Klonování genu pro fágovy endolyzin a ověření exprese endolyzinu
V průběhu reprodukčního cyklu bakteriofága se lyrické enzymy uplatňují při iniciaci infekce, kdy vytvářejí v bakteriální buněčné stěně drobné léze, kterými se dovnitř buňky dostává fágová genomová nukleová kyselina. Lytické enzymy tohoto typu se vyskytují jako komponenty fágových částic, zejména fágových bičíků. Druhá skupina fágových lytických enzymů (endolyzinu a spolupůsobících holinu) se uplatňuje na konci reprodukčního cyklu fága, kdy se fágové potomstvo uvolňuje z hostitelské buňky. Tyto enzymy mají za následek rozsáhlou degradaci buněčné stěny bakterií. Katalytická doména lytických enzymů je tvořena jednou ze 4 typů hydroláz peptidoglykanu: endo-P-N-acetyl-glucosaminidázy a N-acetyl-muramidázy, jejichž cílem jsou cukerné složky peptidoglykanu; endopeptidázy, které štěpí peptidové vazby; a N-acetylmuramyl-L-alanin-amidázy, které hydrolyzují amidovou vazbu spojující cukernou složku a peptid. Lytická aktivita mnoha rekombinantních bakteriofágových enzymů je v současnosti studována jako nová třída antibakteriálních látek. Lytické enzymy je možné klonovat v různých bakteriálních klonovacích systémech, aniž by působily na buňku toxicky, protože v buňce není přítomen holin, díky kterému se lytický enzym dostává do periplazmatického prostoru k buněčné stěně.
Ve cvičení budeme pracovat s genem pro endolyzin fága 812F1 jehož velikost je 855 bp a enzym má velikost 284 aminokyselin, tedy jeho hmotnost je 31,5 kDa. Aktivita enzymu bude ověřena také pomocí zymogramu, kdy se do gelu na SDS PAGE přidává suspenze buněčných stěna bakterií S. aureus. Pokud je lytický enzym aktivní, vmiste na gelu, které odpovídá, jeho molekulové hmotnosti se objeví lytická zóna na jinak mléčně matném gelu.
1. Příprava kompetentních buněk pro transformaci
Jako recipientních kmenů pro klonování cizorodé DNA se nejčastěji využívá kmenů E. coli, které byly mutacemi a metodami genového inženýrství upraveny tak, aby byly schopny s vysokou účinností přijímat externí DNA (většinou plazmidovou), umožňovaly její replikaci a udržovaly její původní strukturu (tj. nezpůsobovaly vystepování nakloňované DNA) a dovolovaly selekci rekombinantních plazmidů. Podrobná charakteristika těchto kmenů (zejména jejich genotyp) bývá uváděna v katalozích firem a praktických příručkách.
Vlastní navození kompetence spočívá v pomnožení buněk příslušného kmene E. coli v tekutém živném mediu (např. LB bujónu) do exponenciální fáze růstu, převedení buněk do roztoku CaCl2, v němž se buňky ponechají několik hodin, během nichž dojde k jejich vyhladovění a určitým změnám v buněčné stěně, umožňujícím přijmout externí DNA.
Takto připravené buňky lze použít buď bezprostředně, nebo se převedou do roztoku CaCl2 s
přídavkem glycerolu, v němž je možné buňky zamrazit na -70°C a použít později (takto připravené buňky lze uchovávat několik měsíců nebo i déle).
Organismy: Bakteriální kmen E. coli ToplOF, E. coli BL21 (DE3)
Materiál: LB bujón, sterilní roztok 0,05 M CaCl2 sterilní centrifugační zkumavky, denzitometr s příslušenstvím, chlazená centrifuga T23
Postup
1. 50 ml LB bujónu v Erlenmayerově baňce naočkujeme 2 ml bujónové kultury (18 hod/37°C) a inkubujeme při 37°C na třepačce do hustoty suspenze OD6qo = 0,3. (Kultivace cca 2 hod.)
2. Buněčnou kulturu vytemperujeme na 0°C v ledové vodní lázni a centrifugu)eme 10 min/3000 rpm při 4°C. Od této chvíle nesmi teplota překročit 4°C!
3. Sediment buněk resuspendujeme v polovině objemu (25 ml) ledového roztoku CaCl2 a ponecháme v lednici při 4°C přes noc.
4. Buňky centrifugu)eme jako v bodě 2) a sediment resuspendujeme v 5 ml (obecně v 1/10 výchozího objemu kultury) roztoku CaCl2.
5. Takto připravené kompetentní buňky lze používat přibližně jeden týden. Pro dlouhodobé uchovávání se k buněčné suspenzi přidá 1/10 objemu sterilního glycerolu (4°C!) a suspenze se zmrazí na -70°C.
2. Příprava plazmidového vektoru pET28 ke klonování
Jedním z běžně používaných expresních vektorů pro klonování v E. coli je bakteriální plazmidový vektor pET28 (viz obr.) jeho velikost je 5369 bp. Gen pro rezistenci ke kanamycinu je využíván pro selekci transformant.
Jako hostitelské kmeny pro tento plazmidový vektor jsou používány kmeny E. coli. Pro klonovací experimenty je nutné použít kmenů, které jsou schopny alfa-komplementace (tj. nesoucí mutaci lacZM\5), např. E. coli ToplOF, DH5a, JM83, JMI01, NM522 aj.
K izolaci DNA vektoru je možné použít několika metod, poskytujících DNA o různém množství a čistotě. Optimální je připravit DNA purifikovanou přes kolonku (spin columns) s využitím některého komerčního kitu. Je možné však vycházet i z preparátů, připravených některou z mikrometod, při nichž se získá DNA v množství několika ug s dobrou citlivostí ke štěpení restrikčními endonukleázami a účinně spojovaná ligázou.
Naštěpení vektoru reštrikční endonukleázou
Materiál: Eppendorfovy zkumavky, mikrocentrifuga, automatické pipety, špičky, zařízení pro elektroforézu, transiluminátor, reštrikční endonukleázy, štěpící pufry, sterilní deštil, voda, TE pufr, 70% a 100% etanol, QiaQuick PCR Punfication Kit, punfikovaná DNA vektoru pET28 reštrikční endonukleázy Ncol a BamHl.
Nejdříve stanovíme orientačně koncentraci vektoru: 2 ul roztoku DNA změříme na Nanodropu.
Koncentrace izolovaného vektoru:
6 ug DNA vektoru pET28 naštěpíme v objemu 40 ul reakční směsi příslušnou dvojicí RE (2 hod), abychom zabránili znovuspojení přečnívajících konců. Postupujeme dle návodu k restriktázám. Pokud jsou koncentrace nízké, vynechá se objem vody.
Ponecháme si alespoň 10 ul neštěpeného vektoru jako kontrolu
Reagencie	Množství (ul)
Voda	
Pufr	
Vektor	
Enzym	
celkem	40 ul (objem restriktáz zanedbáváme)
Defosforylace
1. Defosforylace je nutná při přípravě inzertní DNA restrikčním štěpením použitím jednoho enzymu, ale také zabraňuje spojení nedoštěpených plazmidů
2. K přečištěné plazmidové DNA přidat 1/10 objemu lOx OP pufru, alkalickou fosfatázu (1U na 100 pmol (2(ig linearizované plazmidové DNA o velikosti 5 kb obsahuje asi 1,4 pmol 5'koncových fosfátů)
3. Inkubace 30 min/37 °C
4. Směs po štěpení a defosforylaci uložíme při - 20 °C
5. Směs naneseme na 1,2 % preparativní agarózový gel a štěpenou defosforylovanou DNA extrahujeme z gelu prostřednictvím komerční sady QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Velikost plazmidu je 5369 bp.
Koncentrace štěpeného vektoru:
3. Příprava inzertu
Jako cizorodou DNA lze pro klonování v pET vektorech použít DNA z jakéhokoliv organismu za předpokladu, že je tato DNA nativní a lze ji štěpit některou z restrikčních endonukleáz, jejíž štěpné místo se nachází v polylinkeru (velikost restrikčních fragmentů, které lze nakloňovat, je max. asi 10 kbp). DNA, která není žádnou z těchto RE štěpena, by bylo nutné nejdříve upravit tak, aby její konce byly s některou z RE kompatibilní - např. připojením spojek, adaptoru nebo modifikací konců prostřednictvím PCR.
K nakloňování lze použít DNA, která byla štěpena buď jednou RE, nebo dvěma různými RE - v tomto případě dojde k tzv. orientovanému začlenění restrikčního fragmentu do vektoru, což má řadu výhod, např. umožňuje reštrikční mapování a sekvencování z definovaného konce. Použití DNA štěpené dvěma enzymy zabraňuje její cirkularizaci a zvyšuje pravděpodobnost vzniku rekombinantních plazmidů při ligaci vektorové a cizorodé DNA.
Materiál: DNA z polyvalentního stafylokokového fága 812 Fl.
- reštrikční endonukleázy Ncol a BarriHL, štěpící pufry 10x konc, deštil, voda
- primer EndoFl NcoBam low nesoucí iVcoI-místo (5'- TAAGCCATGGCTAAGACTCAAGCAGAA-3') a primer SH3upB nesoucí SawíHI-místo (5'- ATAGGATCCTTGAATACTCCCCAGG
3'), o koncentraci 10 pmol/ul, 10x konc. roztok dNTP, Taq DNA-polymeráza a příslušný reakční pufr, 50 mM MgCh, - automatické pipety, špičky, mikrozkumavky, mikrocentrifuga, spektrofotometr, termocykler - zařízení pro elektroforézu a vyhodnocování gelů
Postup
1. Provedeme amplifikaci genu s primery, jejichž konce nesou rozpoznávací sekvence pro reštrikční endonukleázy Ncol a BamHl.
Reakční směs:
Reagencie	Objem v ul do 25 ul	Do ul
Deionizovaná voda	15,2	
Pufr pro PCR	2,5	
MgCl2	2,5	
dNTP	2,5	
Primery	2 x 0,05	
Taq DNA polymeráza	0,2	
Templátová DNA	2	
Program:
	Teplota (°C)	—v Cas (s)	Počet cyklů
Počáteční denaturace	94	300	1
Denaturace	94	60	29
Připojení příměrů	50	90	29
Prodlužování příměrů	72	90	29
Závěrečné prodlužování příměrů	72	600	1
2. Provedeme purifikaci PCR-produktu (viz protokol QIAquick PCR Purification Kit) a výsledný vzorek ověříme na agarózové gelové elektroforéze, současně změříme koncentraci DNA.
Koncentrace PCR produktu po přečištění:__
3. Provedeme štěpení purifikováného amplikonu restrikčními endonukleázami Ncol a fíamHl:
V Eppendorf. zkumavce smícháme:
- 1-2 pLg DNA (x nl roztoku DNA)
- doplnit ul H2O. Pokud jsou koncentrace nízké, vynechá se objem vody.
- 5 |j,l lOx konc. štěpícího pufru
- 5 jednotek restriktáz (asi 1 ul).
Obsah zkumavky dobře promícháme a krátce zcentrifugujeme v mikrofuze. Inkubujeme 2 hod při teplotě doporučené pro příslušné restriktázy (případně přes noc).
Reagencie:	Množství (ul)
DNA	
Voda	
Pufr	
Enzym	
Celkem	50 (objem enzymu zanedbáváme)
4. Zkumavku zahřejeme 5 minut na 56°C a necháme zchladit na pokojovou teplotu
6. Rozštěpenou DNA uložíme při -20°C
7. Provedeme purifikaci PCR-produktu (viz protokol QIAquick PCR Purification Kit) a změříme koncentraci štěpeného vektoru.
4. Ligace:
Nejsnadněji se klonují DNA-restrikční fragmenty, získané štěpením DNA dvěma různými RE. Pokud se liguje DNA po štěpením jednou RE, je vhodné provést defosforylaci vektoru, která podstatně snižuje jeho recirkularizaci a zvyšuje výtěžek rekombinantních molekul. Pokud se defosforylace neprovede, je možné výtěžek rekombinantních molekul zvýšit nastavením optimálního poměru koncentrací vektorové a cizorodé DNA - tento poměr se mění v závislosti na velikosti vektoru a klonovaného restrikčního fragmentu. Výpočet pro přesné stanovení koncentrací obou DNA je uveden v řadě příruček. Prakticky lze vyjít z poměru koncentrací inzertrvektor 1:1, 3:1 a 5:1, kde je značná pravděpodobnost, že některá z těchto směsí obsahuje poměr blížící se optimálnímu. K ligaci se nejčastěji používá T4-DNA-ligáza (případně i DNA-
ligáza z E. coli, která však nespojuje tupé konce). V reakční směsi o celkovém objemu se kombinuje obvykle 100-500 ng vektorové DNA se 100-500 ng cizorodé DNA. Ligační pufr je dodáván výrobci jako lOx koncentrovaný roztok (jeho složkou je TRIS, DTT, BSA, ATP a Mg++). Vlastní ligační reakce má teplotní optimum při 37°C - při této teplotě jsou však konce nestabilní (s tendencí k denaturaci), proto se ligace obvykle provádí při teplotách 16-25°C, kdy je soudržnost konců vyšší.
Výsledek ligační reakce je možné demonstrovat elektroforeticky: po ligaci se vytvoří kromě rekombinantních plazmidových molekul rovněž vysokomolekulárni frakce DNA, kterou lze na gelu dobře rozpoznat: je důkazem, že enzym je aktivní. Materiál: DNA vektoru pET28 štěpená RE, cizorodá DNA štěpená RE, T4-DNA-ligáza, lOx ligační pufr, mikrozkumavky, aut. pipety, špičky, termostat na 16°C, mikrofuga
Koncentrace inzertu:	
Koncentrace plazmidu:	
Postup;
1. Připravíme ligační směsi obsahující různé poměry vektorové a cizorodé DNA (1:1, 3:1, 5:1, 1:3 a 1:5). Jako kontrolu použijeme štěpený plazmid, kdy objem inzertu nahradíme vodou. Každá směs má objem 10 ul a posléze se doplňuje pufrem do 20 ul:
- 100-500 ng vektorové DNA
- 100-500 ng cizorodé DNA
- deštil, sterilní vodu (ad 10 ul). (Případně dle návodu k ligáze)
ng vektoru, * kb inzertu inzert ng Inzertu =-* ■
kb vektoru
vektoi
Vektor: Inzert	Vektor ul	Inzert ul	H20
1:1			
1:3			
1:5			
1:0			
0:1			
2. Směs zahřejeme 5 minut na 45°C - dojde k rozvolnění kohezních konců. Zchladíme na 4°C.
3. Přidáme:
- 5 ul 2x Rapid ligation Buffer
- 1U T4-DNA-ligázy
Nebo dle návodu příslušné ligázy (Pufr může mít jinou koncentraci).
4. Po promíchání inkubujeme 15 minut (můžeme 30 - 45 min.) při pokojové teplotě.
5. Transformace kompetentních buněk E. coli rekombinantní DNA
1. Do mikrozkumavky se napipetuje 200 \A kompetentních buněk. (V případě, že se používají buňky zmrazené na -70°C, nechají se pozvolna rozmrznout při pokojové teplotě.)
2. Zkumavka se umístí do ledové lázně.
3. Přidá se DNA (5 \A ligační směsi smíchá s TE pufrem do celkového objemu 10 který se pak přidá ke kompetentním buňkám).
Přidáváme jednotlivě všechny ligační směsi (5 směsí), 10 ul TE pufru, 10 ul neštěpeného plazmidu ředěného TE pufrem, a celou procedurou necháme projít samotné kompetentní buňky.
4. Lehce se promíchá a ponechá v ledové lázni 30 minut.
5. Buňky se podrobí tepelnému šoku ponořením zkumavky na 1 min do vodné lázně 42°C,nebo 3 min/37°C.
6. Zkumavka se přenese do ledové lázně a přidá se 1 ml LB bujónu.
7. Následuje inkubace 1 hod při 37°C v třepacím termostatu.
8. Buňky se centrifugují 5 min při 1500 rpm (nebo 1 min při 6000 rpm).
9. Supernatant se slije - většinou však zůstane ve zkumavce asi 100 ul supernatantu, ve kterém lze buňky resuspendovat.
10. Suspenze se vyseje pomocí bakteriologické hokejky na agarové plotny (LB agar, obsahující Kanamycin (50 ug/ml)
Kanamycin
Zás. roztok 50 mg/ml (1000x) Výsl. koncentrace 50 ug/ml
6. Izolace DNA rekombinantních vektorů pEP28 (potenciálních klonů) metodou lyže varem (Holmes a Quigley, 1981).
Postup:
1. Bílé kolonie preočkujeme na misky LBA s kanamycinem, a ve formě dlouhých proužků.
2. Druhý den z nárůstu kultury na Petriho misce odebereme párátkem asi 1 -2 mm3 a resuspendujeme v 350 ul STET pufru v epp. zkumavce. Odběr kultury párátkem provedeme tak, abychom neodebrali i část agaru.
8. Transformace do expresních buněk
1. K 200 ul kompetentních buněk přidáme 50 ng plazmidu s inzertem, který byl purifikován pomocí komerčního kitu.
9. Test citlivosti k rekombinantnímu endolyzinu
Příprava suspenze usmrcených buněk S. aureus
300 ml YT média s přídavkem 0,3 g glukózy a 1,5 mg thiaminchloridu naočkujeme 10 ml 18-ti hodinové kultury indikátorového kmene S. aureus a kultivujeme 12 hodin při 37 °C za intenzivního třepání. Buňky usmrtíme autoklávováním horkou parou 5 min. při 100 °C. Usmrcené buňky centrifugu)eme 10 min při 5000 rpm a roztřepeme v 6 ml SM pufru (obecně 1/50 původního objemu). Suspenzi zamrazíme na -20 °C.
9.1. Ověření funkce endolyzinu funkčním testem na plotnách
1. Narostlé kolonie po transformaci buněk BL21(DE3) přerazítkujeme nebo preočkujeme v formě krátkých čárek na plotny s LB agarem s obsahem kanamycinu (50 (ig/ml) a IPTG (1 mM) nezbytného pro indukci T7 RNA-polymerázy.
2. Repliky ploten inkubujeme 6 až 18 hodin při teplotě 37 °C.
3. Buněčnou stěnu a membránu E. coli rozrušíme chloroformem, pracujeme v digestoři. Po nalití chloroformu na kousek buničité vaty položíme vatu na skleněnou podložku a přiklopíme miskou dnem vzhůru (plastová miska nebo agar se nesmí dotýkat buničité vaty). Páry chloroformu necháme působit 15 až 20 min. Po této době by se měl z rozrušených buněk E. coli uvolnit exprimovaný endolyzin.
4. Kolonie (čárky) přelijeme 3 ml 0,4 % měkkého vodního agaru s 200 - 250 \A suspenze autoklávováním usmrcených buněk S. aureus. Vodní agar by neměl být příliš zakalený buňkami, aby byly lytické zóny rozpoznatelné.
5. Endolyzin se ponechá difundovat a působit 60 - 120 min při 30 °C. Po této inkubaci byly kolem pozitivních klonů E. coli patrné projasněné lytické zóny.
9.2. Zymogram:
Příprava vzorku:
1. Buňky se zaočkují do 20 ml tekutého LB bujónu s kanamycinem (50 (ig/ml) a nechají se růst do OD6oo=0,5
2. Do média se přidá IPTG do finální koncentrace 0,4 mM
3. Po 3 - 4 hodinové expresi se buňky stočí (4000 otáček/lOmin) a resuspendují se v 0,8 ml SM pufru
4. Buňky se sonikují na ledu 30 minut (Medium level 1 min. sonikace, 2 minuty pauza).
5. Po sonikaci se buňky stočí (4000 otáček/lOmin) a oddělí se supernatant od peletu. Supernatant i rozpuštěný pelet se použije na přípravu vorku pro SDS PAGE.
Zymogram
1. Připravíme gel pro SDS PAGE (viz. tabulky). Mezi skla aparatury nejdříve nalijeme separační 15% gel a po jeho utuhnutí nalijeme 5% zaostřovací gel.
2. Paralelně připravíme gel bez přídavku buněčných stěn
3. Pro nanesení vzorků použijeme 4x koncentrovaný SDS nanášecí pufr (může být i 5x nebo 6x koncentrovaný), (200 mM Tns-Cl pH 6,8, 400 mM DTT, 8% SDS, 0,4% Bromfenolová modř, 35% glycerol). Připravíme 40 ul vzorku, necháme 10 minut zahřát na 95 °C. Vzorek naneseme na gel.
4. Pro elektroforézu se použije Tris-glycinový elektroforetický pufr (25 mM Tris-Cl pH 8,3, 192 mM glycin, 0,1% SDS) při proudu 25 mA.
5. Gely po elektroforéze propláchneme po 10 deseti minutách 3x v destilované vodě.
6. Gel bez přidání buněčných stěn obarvíme a gel s buněčnými stěnami zalijeme renaturačním pufrem (100 mM Tris pH 7,5; Triton X-100 - 0,1%)
Složení 15% separačního gelu pro zymogram
Reagencie	Množství	Složení
H20	2 ml	
Resolving buffer 4x	2,3 ml	36,3g Tris.CI; 200 ml H20; pH 8,8 (upraveno HCI)
Akrylamid 30%	4,5 ml	100 ml H20; 29,2 g akrylamid; 0,8 g N,N-metylenbisakrylamid
SDS 10%	90 ul	Dodecylsulfát sodný
APS 10%	90 ul	Persulfát amonný
Buňky S. aureus	100 ul	Buňky S. aureus SA812 usmrcené autoklávováním
TEMED	7 ul	N,N,N,N -tetramethylendiamin
Složení 5% zao^trovaciho gelu pro zymogram
Reagencie	Množství	Složení
H20	2 m	
Stacking buffer 4x	1 ml	3g Tris.CI; 50 ml H20; pH 6,3 (upraveno HCI)
Akrylamid 30%	540 ul	100 ml H20; 29.2 g akrylamid: 0,8 g N.N-metylenbisakrylannid
SDS 10%	40 ul	Dodecylsulfát sodný
APS 10%	60 ul	Persulfát amonný
TEMED	5 ul	N.N,N,N -tetramethylendiamin
Složka buněčných stěn může být variabilní 100 - 200 ul Tabulky na složení více gelů jsou k dispozici v laboratoři.
Schéma postupu:
1. Příprava inzertu
PCR, ověření na gelu, přečištění
2. Příprava vektoru
Izolace vektoru, stanovení koncentrace
Štěpení inzertu, přečištění, stanovení koncentrace
3. Příprava kompetentních buňek
Štěpení vektoru,
defosforylace, vyřezání
z gelu, stanovení koncentrace
Ligace inzert + vektor
Izolace plazmidu
s potvrzeným inzertem
Transformace do buněk E. coli BL21 (DE3)
E. coli BL21 (DE3) E. coli Topi OF zamrazit -80 °C
Transformace do buněk E. coli Top 1 OF
Ověření začlenění izertu izolace lyží varem a elektroforéza (nebo PCR)
exprese v tekutém médiu, SDS PAGE, Zymogram
Funkční test na miskách
nalití SDS gelů, zymogramů a příprava buněčných stěn