BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie Princip fluorescence RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU EVROPSKÁ UNIE k0 I M ministerstvo Školství. op******* -j,.-^^^ mladězí ľ" kflnHifaMMtniniiiMt mna* INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a slalnim rcvporlem České republiky Program přednášky: • definice a princip fluorescence • fluorochromy BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 01 / 22.2. „Viditelné" světlo elektromagnetické vlnění o vlnové délce 400-700 nm duální povaha - vlnová i časticová frekvence (f) - počet kmitů za sekundu (4-8*1014s 1 [Hz]) vlnová délka (A) - délka jednoho kmitu (400-700 nm) rychlost světla (c) = konstantní ve vakuu (300.000 km*s_1) Planckova konstanta h = 6,626*1034 J*s Electromagnetic Wave platí vztahy: c = X*f E = h *f BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 01 / 22.2. vlnová délka - barva světla Ultraviolet UV (Invisible) Spectrum of "White" Light j Visible Wavelengths | Infrared IR (Invisible) 300nm 400nm SOOnm SOOnm 700n m SOOnm Figure 2 BLUE CYAN GREEN YELLOW RED shorter A A A A i longer http://olvmpus.magnet.fsu.edu/primer/iava/wavebasics/index.html BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - Ol / 22.2. LUMINISCENCE jev při kterém vysílá látka do prostoru světlo dělení dle indukce - chemiluminiscence : vyvoláno chemickou reakcí např. oxidace luciferinu luciferázou u světlušky, ECL "IS Set oři dory Ab-HRP Protein Peracid Oxidized form of enzyme t luminal + enhancer Oxidized product Hybond ECL Hyperfilm ECL BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 01 / 22.2. -Fotoluminiscence záření je vyvoláno jiným zářením a) fluorescence b) fosforescence fluorochrom = fluorofor látka schopná fluorescence excitační záření luminiscenci vyvolává emisní záření vysílané látkou Absorption Excitation Emission BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 01 / 22.2. excitační zářeni Podstata fluorescence Jablonskiho diagram vyssi energetické hladiny h tt p ://□ ly m p us, mag net.f sued u/p ri mer/java/f I u oresce n ce/exd te em it/ i n dex. ht m I Stokes' Observation UV Absorption základní energetická hladina Visible Fluorescence Emission emisní záření BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 01 / 22.2. •f j--. i Průběh fluorescence 1. excitace elektronů fotony ze základní energetické hladiny do excitovaného stavu trvání 10"15 s 2. excitovaný stav pokles na nejnižší hladinu excitace (relaxace) ztráta energie ve formě tepla trvání 10-14-10-n s 3. emise světla => fluorescence trvání 10"7 - 10~9 s = doba dohasínaní ■v _ BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 01 / 22.2. recyklace Absorption Fxt itdlicin O Ground state Emission Before photobleaching Deitroctwn Absorption Emission Ground »t*l* Fluorescein Photobleaching 13 sec http://www.olvmpusmicro.com/primer/iava/fluorescence/photobleaching/index.htm BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - Ol / 22.2. Princip fluorescence http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/tuto rials/llntro/player.html Podstata fluorescence a fosforescence Jablonského diagram Jablonski Energy Diagram Excited Singlet States Excitation (Absorption) 10*15 Seconds internal Conversion and Vibrational Relaxation 10~14-10"11 Sec Fluorescence (10~9-10"7 Sec) Vibrational nergy States I Delayed Fluorescence Intersystem Crossing Quenching Non-Radiative s 2—— Relaxation o 5 Excited J Triplet í State 0 ov Non-Radiative Relaxation (Triplet) Phosphorescence (103-102 Sec) Ground State Figure 1 Alexander Jablonski (1898-1980) fosforescence doba dohasínání IQ"3 -102 s BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - Ol / 22.2. Jablonského diagram- zjednodušený http://olympus.maffnet.fsu.^ Jablonského diagram http://olympus.mafinet.fsu.edu^ BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 01 / 22.2. Spin je kvantová vlastnost elementárních částic - vnitřní moment hybnosti částice. Spiny částic přispívají k celkovému momentu hybnosti soustavy. excitovaný s i ng letový stav - elektrony obsazují vyšší energ. hladiny -porušuje se párování elektronů na jednotlivých hladinách - spin se při excitaci nemění A E základní singletový stav -všechny elektrony jsou spárovány -mají opačný spin -velikost+1/2, -1/2 i Ti tripletový stav (zakázaný) -méně pravděpodobný -elektrony mají stejný spin fluorescence fosforescence BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 01 / 22.2. > J Stokesův posun • V rámci relaxace v excitovaných stavech dochází ke ztrátě energie • Energie excitujícího světla je větší než emitovaného (Eex> Eem) • Vlnová délka excitujícího světla je menší než emitovaného (X < X BLUE-CLASS h CHJflO WINDOW C í: IT A T ION FILTFK < i. I) 0 rxn OF WINE EMISSION FlLTf HJ Mgurv 1.6. [í\pťrimťni;il sťhem;iT.ii/ for detection of thť Slokcs shift. On the Change of Refratiffibility of Light. By G. G. Stokes, M.A.. F.R.S.. Fellow of Pembroke College, and Ijh avian Professor of Mathematics in the University of Cambridge. Phil. Trans. Royal Society ofbmdon (1852) pp. 46.1-562. Received May i I. — Read May 27. IH52. Sir G.G. Stokes BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 01 / 22.2. Absorbční (excitační) spektrum závislost intenzity fluorescence na excitační vlnové délce (měřeno při konstatní emisní vlnové délce) Emisní spektrum závislost intenzity fluorescence na vlnové délce při konstantní vlnové délce excitace Absorption and Emission Spectra with Overlap Profile (b) ♦ UV Wavelength Emission Spectrum Wavelength Spectrat Ov Wavelength IR-*> BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 01 / 22.2. • obě spektra mají své maxima • excitační maximum • emisní maximum • vzdálenost mezi nimi - Stokesův posun Excitation maximum Emission maximum 500 600 Wavelength of light (nm) BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 01 / 22.2. Emisní spektrum určitého fluorochromu • je nezávislé na vlnové délce excitace • emise z nejnižšího excitovaného stavu (S1) • mění se pouze intenzita fluorescence • intenzita emisního spektra odpovídá amplitudě excitace e o B ö X (D O C M Symetrie mezi absorpčním a emisním spektrem • struktura vibračních hladin základního i excitovaných stavů je stejná • absorpce (excitace) a emise do odpovídajících hladin nastává se stejnou pravděpodobností • absorpční a emisní spektra zrcadlově symetrická Electronic Absorption and Emission Bands Photon Energy (Electron-Volts) Excitační a emisní spektrum http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/tutorials /2Spectra/player.html Molární extinkční koeficient (molární absorptivita) • vyjadřuje míru schopnosti látky absorbovat světlo Lambert-Beerův zákon A = E ■ c -1 • A - absorbance (bez jednotek) • e - molární extinkční koeficient (l-mol^-cnv1) • c - molární koncentrace (mol-ľ1) • I - dráha (cm) > _ LP BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 01 / 22.2. \ Kvantový výtěžek fluorescence (Qantum Yield = QY) QY = počet emitovaných fotonů počet absorbovaných fotonů • vyjadřuje míru schopnosti excitačního vlnění vyvolat fluorescenci • maximálně = 1 (teoreticky; energetické ztráty) BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 01 / 22.2. Standardy pro určení kvantového výtěžku fluorescence Omnium Yield [O.Y,] $tan^r Přirozeně se vyskytující fluorofory - aminokyseliny Oj HH2 I CH2—CM V COOH H I CM2-CM I COOH NH2 Q-CMj-CH COOH Tryptophan Tyrosine Phenylalanine hlavní zdroj fluorescence proteinů v UV spektru -indolová skupina Trp Trp v sekvencích jen 1% metabolický náročná syntéza 1.0 >- co Table 2: fluorescent properties of some amino acids amino acid Lifetime (Nanoseconds) Excitation Emission Wavelength Molar absorptivity Wavelength Quantum yield Tryptophan 26 2SQ 5,600 348 0.20 Tyrosine 3.6 274 1,101 303 0.14 Phenylalanine 6.4 157 ?