Hodnocení ekologických rizik 04 – Hodnocení účinků Mgr. Jana Vašíčková, Ph.D. vasickova@recetox.muni.cz Osnova Hodnocení účinků: • Obecné zákonitosti • Závislosti dávka - odpověď • Testy toxicity - vodní, sedimentové a akvatické testy • Hodnocení účinků - populace, ekosystémy Hodnocení účinků Fáze Analýzy rizik • Analýza je proces, který zkoumá dvě hlavní složky rizika, expozice a účinků a jejich vztahy mezi sebou navzájem • Cílem je poskytnout data nezbytné pro stanovení nebo předpovídání ekologické odezvy na stresory za podmínek expozice • Produktem fáze analýzy jsou souhrnné profily, které popisují expozici a vztah mezi stresorem a odpovědí. • Tyto profily tvoří základ pro odhad a popis rizika v charakterizaci rizik. • Průběh fáze analýzy: – Selekce dat, která budou použita na základě jejich užitečnosti pro vyhodnocení hypotéz – Analýza expozice - zkoumání zdroje stresorů, distribuci stresorů v životním prostředí a míru společného výskytu nebo kontakt – Analýza dopadu - zkoumání vztahu stresor-odpověď, důkazy kauzality a vztah mezi měřenými efekty a hodnocenými endpointy Expozice v ekotoxikologii a v EcoRA expozice v HHRA: C8580 Analýza rizik Dr. Pavel Čupr Chemikálie v prostředí Biodostupnost “Expozice” akutní chronická Toxikokinetika Biotransformace, bioaktivace, metabolismus, vylučování … Cílové místo “Efekt” Hladiny, osud, procesy Chemikálie v organismu biomonitoring Hodnocení účinků • Hodnocením účinků se rozumí posouzeni vlivu stresoru (a jeho různé míry působeni, různé doby a časovaní) na živy organismus - receptor. • Nezbytným zjištěním je jaký učinek má kontaminant na sledovaný receptor • Hodnocený biologický receptor = biologický systém, který bude využit jednak k identifikaci existujících nebo potenciálních účinků stresoru (fáze hodnoceni účinků) a na kterém bude dokumentovaná nebezpečnost stresoru pro hodnocené zájmové území a jeho ekosystémy (fáze formulace problému nebo hodnoceni účinků). • Před vlastním posuzovaným účinku je nutné definovat (ve fázi formulace problému EcoRA) organismy (receptory), pro které bude hodnoceni účinku provedeno. Základní kritéria pro výběr vhodných biologických receptorů • Výběr indikátorových systémů pro dany environmentální problém musí probíhat podle standardizovanych postupů a musi byt obhajitelny předevšim jako reprezentativni pro hodnocenou situaci. • Citlivost a způsob zastoupeni vybraných modelů musí při hodnoceni vylučovat falešně negativní výsledky, vybraná sada biologických receptorů musí vest k interpretacím závažným pro zájmové území a v něm zahrnuté ekosystémy. • Hodnoceným biologickým receptorem myslíme biologicky systém, který bude využit jednak k identifikaci existujicich nebo potencialnich učinků stresoru a na kterem bude dokumentovaná nebezpečnost stresoru pro hodnocené zájmové území a jeho ekosystémy. • Cilovym parametrem (endpointem) hodnoceni je miněn znak hodnoceneho biologickeho systemu, kteremu je podřizena metodika hodnoceni, a ktery je jednoznačně parametrizován. • Jeden typ modelového biologického receptoru může byt současně hodnocen vice cílovými parametry nebo tyto mohou byt členěny na primární a sekundární dle priority poskytované informace. Hodnocení účinků • Bude účinek téže dávky u daného druhu stejný organismu vždy stejný? • Liší se v citlivosti jednotlivé druhy mezi sebou? • Jaký vliv na účinek mají další ekologické faktory? • Typ účinku se liší jednak podle chemické látky, jednak podle sledovaného receptoru – Nutno vybrat vhodný receptor – účinek kontaminantu odpovídajícím způsobem charakterizovat a kvantifikovat • Hodnocení účinků kvantitativně spojuje koncentrace kontaminantů se škodlivými účinky v receptorech, dále podává informace o vztahu dávka odpověď. Vztahy Dávka - Odpověď Toxikant působí škodlivý efekt v biologickém systému - po vstupu do prostředí dosahuje látka určitých koncentrací v prostředí - toxický efekt je vyvolán dávkou v těle (působení koncentrace látky v těle po definovanou dobu – viz toxikodynamika) Toxikologie – práce s dávkami v těle mg/kg hmotnosti (mg/kg b.w. - body weight), mg/kg b.w./day Ekotoxikologie – spíše práce s koncentracemi v prostředí v prostředí měříme koncentrace ne dávky Vztahy Dávka - Odpověď Toxikant působí škodlivý efekt v biologickém systému Příklady efektů? • změna zdravotního stavu • pokles příjmu potravy • snížení reprodukční schopnosti • mortalita V experimentu se hodnotí POZOROVATELNÝ (měřitelný) PARAMETR = ENDPOINT • charakterizuje účinek a má k účinku jasný vztah • % přežívajících jedinců po působení dávky (efekt – mortalita) • počty vajíček po působení dávky (efekt - reprodukční toxicita) Endpoint může být „kvalitativní“ (nemusí být kvantifikovatelný): - př. iritace na kůži ANO/NE - kategorizace NEJHORŠÍ / LEPŠÍ / NEJLEPŠÍ Pro srovnání toxicity různých látek (vzorků) se užívají parametry odvozené z křivky dávka-odpověď 1) Parametry odvozené přímo z experimentálních dat LOEC/L Lowest Observable Effect Concentration/L - první nejnižší koncentrace použitá v experimentu, která vyvolala významné efekty NOEC/L No Observable Effect Concentration/Level - podobně: koncentrace použitá v experimentu … Nedostatky - subjektivní – závisí na zvolených koncentracích – jiný experiment  jiné výsledky (koncentrační rozmezí, ředicí faktor rozdíly mezi koncentracemi 2x, 5x, 10x…) Pro srovnání toxicity různých látek (vzorků) se užívají parametry odvozené z křivky dávka-odpověď 2) další parametry odvozené z křivky dávka – odpověď ECx (x=1,5,10,25,50,75,90,99 apod.) - ne vždy je v experimentu dosaženo „přesně 5% efektu“ - parametry se počítají (z „modelované křivky“) STANDARD - Hodnoty odvozené pro 50% efekt - nejčastěji užívány pro srovnání toxicity (!) - odhady v oblasti 50% efektů zatíženy nejmenší chybou Parametry LC50 – koncentrace (C) způsobující 50% letalitu (L) LD50 – dávka (Dose) způsobující 50% letalitu (L) EC50 – koncentrace způsobující 50% efekt (E) IC50 – koncentrace způsobující 50% inhibici (I) Metody hodnocení účinků Obecné metody hodnocení účinku • Tři obecné přístupy – Literární rešerše – Testování toxicity – Terénní studie Literární rešerše • Obrovské množství publikovaných a nepublikovaných informací o vztahu dávka-odpověď – Relativně rychlá a cenově dostupná cesta pro hodnocení existujících hladin kontaminantů a jejich potenciálních škodlivých účinků – Druhově specifické informace pro receptory z dané hodnocené oblasti jsou často nedostupné Testování toxicity • Může získat údaje o indikaci potenciálních účinků a vytvářet tak spojení mezi kontaminanty a v terénu pozorovanými škodlivými ekologickými účinky • Výběr testu by měl být založen na: – Typu habitatu – Zájmové složce prostředí • Voda, sediment, půda a složení (složení)(tvrdost, mechanické vlastnosti….) – Na základě definovaných receptorů (organismus, populace, společenstvo, ekosystém) – Hodnoceném endpointu (smrt organismu, snížení reprodukce, fekundity, počet jedinců) – Typu hodnoceného kontaminantu METODY HODNOCENÍ EFEKTŮ Praktické metody stanovení ekotoxicity - laboratorní biotesty in vitro - laboratorní biotesty in vivo - jednodruhové - laboratorní mikrokosmy - manipulované a kontrolované mezokosmy - polní studie - reálné ekosystémy Roste obtížnost průkazu KAUZALITY Cílem ekotoxikologických analýz je poznání efektů, které způsobuje přítomnost stresorů na organismy v prostředí - suborganismální úroveň laboratoř - jednotlivé organismy laboratoř - populační efekty laboratoř mikro/mezokosmy - efekty ve společenstvech mikro/mezokosmy polní studie terénní pozorování - ekosystémové efekty terénní pozorování ekologická reálnost, relevance obtížnost stanovení Hodnocení efektů v ekotoxikologii Testování toxicity • Laboratorní a terénní metody – Měří účinky u endpointů- přežití, růst, reprodukce – Může testovat individuální kontaminanty nebo složky prostředí obsahující směsi kontaminantů – Akutní a chronické testy – Akvatické, terestrické a mikrobiální testy – Endpoints zahrnují mortalitu, snížení reprodukce, snížení růstu, genetické poškození 1) Standardní biotesty 2) Alternativní biotesty 3) Další biotesty (specifické mechanismy, in vitro testy) 4) Testy procesů (biodegradabilita, bioakumulace ...) 5) Testy orgánové toxicity s laboratorními zvířaty obratlovci, savci "humánní toxikologie" 6) Experimentální mikro a mezokosmy 7) Polní studie Laboratorní ekotoxikologické biotesty In situ hodnocení efektů "Experimentální (zpravidla laboratorní) metody stanovení toxického působení stresorů (toxických látek) na přírodní organismy" Ekotoxikologické biotesty Ekotoxikologické biotesty – Nástroje pro hodnocení účinků: • nejběžnější, nejpoužívanější, nejvíce propracovaný systém – Standardní nástroje • Jednodruhové  jeden konkrétní kmen  standardní jedinci (uniformní věk, velikost apod.) • Zcela optimální podmínky – Potrava, teplota, pH, světlo – Bez dalšího biotického stresu (predátoři, infekce..) Hlavním požadavkem ekotoxikologické studie je průkaz KAUZALITY mezi expozicí (látkou) a efektem (= nejčastěji průkaz „jak se toxicita mění s dávkou“ – dávka/odpověď) • Jaké vlastnosti má mít „modelový“ organismus pro standardizovaný biotest ?  snadná dostupnost (laboratorní kultury, komerční dostupnost ...)  snadné uchování a chov v laboratorních podmínkách do dostatečných množství pro experimenty (rychlý reprodukční cyklus)  Známá biologie druhu a genetika příslušné kultury y  jsou prostudovány relativní citlivosti druhu / kultury k různým třídám toxických látek  citlivost druhu by měla být dobrým reprezentantem příslušné skupiny organismů  Daphnia  korýši / bezobratlí  Zebřička  kaprovité ryby / obratlovci Ekotoxikologické biotesty OECD guidelines http://www.oecd.org/document/40/0,3746,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html Test No. 201: Alga, Growth Inhibition Test 11 July 2006 Test No. 221: Lemna sp. Growth Inhabition Test 11 July 2006 Test No. 202: Daphnia sp. Acute Immobilisation Test 23 Nov 2004 Test No. 211: Daphnia magna Reproduction Test 16 Oct 2008 Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test 17 July 1992 Test No. 204: Fish, Prolonged Toxicity Test: 14-Day Study 04 Apr 1984 Test No. 210: Fish, Early-Life Stage Toxicity Test 17 July 1992 Test No. 212: Fish, Short-term Toxicity Test on Embryo and Sac-Fry Stages 21 Sep 1998 Test No. 215: Fish, Juvenile Growth Test 21 Jan 2000 Test No. 229: Fish Short Term Reproduction Assay 08 Sep 2009 Test No. 230: 21-day Fish Assay 08 Sep 2009 Test No. 231: Amphibian Metamorphosis Assay 08 Sep 2009 Aquatic organisms Test No. 218: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Sediment 23 Nov 2004 Test No. 219: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Water 23 Nov 2004 Test No. 233: Sediment-Water Chironomid Life-Cycle Toxicity Test Using Spiked Water or Spiked Sediment 23 July 2010 Test No. 225: Sediment-Water Lumbriculus Toxicity Test Using Spiked Sediment 15 Oct 2007 Sediment organisms Organization for Economic Cooperation Development Soil organisms Test No. 208: Terrestrial Plant Test: Seedling Emergence and Seedling Growth Test 17 Aug 2006 Test No. 227: Terrestrial Plant Test: Vegetative Vigour Test 17 Aug 2006 Test No. 207: Earthworm, Acute Toxicity Tests 04 Apr 1984 Test No. 220: Enchytraeid Reproduction Test 23 Nov 2004 Test No. 222: Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/Eisenia andrei) 23 Nov 2004 Test No. 228: Determination of Developmental Toxicity of a Test Chemical to Dipteran Dung Flies(Scathophaga stercoraria L. (Scathophagidae), Musca autumnalis De Geer (Muscidae)) 16 Oct 2008 Test No. 232: Collembolan Reproduction Test in Soil 08 Sep 2009 Test No. 226: Predatory mite (Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer) reproduction test in soil 16 Oct 2008 Test No. 216: Soil Microorganisms: Nitrogen Transformation Test 21 Jan 2000 Test No. 217: Soil Microorganisms: Carbon Transformation Test 21 Jan 2000 Test No. 213: Honeybees, Acute Oral Toxicity Test 21 Sep 1998 Test No. 214: Honeybees, Acute Contact Toxicity Test 21 Sep 1998 Test No. 205: Avian Dietary Toxicity Test 04 Apr 1984 Test No. 206: Avian Reproduction Test 04 Apr 1984 Test No. 223: Avian Acute Oral Toxicity Test 23 July 2010 Other tests OECD guidelines http://www.oecd.org/document/40/0,3746,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html Organization for Economic Cooperation Development ISO guidelines Aquatic microorganisms ISO 10712:1995 Water quality -- Pseudomonas putida growth inhibition test (Pseudomonas cell multiplication inhibition test) ISO 11348-1:2007 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 1: Method using freshly prepared bacteria ISO 11348-2:2007 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 2: Method using liquid-dried bacteria ISO 11348-3:2007 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 3: Method using freeze-dried bacteria ISO 13641-1:2003 Water quality -- Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria -- Part 1: General test ISO 13641-2:2003 Water quality -- Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria -- Part 2: Test for low biomass concentrations ISO 13829:2000 Water quality -- Determination of the genotoxicity of water and waste water using the umu-test ISO 16240:2005 Water quality -- Determination of the genotoxicity of water and waste water -- Salmonella/microsome test (Ames test) ISO/DIS 11350 Water quality -- Determination of the genotoxicity of water and waste water -- Salmonella/microsome fluctuation test (Ames fluctuation test) ISO 15522:1999 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water constituents on the growth of activated sludge microorganisms ISO 21338:2010 Water quality -- Kinetic determination of the inhibitory effects of sediment, other solids and coloured samples on the light emission of Vibrio fischeri (kinetic luminescent bacteria test) ISO 8192:2007 Water quality -- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation ISO 9509:2006 Water quality -- Toxicity test for assessing the inhibition of nitrification of activated sludge microorganisms International Standardization Organization ISO guidelines International Standardization Organization Aquatic plants ISO 20079:2005 Water quality -- Determination of the toxic effect of water constituents and waste water on duckweed (Lemna minor) -- Duckweed growth inhibition test ISO 8692:2004 Water quality -- Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green algae ISO/CD 16191 Water quality - Determination of the toxic effect of sediment and soil on the growth behaviour of Myriophyllum aquaticum Myriophyllum test ISO 10253:2006 Water quality -- Marine algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum ISO 10710:2010 Water quality -- Growth inhibition test with the marine and brackish water macroalga Ceramium tenuicorne ISO 14442:2006 Water quality -- Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waste water ISO/DIS 13308 Water quality -- Toxicity test based on reproduction inhibition of the green macroalga Ulva pertusa ISO/TR 11044:2008 Water quality -- Scientific and technical aspects of batch algae growth inhibition tests ISO guidelines International Standardization Organization ISO guidelines International Standardization Organization ISO guidelines Aquatic invertebrates ISO 6341:1996 Water quality -- Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) -- Acute toxicity test ISO 10706:2000 Water quality -- Determination of long term toxicity of substances to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) ISO/DIS 14380 Water quality -- Determination of the acute toxicity to Thamnocephalus platyurus (Crustacea, Anostraca) ISO/CD 16303 Water quality -- Determination of toxicity of fresh water sediments using Hyalella azteca ISO 10872:2010 Water quality -- Determination of the toxic effect of sediment and soil samples on growth, fertility and reproduction of Caenorhabditis elegans (Nematoda) ISO 16712:2005 Water quality -- Determination of acute toxicity of marine or estuarine sediment to amphipods ISO 20665:2008 Water quality -- Determination of chronic toxicity to Ceriodaphnia dubia ISO 20666:2008 Water quality -- Determination of the chronic toxicity to Brachionus calyciflorus in 48 h ISO 14669:1999 Water quality -- Determination of acute lethal toxicity to marine copepods (Copepoda, Crustacea) ISO/DIS 14371 Water quality -- Determination of freshwater-sediment subchronic toxicity to Heterocypris incongruens (Crustacea, Ostracoda) ISO 7828:1985 Water quality -- Methods of biological sampling -- Guidance on handnet sampling of aquatic benthic macro-invertebrates ISO 8265:1988 Water quality -- Design and use of quantitative samplers for benthic macro-invertebrates on stony substrata in shallow freshwaters ISO 8689-1:2000 Water quality -- Biological classification of rivers -- Part 1: Guidance on the interpretation of biological quality data from surveys of benthic macroinvertebrates ISO 8689-2:2000 Water quality -- Biological classification of rivers -- Part 2: Guidance on the presentation of biological quality data from surveys of benthic macroinvertebrates ISO/DIS 10870 Water quality -- Guidelines for the selection of sampling methods and devices for benthic macroinvertebrates in fresh waters ISO/WD 16778 Water quality -- Calanoid copepod development test with Acartia tonsa ISO guidelines International Standardization Organization ISO guidelines Aquatic vertebrates ISO 15088:2007 Water quality -- Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs (Danio rerio) ISO 7346-1:1996 Water quality -- Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio HamiltonBuchanan (Teleostei, Cyprinidae)] -- Part 1: Static method ISO 7346-2:1996 Water quality -- Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio HamiltonBuchanan (Teleostei, Cyprinidae)] -- Part 2: Semi-static method ISO 7346-3:1996 Water quality -- Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio HamiltonBuchanan (Teleostei, Cyprinidae)] -- Part 3: Flow-through method ISO 10229:1994 Water quality -- Determination of the prolonged toxicity of substances to freshwater fish -- Method for evaluating the effects of substances on the growth rate of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum (Teleostei, Salmonidae)) ISO 12890:1999 Water quality -- Determination of toxicity to embryos and larvae of freshwater fish -- Semi-static method ISO 21427-1:2006 Water quality -- Evaluation of genotoxicity by measurement of the induction of micronuclei -- Part 1: Evaluation of genotoxicity using amphibian larvae ISO 21427-2:2006 Water quality -- Evaluation of genotoxicity by measurement of the induction of micronuclei -- Part 2: Mixed population method using the cell line V79 ISO 23893-1:2007 Water quality -- Biochemical and physiological measurements on fish -- Part 1: Sampling of fish, handling and preservation of samples ISO/TS 23893-2:2007 Water quality -- Biochemical and physiological measurements on fish -- Part 2: Determination of ethoxyresorufin-Odeethylase (EROD) ISO/CD 23893-3 Water quality -- Biochemical and physiological measurements on fish -- Part 3: Determination of vitellogenin ISO guidelines International Standardization Organization ISO guidelines Soil microorganisms ISO 10381-6:2009 Soil quality -- Sampling -- Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory ISO 14240-1:1997 Soil quality -- Determination of soil microbial biomass -- Part 1: Substrate-induced respiration method ISO 14240-2:1997 Soil quality -- Determination of soil microbial biomass -- Part 2: Fumigation-extraction method ISO 16072:2002 Soil quality -- Laboratory methods for determination of microbial soil respiration ISO 17155:2002 Soil quality -- Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves ISO 15685:2004 Soil quality -- Determination of potential nitrification and inhibition of nitrification -- Rapid test by ammonium oxidation ISO 14238:1997 Soil quality -- Biological methods -- Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes ISO 23753-1:2005 Soil quality -- Determination of dehydrogenase activity in soils -- Part 1: Method using triphenyltetrazolium chloride (TTC) ISO 23753-2:2005 Soil quality -- Determination of dehydrogenase activity in soils -- Part 2: Method using iodotetrazolium chloride (INT) ISO/DIS 11063 Soil quality -- Method to directly extract DNA from soil samples ISO/TS 29843-1:2010 Soil quality -- Determination of soil microbial diversity -- Part 1: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) and phospholipid ether lipids (PLEL) analysis ISO/PRF TS 29843-2 Soil quality -- Determination of soil microbial diversity -- Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the simple PLFA extraction method ISO/TS 10832:2009 Soil quality -- Effects of pollutants on mycorrhizal fungi -- Spore germination test ISO/TS 22939:2010 Soil quality -- Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using fluorogenic substrates in micro-well plates ISO 11266:1994 Soil quality -- Guidance on laboratory testing for biodegradation of organic chemicals in soil under aerobic conditions ISO 15473:2002 Soil quality -- Guidance on laboratory testing for biodegradation of organic chemicals in soil under anaerobic conditions ISO 14239:1997 Soil quality -- Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions ISO guidelines International Standardization Organization ISO guidelines Soil invertebrates ISO 11268-1:1993 Soil quality -- Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) -- Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate ISO 11268-2:1998 Soil quality -- Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) -- Part 2: Determination of effects on reproduction ISO 11268-3:1999 Soil quality -- Effects of pollutants on earthworms -- Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations ISO 11267:1999 Soil quality -- Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants ISO 16387:2004 Soil quality -- Effects of pollutants on Enchytraeidae (Enchytraeus sp.) -- Determination of effects on reproduction and survival ISO 15952:2006 Soil quality -- Effects of pollutants on juvenile land snails (Helicidae) -- Determination of the effects on growth by soil contamination ISO 20963:2005 Soil quality -- Effects of pollutants on insect larvae (Oxythyrea funesta) -- Determination of acute toxicity ISO 17512-1:2008 Soil quality -- Avoidance test for determining the quality of soils and effects of chemicals on behaviour -- Part 1: Test with earthworms (Eisenia fetida and Eisenia andrei) ISO/DIS 17512-2 Soil quality -- Avoidance test for determining the quality of soils and effects of chemicals on behaviour -- Part 2: Test with collembolans (Folsomia candida) ISO 23611-1:2006 Soil quality -- Sampling of soil invertebrates -- Part 1: Hand-sorting and formalin extraction of earthworms ISO 23611-2:2006 Soil quality -- Sampling of soil invertebrates -- Part 2: Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola and Acarina) ISO 23611-3:2007 Soil quality -- Sampling of soil invertebrates -- Part 3: Sampling and soil extraction of enchytraeids ISO 23611-4:2007 Soil quality -- Sampling of soil invertebrates -- Part 4: Sampling, extraction and identification of soil-inhabiting nematodes ISO/DIS 23611-5 Soil quality -- Sampling of soil invertebrates -- Part 5: Sampling and extraction of soil macro-invertebrates ISO/DIS 23611-6 Soil quality -- Sampling of soil invertebrates -- Part 6: Guidance for the design of sampling programmes with soil invertebrates ISO guidelines International Standardization Organization ISO guidelines Plants ISO 11269-1:1993 Soil quality -- Determination of the effects of pollutants on soil flora -- Part 1: Method for the measurement of inhibition of root growth ISO 11269-2:2005 Soil quality -- Determination of the effects of pollutants on soil flora -- Part 2: Effects of chemicals on the emergence and growth of higher plants ISO 17126:2005 Soil quality -- Determination of the effects of pollutants on soil flora -- Screening test for emergence of lettuce seedlings (Lactuca sativa L.) ISO 22030:2005 Soil quality -- Biological methods -- Chronic toxicity in higher plants ISO/CD 29200 Soil quality -- Assessment of genotoxic effects on higher plants -- Micronucleus test on Vicia faba ISO guidelines International Standardization Organization Vztahy Dávka (koncetrace) - Odpověď Note No Observed Effect Concentration (NOEC) Lowest Observed Effect Concentration (LOEC) ECx ( x % effects concentration) LCx ( x % lethal concentration) Využití křivky dávka - odpověď Srovnání toxicity různých látek Problém: různé směrnice (sklon) křivky Dávka-Odpověď  Pro interpretaci je nutno uchovat (ukázat) data celé křivky Příklad: Na základě EC50 není rozdíl ALE látka 1 vykazuje efekty ve významně nižších koncentracích (bude mít nižší LOEC/NOEC] Výsledkem hodnocení toxicity jsou „KONCENTRACE“ • Vyjádření KONCENTRACÍ při hodnocení TOXICITY • (1) čisté látky a definované směsi látek (barvy, produkty chemické výroby ...) KONCENTRACE hmotnostní nebo molární – mg/L, ug/L, mmol/L (=mM), nmol/L (=nM) apod. • (2) vzorky z prostředí a jejich extrakty (výluhy apod.) - KONCENTRACE původní matrice př. Voda …. EC50 = 1% (100x ředěná voda vyvolává 50% efekt) - KONCENTRACE EXTRAKTU (% ředění ...) Adverse Outcome Pathways (AOP) Organism Traditionally – Evaluation of adverse effects using the whole organism models New – Ex vivo / in vitro / In chemico / In silico Methods Key task/question: How to link MECHANISTIC INFORMATION with APICAL ENDPOINTS ? Adverse Effects Death Inhibition of Growth Altered Reproduction Tumor Skin irritation … Adverse Outcome Pathways (AOP) • AOP je uspořádané vyjádření biologických událostí vedoucích k nepříznivým účinkům, a je považováno za důležité pro hodnocení rizika. • Dosavadní znalosti jsou použity pro kauzální spojení dvou klíčových událostí: molekulární iniciační události (MI) a nepříznivý výsledek (AO), které se vyskytují na úrovni biologické organizace • popisuje řetězec kauzálně spojených akcí na různých úrovních biologické struktury, které vedou k nepříznivému vlivu na zdraví nebo ekotoxikologického účinek. • http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/adverse-outcome-pathways- molecular-screening-and-toxicogenomics.htm Chemical Macro- Molecular Interaction Cellular Response Organ Response Organism Response Population Response Molecular Initiating Event Key Event 1 Key Event 2 Adverse Outcome Tissue Effect Key Event 3 Chemical Property Receptor/Ligand Interactions DNA Binding Protein Oxidation Gene Activation Protein Production Altered Signaling Altered Physiology Disrupted Homeostasis Altered Development / Function Lethality Impaired Development Impaired Reproduction Altered Sex Ratio Extinction Toxicity Pathway Mode of Action Adverse Outcome Pathway In silico, In chemico, In Vitro, Ex vivo In vivo Základní úrovně pro EcoRa • Organismus • Populace • Ekosystém- základní modelovou jednotkou v EcoRa – Nejkomplexnější jednotka – Zahrnuje živé i neživé složky – Zahrnuje mezidruhové vztahy – Zahrnuje vlivy vedlejších faktorů – Přechod k regionálnímu hodnocení Základní úrovně pro EcoRa ALE: … realita & cíl ekotoxikologie je  Chránit populace v ekosystémech BIOTA POPULACE SPOLEČENSTVA (interakce mezi populacemi) EKOSYSTÉMY • Ecosystems are NOT more complex than we think. They are more complex than we CAN think. Hodnocení účinků na úrovni populace, společenstva, ekosystémů Hodnocení účinků na úrovni populace, společenstva, ekosystémů Efekty na biochemické a organismální úrovni - relativně snadno popsatelné a stanovitelné - dobrá kvantifikace Efekty na úrovni populací a společenstev - obtížně studovatelné a kvantifikovatelné - komplexnost a variabilita - dobře prokazatelné až velké změny - pomalé projevy - organismální efekty nejsou vždy interpretovatelné - obtížně prokazatelná kauzalita "toxikant <-> efekt" - obtížně predikovatelné Variabilita v populacích … je přirozená Základní „měřitelné“ PARAMETRY populací (demografické parametry) Populace - Jedinci téhož druhu, kteří obývají ve stejném čase stejné území (lokalitu) Primární parametry • natalita: počet jedinců za jednotku času (a nejčastěji jedince) • mortalita: počet jedinců kteří zemřou za jednotku času (a nejčastěji jedince) (JINAK: za jak dlouho zemře příslušný jedinec) • měřítko velikosti (performance) – úspěšnost – specifický parametr pro různé druhy (např. velikost, počet jedinců, počet semen, květů, množství biomasy aj.) Sekundární parametry - odvozené z primárních • závislost natality, mortality, performance na výchozí velikosti • frekvence (četnost / jak často?) přechodu z jedné velikostní třídy do druhé (~ rychlost růstu populace: oba uvedené body vyjadřují totéž, jen v pojetí kvantitativním a kvalitativním) EKOTOXIKOLOGIE V POPULACÍCH Vlastnosti na úrovni jedince, které jsou klíčové pro udržení/růst populací: - vyspělost k rozmnožování (rychlost dosažení / růst / pohlavní dospělost) - rozmnožování (produkce gamet – počty, kvalita…) Efekty toxických látek na úrovni jedince  projevy na úrovni populací - změny abundancí / počtů (snížení růstové kapacity) - změny natality / fekundity - změny demografie (př. stárnutí populace) EKOTOXIKOLOGIE V POPULACÍCH • Příklady: 1) selekce genů v populacích - antibiotika-rezistentní bakterie (viz jinde) - hmyz rezistentní na pesticidy (viz jinde) - znečištění vzduchu - drsnokřídlec v Británii: tmavé vs. Světlé varianty - rezistence (snížení citlivosti) k toxicitě kovů 2) změny v rozložení pohlaví v populacích („sex ratio“) - pohlaví u člověka - změny rozložení pohlaví u hmyzu 3) vliv toxických látek na velikost a rozmnožování - Hg vs. ryby Životní cyklus druhu a populační ekotoxikologie • Citlivost různých vývojových stadií - zásadní význam pro demografii populace • Mladší stadia (embrya) bývají citlivější k vlivům toxikantů - citlivost: rychle dělící se buňky u embryí a larev - viz embryotoxicita • Důsledek - snížení fekundity  stárnutí populace – Výjimky - mechanická ochrana (povrchové vrstvy) • rezistence vajíček ryb (vs. vysoce citlivá embrya ryb) • semena rostlin, klidová stadia dalších organismů Chrostíci Rozdíly v citlivosti s věkem Vyšší mortalita u starších … Mortality(%)Mortality(%) 1) Experimentální studie reprodukční toxicity - D. magna – 21 denní reprodukční test - Žížaly – 4 týdenní reprodukční testy - chvostoskoci Folsomia candida - reprodukční testy 2) Testy celoživotního cyklu - Např. pakomáři Chironomus (OECD guideline 233) 3) Modelování (např. DEB modely) Jak prostudovat účinky s dopady na populace ? Hodnocení účinků na úrovni společenstva, ekosystémů • Nejasné vymezení v terénu • Praktická nemožnost kompletního popisu (nelze sestavit úplný seznam druhů) • Časová a finanční náročnost ekosystémového výzkumu • Obtížný popis a kvantifikace jevů • Typický pro ekosystémovou úroveň • Definování škodlivosti na úrovni ekosystému je obtížné – „zdravotní stav“ a jeho změny jsou těžce definovatelné – Projevuje se vliv ostatních ekologických faktorů, ztěžují možnost určit vliv samotného kontaminantu – Negativní postižení jednoho druhu organismu vyvolá negativní odezvu u řady dalších druhů, nebo současně pozitivní reakci u jiných druhů (kteří jsou konkurenty) – Účinek toxikantu nevede k likvidaci ekosystému ale přeměně na jiný ekosystém -v něm se realizují jiné druhy, sukcesní vývoj Společenstvo - biocenoza (Community) • Soubor populací různých druhů, které spolu žijí v určitém prostředí (biotopu) a vzájemně spolu interagují (existence vazeb) • Příklady vztahů (interakcí) mezi populacemi druhů – Kompetice (o potravu, o prostor, o světlo …) – Symbioza – Potravní vztahy / potravní řetězce – atd. atd. • -> důsledek: variabilita / přirozené kolísání počtů Základní principy – ZPĚTNÉ VAZBY ZPĚTNÉ VAZBY pozitivní = nárůst „B“ způsobuje nárůst „A“ A+ B+ negativní = nárůst „B“ způsobuje pokles „A“ A- B+ Příklady: - propojené populační cykly králíka a rysa (predátor) + další součásti biocenozy  další strana Jak lze společenstva popsat / parametrizovat ? • PARAMETRIZACE (měřitelné veličiny) • Působení stresorů  změny v měřitelných parametrech • Základní popis - parametry strukturní • (Parametry funkční – viz dále: ekosystémová úroveň) • Bohatá struktura (bohatost vztahů / biodiverzita)  podmínka stability biocenozy i ekosystému EKOTOXIKOLOGIE SPOLEČENSTEV - struktura Strukturní parametry – parametry faunistické/floristické (druhové složení a zastoupení) – prostorové a časové cykly – vztahy ve společenstvu / společenstvo - prostředí • Množství a abundance – počty jedinců – biomasa – chlorofyl-a – pokryvnost – parametry vztažené na plochu (terestr.) a objem (akvat.) EKOTOXIKOLOGIE SPOLEČENSTEV - struktura Charakterizace DIVERZITY • INDEXY – Shannon-Wiener (H´ = - Ni/N ln (Ni/N) ) – Vyšší H´  vyšší diverzita – Shannonův index vyrovnanosti (evenness) (E = H´ / lnS) – Vyšší E  vyšší vyrovnanost společenstva – Margalefův index (D = (S-1) / lnN ) – ... a celá řada dalších indexů • Poznámka: indexy jsou necitlivé na změny ve vzácných druzích … málo jedinců  malý vliv na celkový index Ni – počet jedinců jednoho druhu N – celkový počet jedinců společenstva S – počet druhů KLÍČOVÉ DRUHY (Key / Keystone species) • efekty na těchto druzích  dramatické změny celé biocenózy • Klíčové druhy • zpravidla „predátoři“ (kontrola spodních pater) • Př. Mořské hvězdice na skalách a kamenech  pohyb a spásání biomasy / predátor • Likvidace hvězdic  přerůstání makrořas  přemnožení mlžů (slávky) • Př. Sladkovodní ryby ovlivňují fertilitu rostlin v terestrickém ekosystému Knight et al., NATURE (2005) 437: 880 • INDIKÁTOROVÉ DRUHY • Druhy, jejichž (ne)přítomnost indikuje určitou vlastnost ekosystému • citlivé druhy (např. pošvatky, horské ploštěnky, lišejníky) • oportunní druhy (např. pakomáři, pijavky ...) • Různé organismy indikují různé typy stresu • Př. kontaminace živinami (dusičnany apod.) • Makrozoobentos – saprobita / řasy, rozsivky – trofie (viz dále) • Kontaminace toxickými látkami • Lišejníky – čistota vzduchu KLÍČOVÉ DRUHY (Key / Keystone species) Příklady účinků a jejich vlivu na vztahy ve společenstvu (predátor - kořist) - působení insekticidů ve vodním prostředí  eradikace populací hmyzu (komáři)  likvidace zdroje potravy pro dravé ryby  hmyz - rychlé rozmnožování - návrat  ryby - pomalé množení = dlouhodobý efekt - likvidace terminálních predátorů (bioakumulace tox. látek)  vyhubení vlků v severní Americe  přemnožení jelenů  neřízené spásání vegetace luk a lesů  vyhubení dravců (DDT)  přemnožení hlodavců  neřízené spásání úrody na polích Působení toxických látek  změny ekologických vztahů Ekosystém • Heterogennní systém složený z biotické složky (biocenozy, biologický subsystém) a abiotické složky (ekotopu, subsystém prostředí) • Biota vs. prostředí – vztahy / zákonitosti • Klíčová zákonitost v ekosystémech z pohledu studia ekotoxikologie– „Zákonitost určujících abiotických faktorů (ekologická valence)“ EKOSYSTÉMY a účinky toxických látek V ekosystémech lze sledovat (na rozdíl od manipulovaných biotestů) pouze retrospektivní efekty Posouzení vlivu na úrovni ekosystému - zpravidla nelze hodnotit vztahy dávka – odpověď: efekty mají kategoriální charakter (STRES +/-, EFEKT +/-) - Při charakterizaci poškození je nutné vždy zajistit srovnání s "normálními" hodnotami. ? existuje normální stav nebo vývoj ekosystému ? Definice „Normálního stavu ekosystému“ není jednoduchá • STACIONÁRNÍ STAV – klidový stav, dlouhodobě ustálené hodnoty, – není běžný: ekosystémy jsou přirozeně „variabilní“ (hodnoty se dynamicky mění) • STABILNÍ STAV – stav, kdy okolní podmínky nemění podstatu věci (uvnitř může docházet ke změnám/kolísání hodnot) • DYNAMICKÁ stabilita / rovnováha: HOMEOSTÁZA – stav, kdy se prostřednictvím AKCE/REAKCE udržuje dlouhodobě stabilní stav • ! SUKCESE – ekosystémy nejsou nikdy „stacionární“ – prochází v čase vývojem: – Cílem by měla být ochrana „plynutí“ – udržování HOMEORHÉZY SUKCESE EKOSYSTÉMU Sukcese je zákonitý sled změn druhového složení, který vyusťuje v náhradu jednoho ekosystému druhým - změna prostředí ekotopu rozhoduje zda, kdy a jak rychle sukcese probíhá, ALE samotný průběh je ovládán biocenozou - sukcese končí ustáleným ekosystémem (klimax), v němž je na jednotku dosažitelného toku energie produkováno nejvíce biomasy a nejvíce symbiotických vztahů mezi organismy (v klimaxu diverzita opět klesá) Vypracovány a standardizovány komplexní postupy testování - simulace přírodních podmínek - model ekologických vztahů mezi organismy (potravní řetězce) - hodnocení nepřímých efektů (likvidace producentů  další efekty v ekosystému) Experimentální uspořádání - podle velikosti (řada překryů / nejednoznačné hranice) : mikrokosmy voda - do 1 m3 stojaté, nebo 1 m tekoucí půda – experimenty s půdním jádrem : mezokosmy „větší než“ mikrokosmy - rozdělení podle uspořádání – laboratorní kontrolované podmínky - přírodní podmínky Vícedruhové hodnocení ekotoxicity Existují i standardizovaná doporučení: - mikrokosmy i mezokosmy - využívána nejčastěji při hodnocení rizik pesticidů (prostředky na ochranu rostlin) • US EPA Test Guidelines OPPTS 850.1900 Generic Freshwater Microcosm Test, Laboratory • OECD – draft dokumenty Postupy však obsahují spíše obecné požadavky - aklimatizace a příprava systému - obecné podmínky pro velikost - složení a počty organismů Každý výsledek z podobných studií je cenný - doposud relativně málo dostupných dat (ve srovnání s "klasickými biotesty") - ekonomicky i časově náročnější experimenty - realizace a interpretace vyžaduje kvalitní ekologické vzdělání - výsledky často nejsou veřejně dostupné (vlastnictví firem, které registrují pesticidy) Stále jen „model“ – řada nedostatků - Izolace od okolí (zamezení případné „rekolonizaci“) - Vnější stěny (mikrokosmy) – rychlé střídání teplot (vs. Přírodní nádrže: stabilní) atd. Standardizace mikro- a mezokosmových studií Expensive & time consuming (e.g. Pesticide testing) Variable results (natural variability …) Higher ecological relevancy Micro & Mesocosms Příklad – laboratorní terestrický mikrokosmos Příklad – akvatické mikrokosmy HODNOCENÉ PARAMETRY - hodnocení v rámci jednotlivých druhů - mortalita, růst - reprodukce - populační charakteristiky - hodnocení společenstva – ekologické efekty - strukturní parametry: taxonomie, indexy atd. (v praxi jsou hodnoceny častěji než funkční p.) - funkční parametry zásoby – živiny, energie procesy – produkce, respirace ... Vyhodnocení výsledků mikro / mesokosmů FUNKČNÍ PARAMETRY EKOSYSTÉMŮ 1) Zdroje a pohyb živin / energie (autochtonní – vnitřní / allochtonní – externí) • přenos energie = potravní sítě – pastevně kořistnický / parazitický / dekompoziční – producenti  konzumenti  destruenti/dekompozitoři 2) Procesy v ekosystémech • Produkce Primární: CO2 + H2O + hv  (CH2O) + O2 Sekundární produkce (v potravním řetězci • Respirace / dekompozice Metriky sledování procesů: balance / výměny koncentrací plynů - O2, CO2, NOy atd. 3) Resilience / Elasticita • jednotka [1/ time unit] • kapacita překonat stres & čas nutný k překonání stresu – vyšší: rychle rostoucí a rozmnožující se druhy (phytoplankton) – nižší: delší generační doba (bentické organismy, ryby) Terénní studie • Mohou identifikovat, které ekologické účinky se skutečně ději na dané lokalitě • Metody používané v terénních studiích mohou zahrnovat sběr organismů, měřeni fyzikálních vlastnosti habitatů nebo také dálkový průzkum – Sběr organismů, měření fyzikálních vlastností, dálkový průzkum • Data terénních studii obsahují: – druhovou bohatost, diversitu, indexy podobnosti, biomasu, přítomnost tolerantních a citlivých druhů, populační strukturu atd. Hodnocení ekosystému - charakterizace abiotických a biotických složek - specifika akvatických a terestrických ekosystémů Možnosti studia účinků v ekosystémech - polní studie, biomonitoring Akvatické ekosystémy Terestrické ekosystémy Charakteristiky (parametry) strukturní parametry - druhové složení, počty, abundance funkční parametry - toky energií a látek Možnosti hodnocení působení stresu ! Pro posouzení stresu je nutné srovnání s "kontrolou" (1) srovnání "před a po" působení stresu kontrola = stav ekosystému před působením - předpokládá monitoring před působením stresu (sledování stavu abiotické a biotické složky ekosystému) - známe pozaďové hodnoty a "přirozený" stav (2) srovnání exponovaného ekosystému s jiným nezasaženým ("kontrolním") ekosystémem klíčový je výběr kontrolního ekosystému: - oba ekosystémy mají srovnatelné vlastnosti abiotické (terén, geologie, nadmořská výška ...) - za normálního stavu se předpokládají podobné biologické vlastnosti (tj. shodná společenstva, potravní vztahy ...) - Odvození závěrů je v tomto případě vždy složité (neexistují dva stejné / stejně se vyvíjející ekosystémy) Polní studie, biomonitoring Polní studie, biomonitoring Praktický postup při polní studii / biomonitoringu (1) charakterizace lokality, průzkum přímo v terénu (2) definice hodnocených parametrů příslušného ekosystému ve vztahu k působení stresu - abiotické složky - biotické složky – strukturní a funkční parametry (3) definice odběrů (vzorkování, četnost, počty) - abiotických složek (voda, sedimenty, půda, vzduch) - biotických složek (producenti – konzumenti – destruenti) (4) realizace odběrů / analýzy / hodnocení (5) srovnání EXPOZICE vs. KONTROLA, závěry Polní studie, biomonitoring (2) definice parametrů ve vztahu k působení stresu - abiotické složky - ve kterých složkách (voda, sediment, půda, vzduch) působí/il stresor ? - kde lze předpokládat rezidua toxických látek ? - biotické složky definice organismů, které budou sledovány pro posouzení působení stresu: - vztah k působení stresu (př. planktonní organismy – látky s tendencí zůstávat ve vodním sloupci, tj. hydrofilní vs. sedimenty-hydrofobní) - hodnocené skupiny (př. producenti – řasy; konzumenti – zooplankton, ryby; destruenti – planktonní bakterie) - klíčové druhy, bioindikátory ... - parametry hodnocení - strukturní (taxonomické parametry, biomasa, abundance ...) - funkční (produkce/respirace, potravní řetězce ...)