BÍ8313:  Praktikum z genového inženýrství  (jaro 2017)
Expresia a stanovenie funkcie proteínov
MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
LABORATOŘ MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKY MIKROORGANISMŮ
EXPRESIA PROTEÍNOV
Testujeme variabilné podmienky:
EXPRESIA PROTEÍNOV
Testujeme variabilné podmienky
-
náročn í?vy
ŕ!
\ folding oká MW?)
jednoduchý fold (?nizk:a MW?)
cold-shock proteiny
15°C
Teplota    4 2° C
rmofilné
proteiny
pomalá dlhodobá expresia 2 rýchla nárazová expresia
EXPRESIA PROTEÍNOV
Ďalšie vplyvy  ►expresný organizmus
►expresný vektor
(low vs high copy) ► médium
►OD kultúry pri indukcii
C8980
Ak vás zaujiam viac: - Protein expression and purification
EXPKESIA PROTEÍNOV V BL21 (DE3)
E.  coli BL21ÍDE3)
ENDOLYZÍN FÁGA 812F1
MÄKT QÄEINKRLDAYAKGTVDSPYRVKKATSYDPSFGVMEÄGÄIDÄDGYYHAQC QDLITDYVLWLTDNKV RTWGNÄKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIÄVFTSGSYEQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQETONG Y
ANKKP T KRVDN YYGL T H FIEIPVKAGTTVKKETÄKKSÄSTPÄTRPVTGSWKKNQ YGTWYKPENÄTFVNGN QPIVTRIGSPF LNÄPVGGNL PÄGÄTIVYDEVCIQÄGHIWIG YNÄ YNGNRV YC P VRT C Q GVP PNQIP GVÄW GVFK
AÄ:  2 8 4 MW:  31.38 kDa pi: 9.32
CHAP domain: lytická aktivita SH3b domain: vazbová aktivita organizmus:  S.  aureus (10-42°C)
pomalá dlhodobá expresia 2 rýchla nárazová expresia
OD = 0.5 30°C/5 hod 0.4mM IPTG
OD = 0.5
22°C/16 hod 0,04mM IPTG
ZYMOGRAM  (IN GEL)   - PRINCIP
Zymography is a technique for studying hydrolytic enzymes on the basis of substrate degradation.
a
In oeJ zymography
SDS PAGE gel with copotymerized substrate, e.g.. gelalin. casein. ..
Sample to notveduong loading buffer
Slmidard prolGin(asa) mix
I III ■ IIMIII <
Eleclfophorcsis Washed m Triton X-100 soluiion
Incubated in a suitable assay buffer ,     Slamed and visualized (e.g., Coomassie blue staining)
UlMiUUlMfU	
• ■	i
	
peptidoglycan
DTT
reduction, of C-C
(in lysis buffer - prevents oxidation of thiol groups, if C-C present in your protein it is not recommended]
http://www.nature.com/nmeth/j ournal/vlG/n3/full/nmeth.2371.html
OVERLAY ASSAY - PRINCÍP
OVERLAY ASSAY  IS  PRIMARLY USED FOR SCREENING
EXPRESSION LIBRARIES