DELÉCIA RESTRIKČNÝCH MIEST NA 5-KONCOVÝCH EXTENZIÁCH POMOCOU MUNG BEAN NUCLEASE
Reagencie:
Štiepený plazmid – 0,4 ug
Mung Bean Nuclease Reaction Buffer 10X – 2 ul
Mung Bean Nuclease – 0,5 U
H2O – do 20 ul
Postup:
1. Premiešajte reagencie aby vznikol 1X reaction buffer, nukleázu pridávame ako poslednú! Znova
premiešame, shortspin – aby na skúmavke neostali kvapky.
2. Inkubácia 30 °C/30 min
3. Pridanie SDS do kocnentrácie 0,01 %.
4. Prečistenie konštruktu etanolovou precipitáciou alebo PCR purification kitom.
PRECIPITÁCIA DNA ETANOLOM
Reagencie:
Mungo-zmes (alebo akákoľvek DNA zmes vhodná na prečistenie)
Na3-acetát (3M, pH = 5,2)
Etanol 96%
Etanol 70%
TE buffer (pH = 8)
Postup:
1. Pridajte k DNA zmesi 1/10 objemu Na3-acetátu, premiešajte.
2. Pridajte 3 objemy 96% etanolu, premiešajte.
3. Inkubujte na ľade/15 min
4. Centrifugujte 14 000G/15 min
5. Odstráňte supernatant, DNA pelet môže a nemusí byť viditeľný okom.
6. Prevrstvite 70% etanolom, centrifugujte 14 000G/10 min.
7. Nechajte vyschnúť v digestori (cca 20 min), alebo vo vákuovej odparke (5 min), rozpustite v 10 ul TE
pufru.
BLUNT-END LIGÁCIA
Reagencie:
Mungom-ošetrený naštiepený plazmid – 50 ng
Ligation Buffer 10X – 2 ul
Ligáza – 4 weiss unit (0,67 ul)
H2O – do 20 ul
Postup:
1. Premiešajte reagencie aby vznikol 1X reaction buffer, ligázu pridávame ako poslednú! Znova
premiešame, shortspin – aby na skúmavke neostali kvapky.
2. Inkubácia 16 °C/cez noc.