Eduard Kejnovský + Roman Hobza EVOLUČNÍ GENOMIKA: V. DYNAMIKA GENOMŮ 1. Retroelementy a retrotranspozice 2. Základní typy retroelementů 3. DNA transposony 4. Chromosomální distribuce transposonů 5. Funkce transposonů 6. Transposony užitečné pro hostitele: Domestikace TE 7. Explosivní amplifikace transposonů v evoluci savců 8. Tandemové repetice 9. Promiskuitní DNA •OSNOVA Podstatnou část genomů tvoří opakující se úseky DNA (repetice) •lidský genom •Většinu našeho genomu tvoří mobilní elementy •Geny (exony) – 1.5% •45-70% lidského genomu tvoří mobilní elementy •Téměř polovinu lidského genomu tvoří mobilní elementy!!! •20 až > 1 500 000 kopií •Eukaryotické genomy: geny plovoucí po moři retrotransposonů •Endogenní retroviry – otisky dávných infekcí primátů •Genom jako ekosystém elementů •Koevoluce transposonů a hostitele •pravidlo„3C“ : conflict à compromise à cooperation •Interakce TE: parasitismus, kompetice, kooperace •Chromosomální niky kolonizované transposony: •Selekce nebo cílené včleňování? RETROELEMENTY A RETROTRANSPOZICE Co jsou retroelementy? •Retroelementy = sekvence DNA nebo RNA obsahující gen pro enzym reverzní transkriptázu (katalyzuje přepis RNA do DNA). • Širší definice zahrnuje veškeré sekvence vzniklé reverzní transkripcí RNA do DNA. • Po genomech se šíří procesem retropozice. • •Retropozice = přesun genetického materiálu z jednoho místa v genomu do místa jiného prostřednictvím RNA intermediátu. Má vždy duplikativní charakter. •Jsou retroelementy relikty světa RNA? •Podporuje to jejich struktura, konzervativní mechanismus replikace a všudypřítomnost. Životní cyklus LTR retrotransposonů • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •GAG •RT •IN •PR • • •mRNA •přepis •překlad • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •sestavení částice a zpětný přepis •RT •PR •IN •GAG •cDNA •integrace •chromosomy •jádro •cytoplazma •bílkoviny •částice podobná virům •HGT •15/27 • Reverzní transkripce •- nasednutí primeru tRNA a extenze •- odstranění RNA oblasti R a U5 •- první přeskok a extenze •- odstranění většiny RNA RNázouH •- zbyde primer a extenze •- odstranění zbytku virové RNA a tRNA •- druhý přeskok a dosyntetizování • • • •U3 •U5 •R • • • •U3 •U5 •R • • •U5 •R • • •U3 •R •LTR •LTR ZÁKLADNÍ TYPY RETROELEMENTŮ •U3 ... jedinečná sekvence na 3‘ konci •R ..... repetitivní sekvence •U5 ... jedinečná sekvence na 5‘ konci • • • • • • • • •LTR •gag •LTR •pol •env •PR RT RNázaH INT •PBS •PPT •> •> • • • •U3 •U5 •R •krátká •obrácená •repetice •krátká obrácená • repetice •zesilovače •transkripce •promotor •polyadenylační signál •LTR: •gag, pol, env ....... geny •LTR ... dlouhé koncové repetice •PBS .... místo vazby primeru •PR ...... proteáza •INT .... integráza •RT ...... reverzní transkriptáza •PPT ..... polypurinový úsek •> ......... přímé repetice Retroviry - obecné schéma •gag, pol, env ....... geny •LTR ... dlouhé koncové repetice •PBS .... místo vazby primeru •PR ...... doména kódující proteázu •INT .... doména kódující integrázu •RT ...... doména kódující reverzní transkriptázu •PPT ..... polypurinový úsek •> ......... přímé repetice • • • • • • • •LTR •gag •LTR •pol •PR INT RT RNázaH •PBS •PPT •> •> •(b) Typ Ty1-copia: • • • • • • • • •LTR •gag •LTR •pol •env? •PR RT RNázaH INT •PBS •PPT •> •> •(a) Typ Ty3-gypsy: Retrotranspozony - obecné schéma •ORF1 ......... protein vážící RNA •EN .............. doména kódující endonukleázu •RT .............. doména kódující reverzní transkriptázu •5‘UTR ........ netranslatovaná oblast na 5‘ konci •3‘UTR ........ netranslatovaná oblast na 3‘ konci •poly(A) ....... polyadeninový úsek •> ................. přímé repetice • • • • • •ORF1 •EN RT •5’UTR •3‘UTR •> •> •poly(A) •(a) LINE (L1): •(b) SINE (sekvence Alu): • • • •levý monomer •> •poly(A) • •poly(A) •pravý monomer •> •ORF2 •1 kb •100 bp Retropozony (polyA, nonLTR retroelementy) Včleňování LINE elementů •TPRT (target-primed RT) •Twin priming: •mechanizmus tvorby inverzí •Template switch Alu elementy – nejhojnější retroelementy lidského genomu - odvozeny z 7SL RNA genu kódujícího podjednotku signální rozpoznávací částice (přenos proteinů přes membrány a začleňování do membrán) - - Alu inzerce – u každého 200 narozeného jedince - - transkripce z promotorů RNApolIII (uvnitř oblasti) - - reverzní transkripce zajišťována RT poskytovanou LINE elementy - - genová konverze • •msDNA (=multicopy single-stranded) - intermediáty extrachromosomálního replikačního cyklu nebo abortivní produkty intermediátů •msr •msd • • • • •RT • •msDNA: •retron: Retrony - primitivní retroelementy bakterií •msr ... gen kódující RNA složku •msd ... gen kódující DNA složku •RT ..... gen pro reverzní transkriptázu •Prokaryotické retroelementy: •1. Kódují jediný RT protein s jedinou enzymatickou aktivitou (doménu). •Ostatní aktivity (proteáza, integráza, endonukleáza) retroelementy v průběhu evoluce získaly od hostitele (jako onkogeny retrovirů) • •2. RT prokaryot provádí syntézu nezávislou na primeru podobně jako RNA polymeráza (předchůdce RT) • •3. Prokaryotické RT jsou podobné RdRP (RNA-directed RNA polymerase), RT eukaryotických retroelementů jsou méně příbuzné • • RT • • • •LTR • •INT • •Retropozony •Retrotranspozony • Ty1-copia •Retrotranspozony • Ty3-gypsy •Retroviry • •gen pro •RNA replikázu • •gag • • • • • • • • • • •env • RT •gag + INT • •Caulimoviry • •Hepadnaviry •RNA •virus • • •Retrony • Introny •II. skupiny • •Mitochondriální • plazmidy •bakteriální • genom •intron •mitochond. • plazmid •? • RT • RT • •RNA •virus • • • • • • • • • • RT •Schéma evoluce retroelementů •první větev •druhá větev Paraziti parazitů: Neautonomní elementy tvoří většinu. Balancovaná rovnováha •Vybalancovaná rovnováha mezi autonomními (A) a neautonomními (N) elementy: •- přílišná úspěšnost neautonomních vede k záhubě •- titrace transpozázy neautonomními vede k omezením aktivity •- inhibice nadprodukcí •- koevoluce A a N řízena kompeticí o RT •- koevoluce endogenních a exogenních retrovirů – rezistence k infekci •- další mechanizmy restrikce: metylace a heterochromatinizace DNA TRANSPOSONY DNA transposony •1. Prokaryotické: •- IS elementy •- Tn elementy •2. Eukaryotické: •- Ac a Ds elementy – autonomní a neautonomní u kukuřice •- P elementy – hybridní dysgeneze u drozofily (samci P+ a samice P-) •- Tc1/mariner – u C. elegans (Tc1) a drozofily (Mariner) Helitrony – nedávno objevené transposony využívající mechanismus otáčející se kružnice •- replikace mechanizmem otáčivé kružnice (jako plazmidy, ss fágy, geminiviry) - výskyt u eukaryot - 2% genomu A.thaliana, C. elegans, také v Oryza sativa - nedělají duplikaci cílové sekvence (TSD) - cílená inzerce do AT dinukleotidu - začínají 3’-AT a končí CTRR-5’, nemají TIR - konzervace palindromu před 3’CTRR (sekvence není konzervativní) - většina elementů je neautonomní (0.5-3kb), vzácné dlouhé Helitrony (5.5-15kb) - kódující proteiny pro RC replikaci: helikázu (HEL), nukleázu/ligázu a proteiny vážící jednořetězcovou DNA (RPA) - mechanizmus tvorby neautonomních elementů nejasný - Helitrony jako evoluční spojovním mezi prokaryotickými RC elementy a geminiviry (potomci geminivirů intergrovaných do genomů časných eukaryot) • rostlinné ekvivalenty lidských Alu, délka: 125 - 500bp • neautonomní elementy (master = DNA TE Mariner) • obrácené koncové repetice (TIR) - konzervativní 10-15 bp • AT-bohaté (~72% Stowaway) • tvoří sekundární struktury DNA (hairpins) • preference cílového místa - TA(A) • asociace s geny – v intronech, poblíž 5‘ nebo 3‘ konců genů MITE elementy •rodiny: •- Stowaway (jednoděložné, dvouděložné, živočichové) •- Tourist (trávy) •- Emigrant, Alien, Heartbreaker, Bigfoot, … (rostliny) CHROMOSOMÁLNÍ DISTRIBUCE TRANSPOSONŮ •- výskyt na všech chromozomech (hybridizace in situ) •- místa s vyšší koncentrací retroelementů i bez retroelementů •- retroelementy v heterochromatinu i euchromatinu, hřbitovy RE •- sex chromozomy - akumulace na chromozomu Y: • u D. miranda, Cannabis sativa, Marchantia polymorpha, Silene latifolia •Chromozomální distribuce retroelementů • •S. latifolia •X •Y •S. latifolia •Marchantia polymorpha •Y •Selekce nebo cílené včleňování? •Inzerční specificita a inzerce retroelementů do heterochromatinu •- inzerce není náhodná (retroviry) •- role INT – chromodomain/targeting domain (TD) •- interakce s proteiny chromatinu - inženýrství (nové specifity), genová terapie - „local hopping“ DNA TE •(Voytas lab) •integráza •heterochromatin •Inzerce retroelementů do již existujících retroelementů •Metoda „transposon display“ – detekce nových inzercí transposonů •- indukce transpozice stresem - štěpení genomické DNA - ligace adaptorů •- PCR okolní oblasti •- nové bandy FUNKCE TRANSPOSONŮ •Vliv TE na fenotyp •Nature 2006 •Tanaka 2008, Plant J •Xiao 2008, Science •Nature 1980 •Nature 1980 •Obranné mechanizmy hostitele: - Metylace DNA - RNA interference • •EXPERIMENT: Umlčování transposonů metylací a reaktivace jejich aktivity u mutanta se sníženou metylací DNA: •Aktivní retrotransposon Tto1 vnesen z tabáku do Arabidopsis • Zvýšení počtu kopií a následná metylace a umlčení • Vnesení Tto1 do ddm1 mutanta • Snížení metylace Tto1 a transkripční a transpoziční aktivita •Mechanizmy transposonu •minimalizující jejich vliv na hostitele: •- včleňování do heterochromatinu •- odstraňování elementů rekombinací •Negativní vliv transposonů na hostitele: •- vyplývá z povahy RE (sobecká a parazitická DNA) - choroby - mutabilita – stochastické ale regulované „mutageny“ •hypotézy: parazité x významný činitel v evoluci •Transposony: Parazité nebo pomocníci? •V průběhu evoluce dochází ke koadaptaci transposonů a hostitele •(Hirochika et al 2000 Plant Cell) •Barva hroznů vína je způsobena transposony - Gret1 retrotransposon v promotoru genu VvmybA1 (inzerce a excize) •This et al 2007, TAG •Barva myší a epigenetický stav transposonů •Slotkin 2007, NatRevGenet - IAP transposon v promotoru -> exprese Agouti -> žlutá myš - metylace IAP -> žádná exprese -> hnědá myš - mezistavy (epigenetický stav, PEV) •Whitelaw and Martin 2001, NatureGenet •Bhattacharyya et al 1990, Cell •Zvrásnění semen hrachu jsou způsobeno transposony •r (rugosus) lokus: •rr – zvrásněné semeno •RR, Rr – kulaté semeno •- Ac/Ds DNA transposon •Huang et al 2010, Cell •Transposony stojí v pozadí variability lidské populace Transposony a lidské nemoci •- využití v diagnostice a terapii •většina lidského genomu •je transkribována • • • •hypometylace Alu/LINE elementů •(TE+epigenetický kód) • • • •zvýšení „Aluomu/LINEomu“ •nádorových buňkách • • •inzerce do tumorsupresorových genů •+ rekombinační přestavby genomu • • •stárnutí a rakovina •- vazebné místo p53 je odvozené z TE •Kejnovský •Vesmír 2013/4 Aktivace transposonů stresem je běžná u rostlin •Sucho, UV záření, poškození, kultivace in vitro, … •2 hypotézy proč stres aktivuje TEs •(oslabený hostitel x variabilita a adaptace) •TE + epigenetický kód •Stres • •aktivace TE • • rozkolísání genomu • • adaptace • •stres •aktivace TEs •dlouhodobá odezva •aktivace obranných genů •krátkodobá odezva •Umlčování transposonů: transkripční i posttranskripční (metylace a RNAi) •Transkripční umlčování – metylace promotorů TE •Posttranskripční umlčování – sekvenčně specifická degradace RNA v cytoplazmě •Vastenhouw 2004, TIG •Umlčování nespárované DNA během meiózy •Matzke and Birchler, Nature Rev Genet 2005 •Umlčování transposonů mechanizmem RNAi •- C. elegans a Drosophila nemají metylaci DNA •- Umlčování transposonů je zajišťováno pomocí RNAi •Ping-pong TRANSPOSONY UŽITEČNÉ PRO HOSTITELE DOMESTIKACE TRANSPOSONŮ •Recyklace transposonů „Turning junk into gold“ •Domestikace TE a jejich pozitivní vliv na hostitele: - telomery drozofily – Het-A, TART - centromery – CENP-B z DNA transposonů - imunitní systém – V(D)J rekombinace •- duplikace, rodiny, vznik nových genů (Setmar) •- reparace zlomů v DNA - inaktivace chromosomu X - úloha v regulačních sítích •Existuje mnoho příkladů domestikace transposonů •VDJ rekombinace • •Jaká DNA se akumuluje na Y? Zjistili jsme, že promiskuitní plastidová DNA •Dovolte odbočku: organely byly původně volně žijící bakterie, po endosymbioze (vznik eukaryotické b.) přenos genů do jádra •U člověka také akumulace mitochondriální DNA na Y •Role transposonů v regulačních sítích •Feschotte (2008) •Nat. Rev. Genet. 9, 397 •DNA-binding protein=TF odvozený z TE •Regulace transkripce •RNA-binding protein reguluje posttranskripčně •Regulace pomocí miRNA odvozených z TE •Transkripční faktory odvozené z TE: •CNE/UCE/enhancery •z TE (10 000) •Jaká DNA se akumuluje na Y? Zjistili jsme, že promiskuitní plastidová DNA •Dovolte odbočku: organely byly původně volně žijící bakterie, po endosymbioze (vznik eukaryotické b.) přenos genů do jádra •U člověka také akumulace mitochondriální DNA na Y • • • • • •ATC •CTAGT • • •HEL •RPA •16-20b •~11b •Journey of Helitrons (non-autonomous) through maize genome and capturing genes: •Helitrony putují po genomu a sbírají geny •Vliv transposonů na genom •Inzerční mutageneze •Chimerická mRNA •Antisense RNA •Rekombinační přestavby •Umlčení způsobené metylací •Bestor 2003, TIG LINE elementy – významný hráč v genomu člověka •- vliv na velikost genomu u primátů (struktura), nedávná aktivita, rozdíly i uvnitř druhů •- místa homologií pro genovou konverzi a rekombinaci (evoluce) •- včleňuje se do genu a narušují kódující sekvence, nemoci (funkce) •- exon shuffling, zkráceny na 5’ konci - nedosyntetizovány •- zacelují místa chromosomových zlomů (reparace) •Alternativní sestřih: - 40-60% lidských genů má alternativní sestřih - rozdíl mezi člověkem a myší: druhově-specifický alternativní sestřih - exony: konstitutivní (konzervativní) a alternativní (majoritní a minoritní) • •Vznik alternativních exonů: - duplikace exonů, mutace existující intronové sekvence, - z Alu elementů (5% lidských alternativních exonů) Alu elementy a alternativní sestřih •Alu elementy tvoří 10% lidského genomu (>1 milion) • 5% lidských alternativních exonů je odvozeno z Alu elementů •LINE hrají roli v šíření signálu při inaktivaci chromosomu X (Barr body) Původ genu SETMAR – „recyklace“ transposonu •Histon metyltransferáza + •transpozáza • •- zrušení stop •- vznik nového stop •- exonizace •- degenerace TIRu - vznik intronu - DNA vazebná doména Tn zachována - TIR místa v genomu • •Retrogen způsobil krátkonohost u psů •- chondrodysplasie (krátkonohost) • • • • • • •DNA • • • • • • •mRNA • • • • • • •gen fgf4 •retrogen fgf4 • • • • • • •hnRNA • •LINE •Science 325, 995 (2009) •jediná evoluční událost • • •změna fenotypu •EXPLOSIVNÍ AMPLIFIKACE TRANSPOSONŮ V EVOLUCI SAVCŮ •Explosivní amplifikace transposonů a speciace •3x více BARE TE na jižním svahu (ječmen) •Evoluční kaňon (Israel): •vačnatci •placentálové •Mezidruhová hybridizace aktivuje TEs •- „destrukce“ silencingu • • •Korelace mezi expanzemi transposonů a oddělováním větví savců •Alu a LINE-1 existují v našem genomu po dlouhou dobu •~80 MY •~150 MY • • •Korelace mezi expanzemi transposonů a oddělováním větví savců v časných dobách dominovaly LINE2 a MIR •útlum transpozice •v nedávné době •MGSC. Nature (2002) 420 520-562 •recentní útlum je zřetelný i u myši •Dynamika transposonů v evoluci myši •Srovnání stáří transpozonů v eukaryotických genomech Lidský genom je plný starých transposonů zatímco transposony v jiných genomech jsou mladší •staré •mladé •„Bez transposonů bychom zde nebyli a živý svět by pravděpodobně vypadal velmi odlišně.“ Susan Wessler •„Retrotransposony nemohou být zcela sobecké, protože hostitelský genom i vědci je využívají ke svému vlastnímu prospěchu.“ :-) • Jeffrey Bennetzen •Kejnovský •Vesmír 2009/9 •TANDEMOVÉ REPETICE •Tandemové repetice, •„knihovna“ satelitní DNA •Hlavní parametry: •- počet kopií (změna v B a D) •- sekvence DNA (změny C a D) •Evoluce tandemových repeticí •Evoluce v koncertu (concerted evolution) •Genová konverze •Nerovnoměrný crossing-over •Evoluce satelitních sekvencí – skládání ze segmentů •Genová konverze •- interchromosomální •- intrachromosomální •Genová konverze transposonů na pohlavních chromosomech •mikrodisekce •chromosomů Y a X LASER •PCR amplifikace TE na mikrodisektovaných chromosomech •Y-kopie •X-kopie •Satelity mohou vznikat i z retroelementů •gag • • • • • • • • •LTR •LTR • • •LTR •LTR •tandem •- NON-AUTONOMOUS • ELEMENT (3.7 kb) • • •pol • •env? •tandem •Retand element •(Silene latifolia) •Dasheng element •(Oryza sativa) •PROMISKUITNÍ DNA •“Promiscuous DNA” (Ellis, 1982) – cp DNA v mt genomu • •“Endosymbiotic gene transfer is ubiquitous… •… at frequencies that were previously unimaginable”. • • Nature Reviews Genetics, 2004 •(a) chloroplast • 20-200 kb • 20-200 proteinů • progenitor - cyanobacteria (Synechocystis) • 3.6 Mb • 3000 proteinů • •(b) mitochondrie • 6-400 kb • 3-67 proteinů • progenitor - alpha-proteobacteria (Mesorhizobium loti) • 7 Mb • 6 700 proteinů •Organelové genomy – pozůstatky prokaryot • • •~ 150 kb •~ 100 genů • •chloroplast •jádro •mitochondrie •? •? •~ 3000 kb •~ 3000 genů • •~ 4000 kb •~ 4000 genů •10-2000 kb* •~ 60 genů •sinice •proteobakterie •rostlinná buňka •Promiskuitní DNA •Endosymbioza a tok genů do jádra •Endosymbiotická evoluce a strom života •Velikosti organelových a prokaryotických genomů • • • Typický chloroplastový genom •velikost: ~ 150 kb •LSC (large single copy) – 80 kb •SSC (small single copy) – 20 kb •IR (inverted repeats) – 25 kb • • •118 genů: • 85 proteiny • photosystem I and II • cytochrome • ATP synthase • Rubisco • NADH dehydrogenase • ribosomal proteins • RNA polymerase • 29 tRNA • 4 rRNA •Endosymbiotický genový přenos: •- transport genů, reimport proteinů •Mechanizmy genového přenosu 1.Přenos velkých kusů DNA (“bulk DNA” hypothesis) • intergenové spacery, introns • experimenty u kvasinek • >100kb • •2. Přenos prostřednictvím cDNA (“cDNA intermediates”) • přenesená DNA je sestřižena a editována • rekombinace sestřižené mtDNA s nesestřiženou mtDNA • heterogenita velikostí mtDNA •Proč některé geny zůstávají v organelách? 1.Hydrophobicita • - hydrofóbní proteiny jsou těžko importovány do organel • 2.Řízení redoxního stavu • - organely řídí expresi genů, které kódují komponenty jejich elektronového transportu, jejich lokalizace je výhodnější v organelách • • •Zmenšení genomů u organel a parazitů: •Parazité: - specializace na intracelulární prostředí • - ztráta genů •Organely: - export genů do jádra hostitele • - import produktů •Nejdříve – regulační funkce • (sigma factor of RNApolymerase, gamma subunit • of ATPase) •Poslední – translace • - respirace •Některé geny se přenášejí do jádra dříve jiné později •Rubisco: •katalýza - v plastidu (rbcL) •regulace – v jádře (rbcS) •Kam se přenesená DNA integruje? - žádné důkazy preferovaných sekvencí či částí chromosomů - •Sekvenční proměnlivost promiskuitní DNA •>95% identity svědčí o velké obměně organelových sekvencí • •Faktory vedoucí k degeneraci sekvencí: - asexualita - poškozující zplodiny metabolismu - selekce na malé genomy - •Kompenzující faktory (u rostlin) - polyploidie - reparace DNA •Genový přenos z organel do jádra v reálném čase •EXPERIMENT: •- exprese/rezistence jen po přenosu do jádra • •Frekvence přenosu: •- v gametách – 1 : 16 000 •- v somatických buňkách – 1 : 5 million • • •Příčina rozdílu (300x): •- programovaná degenerace plastidů • při vývoji pylových zrn zvyšuje frekvenci přenosu