejně tak pokles na úroveň blanku, tedy vyčerpání volných radikálů je téměř okamžité. Příprava vzorků a podmínky měření:
Námi provedená měření probíhala za použití kitu typu ABEL® Cell Activation Test Kit for Whole Blood or Isolated Cells with Pholasin and Adjuvant-K™. Měření pomocí tohoto typu luminoforu probíhalo na vzorcích plné krve odebírané z křídelní žíly ptáků do heparizováných kapilár. Krev byla poté až do počátku měření skladována při 4°C. Jako blank byla použita plazma daného ptačího druhu získaná centrifugací při 2500 x g/10 min. K měření luminiscence byl použit opět luminometr Immunotech LM - OlT.
Zaver: Výše uvedené metody stanovení komplementu, lysozymu či fagocytňzy, tedy základních mechanismů vrozené imunity se v našem případě osvědčily jako použitelné pro větší studie. Především stanovení respiračního vzplanutí pomocí Pholasinu je velice praktická a přesná metoda, která v případě ptáků nahrazuje malou citlivost luminolu. V rámci této metody byly vůbec poprvé použity jako modelové organismy sýkora koňadra či křepelka japonská.
Literatura: Buchtíková S., Šimková A. Rohlenová K., FlajŠhans M., Lojek A., Liliuse E., Hyršl P.: The seasonal changes in innate immunity of the common carp {Cyprians carpio). Aquaculture 318: 169-175,2011. HyrŠl P., Šimek V.: An analysis of hemolymph protein profiles during the final instar, prepupa and pupa of the silkworm, Bomby f: mori (Lepidoptera: Bombycidae). Biologia, 207-23, 2005. Laemmli U.K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680 - 685, 1 970.
Kogut M.H., Holtzapple C, Lowry V.K., Genovese K., Stanker L.H.: Functional responses of neonatal chicken and turkey heterophils following stimulation by inflammatory agonists. Am J Vet Res 59: 1404-1408, 1 998.
Sild E. and Hôrak P.: Assessment of
whole blood samples. Validation and application of a che mi luminesce nee method based on Pholasin. Behav Ecol Sociobiol, 64: 2064-2076, 2010.
Tato práce byla podpořena granty GACR P506/12/2472a P505/10/187L