1. úloha. Izolace restrikčních endonukleáz z bakteriálních buněk
Reštrikční endonukleázy (RE) jsou součástí reštrikčné modifikačních systémů řady bakteriálních druhů. Jednou z jejich funkcí je degradace cizorodé DNA. Izolace RE z bakteriálních buněk je poměrně jednoduchá a obecněji lze rozdělit do následujících kroků:
1. Kultivace bakteriálních buněk. Baktérie se pomnoží v tekutém živném mediu do exponenciální až pozdně exponenciální fáze růstu (růstové podmínky - tj. složení živného media a teplota - se zvolí podle konkrétního organismu).
2. Shromáždění buněk. Buňky se zcentrifugují při nízkých otáčkách a promyjí vhodným pufrem.
3. Lyza buněk. Buňky se zlyzují pomocí enzymů (někdy jen částečně nalyzují) a rozbijí. K lyži buněk se nepoužívají detergenty (denaturace proteinů). K rozbití buněk se používá několika způsobů, z nichž nej častější jsou:
- osmotický šok
- drcení buněk (balotina, skleněný prášek, oxid hlinitý aj.)
- sonikace (představuje univerzální a nej používanější způsob rozbití buněk)
4. Přečištění lyzátu. Lyzát se zbaví zbytků buněčných stěn a ribozómů centrifugací při vysokých otáčkách.
5. Odstranění nukleových kyselin (před odstraněním jsou NK substrátem řady nespecificky působících nukleáz a vedou ke zvýšení relativního podílu RE). NK se odstraňují vysražováním se streptomycinsulfátem nebo polyetyléniminem. Vzniklý precipitát se odstraní centrifugací. Zbytky streptomycinsulfátu a nízkomolekulární látky se odstraní dialýzou, případně promytím lyzátu na chromatografické koloně (např. heparin-agaróze). Takto lze RE rovněž zakoncentrovat.
7. Uchovávání extraktů. RE lze skladovat buď bez purifikace a zakoncentrování při 4°C (jako tzv. hrubý lyzát), nebo po pročištění a zakoncentrování ve vhodném pufru s 50% glycerolem při -20°C.
Poznámky k izolaci:
1. Během izolace nesmí teplota překročit 10°C (inaktivace RE!)
2. Sonikační roztok obsahuje merkaptoetanol, který je zdraví škodlivý!
3. Je vhodné k práci použít sterilní materiál; kontaminace mikroorganismy může vést k degradaci RE.
4. Při práci s ultrazvukem je třeba dodržovat bezpečnostní předpisy.
Izolace restrikčních endonukleáz Sau3Al a Sau96 z buněk 5. aureus
Organismy: Bakteriální kmen Staphylococcus aureus PS 3A a S. aureus PS96. Fág 3A, 96, lambda (nebo jejich DNA).
Materiál: Živný bujón (500 ml), promývací pufr (0,05 M TRIS.C1, 0,015 M Na3citrát, pH 7,4), lyzostafin (200 U/ml), sonikační pufr (0,01 M TRIS.C1, 0,01 M 2-merkaptoetanol), streptomycinsulfát (10% zás. roztok v sonikačním pufru), dialyzační hadice, agaróza, TAE elektroforetický pufr, nanášecí barvivo pro elektroforézu.
Přístroje: termostat, centrifuga T23, ultracentrifuga UP65, ultrazvukový sonikátor, zařízení pro elektroforézu, transiluminátor.
Postup
1. 500 ml bujónu naočkujeme 25 ml 18h/37 °C bujónové kultury příslušného bakteriálního kmene a necháme inkubovat přes noc při 37 °C. {=)
2. Buňky zcentrifugujeme v centrifuze T23 při 6000ot/min při 4°C, 10 min. Sediment buněk zvážíme (očekávaná hmotnost 2-3 g, minimální požadovaná hmotnost 1,5 g).
3. Sediment promyjeme promývacím pufrem (lx) a zcentrigujeme jako v bodě 2) a resuspendujeme v 10 ml promývacího roztoku.
4. Přidáme roztok lyzostafinu do výsledné koncentrace 5U/ml a inkubujeme 15 min při 37 °C za občasného promíchání. Nesmí dojít k úplné lyži - kontrolujeme vizuálně.
5. Buňky zcentrifugujeme 10 min při 5000 ot/min a 4 °C a sediment resuspendujeme v 10 ml sonikačního pufru.
6. Buněčnou suspenzi vychladíme v ledové vodní lázni (5 min) a buňky rozbijeme ultrazvukem (10x 30-sekundových intervalů - průběžně chladíme tak, aby teplota nepřekročila 10 °C !) (=)
7. Buněčné zbytky a ribozómy odstraníme centrifugací 1 hod při 35 000 ot/min , 4 °C v centrifuze UP65 (rotor 8x11 ml).
8. K supernatantu přidáme roztok streptomycinsulfátu do ví=Jdné koncentrace 1% a ponecháme 1 hod při 4 °C. Sraženinu zcentrifugujeme 10 mmpři 30 000 ot/min, 4 °C na centrifuze UP65 (rotor 8x11 ml).
9. Supernatant přeneseme do připravené dialyzační hadice (vařit 10 min. v roztoku uhličitanu sodného a potom 2x v destilované vodě) a dialyzujeme proti sonikačnímu pufru přes noc (4°C, 3x 500 ml pufru).
10. Jemný precipitát odstraníme centrifugací (5000ot/10 min, 4°C) a supernatant přeneseme do sterilní zkumavky a rozdělíme do několika alikvotních částí. Takto připravený hrubý extrakt uchováváme při 4°C (zůstává aktivní po dobu nejméně 1 roku).
11. Stanovíme aktivitu restrikčních enzymů přítomných v hrubém extraktu.
Stanovení aktivity restrikčních endonukleáz Sau3Al a Sau96
Reštrikční endonukleázy Sau3A a Sau961 štěpí DNA fága lambda a rovněž DNA stafylokokových bakteriofágů, které byly propagovány na kmenech S. aureus nesoucích reštrikčné modifikačními (RM) systémy odlišné od RM systémů přítomných v kmenech PS3 A a PS96. Této skutečnosti lze využít k důkazu endonukleolytické aktivity enzymů přítomných v hrubých extraktech připravených v úloze č. 1.
Materiál: Hrubé extrakty připravené v úloze č. 1, DNA fága lambda (1 mg/ml), DNA stafylokokových fágů 3A, 96 a 71 (konc. 200-500 ug/ml), 50x kone. TAE elektroforetický pufr, agaróza, štěpící pufir 10x koncentr., 6x konc. nanášecí barvivo,
Přístroje a zařízení: mikrocentrifuga, termostat, Eppendorfovy zkumavky, automatické pipety a špičky, zařízení pro elektroforézu, transiluminátor, fotoaparát.
Postup
1. Do Eppendorfovy zkumavky napipetujeme:
- 10 ul sterilní deštil, vody
- 5 ul roztoku DNA fága (lambda, případně některého ze stafylokokových fágů) (asi 1 ug)
- 3 |ul hrubého extraktu izolovaných RE
- 2 ul 10x konc. štěpícího pufru (aktivitu ověřujeme v pufrech A, M a MULTI-CORE) Současně založíme reakční směs, v níž je hrubý extrakt nahrazen deštil, vodou
2. Směs dobře promícháme pipetou a zcentrifugujeme 1 min.
3. Inkubujeme 2 hod při 37 °C.
4. Zahřejeme 5 min při 56 °C a necháme pomalu ochladit na pokojovou teplotu
5. Přidáme 3 ml nanášecího barviva a dobře promícháme pipetou
6. 20 ml roztoku naneseme na 0,7 % agarozový gel a provedeme elektroforetické rozdělení (3-4 hod při 40 m A)
7. Gel přeneseme do barvící lázně (TAE pufr obsahující 1 mg etidiumbromidu/ml) a necháme barvit 0,5 hod.
8. Gel opláchneme deštil, vodou (5 min) a pozorujeme pod UV světlem. Pořídíme fotografický záznam.
Poznámky:
1. Etidiumbromid je mutagen - pracujeme v rukavicích a na vyhrazeném místě.
2. Při práci s UV světlem chráníme oči a pokožku