LIGÁCIA VEKTOROVEJ DNA S INZERTOM
Vektorová DNA:
12,5 ng DNA na 1000 bp vektoru [pJOEd (7500bp) = 93,75 ng, pCU510 (5500bp)= 68,75 ng] DNA inzertu:
Molárny pomer (na základe počtu bp) vektoru k inzertu 1:1 až 1:6 (závisí experimentálne)
Inzert oligo = 24 bp (0,6-1,8 ng/reakcia)
Inzert Cas = 4180 bp (53 -106 ng/reakcia)
Ligation buffer: 2 ul
Ligáza: 0,335 ul (400U/ul)
Doplniť H20 do 20 ul
Premiešame, necháme inkubovať pri pokojovej teplote 1-1,5 hodiny. Inaktivujeme zahriatím 65 °C/10 min. Pozor - ligation buffer obsahuje BSA, skontrolovať či sa úplne rozpustil. Ak nie, zahriať v ruke alebo pri 50 °C a premiešať do rozpustenia.
Pri blunt-end ligácii pridávame 0,7-1 ul ligázy (400 U/ul), ligujeme pri 16 "C cez noc (pri pokojovke min 2 hodiny).
TRANSFORMÁCIA E. COLI HEAT-SHOCKOM
1. Kompetentné bunky necháme rozmrznúť na ľade
2. 5 ul ligačnej zmesi premiešame s 5 ul TE pufru (pH = 8.0) a pridáme ku kompetentným bunkám.
3. Premiešame poklepáním po spodku epinky, nemiešame špičkami a určite nevortexujeme!
4. Necháme 30 min na ľade.
5. Epiny dáme do plaváku, umiestnime do 42°C horúcej vodnej lázně na 1 min.
6. Schladíme 2 min na ľade.
7. Pridáme 1 ml LB/kompetentné bunky a premiešame v ruke.
8. Inkubujeme 1 hod/37 °C a 390 rpm.
9. Stočíme 6000g/4min
10. Odlejeme supernatant - na spodu ostane vplyvom povrchovej energie kvapka - asi 100 ul -v nej pelet rozsuspendujeme pipetou.
11. Vysejeme na selekčné misky rozhokejkovaním.
12. Druhý deň pozorujeme jednotlivé kolónie transformantov, pár ich vyberieme a prečiarkujeme na nové selekčné misky.
Kontroly:
pozitívna - ľubovoľný prázdny plazmid, kontrolujeme či funguej transformačný protokol plus kompetentné bunky
Negatívna - ligačná zmes s vektorom, bez inzertu. Uvidíem pozadie spôsobené samozligovaným vektorom plus nenaštiepeným vektorom.
Kontrola ligácie - ligačná zmes s vektorom, naštiepeným len jednou reštrikčnou endonukleázou. Takýto vektor by mal ebz problému ligovať a následne transformovať sa do buniek. Ak nerastú kolónie, nedochádza k ligácii.