BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie Principy a postupy imunofluorescenčního značení buněk RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Program přednášky imunocytochemie typy protilátek a jejich výroba postup imunofluorescenčního barvení Nevlastní (vnější) fluorescence Přímá vazba fluorochromu na molekuly nebo buněčné struktury - sondy DNAy buněčná stěna, plazmatická membrána... mitochondriální aktivita - respirační vzplanutí, pH indikátory, membránový potenciál. Nepřímá vazba fluorochromu - značky navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, annexin V, phalloidin.. BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Imunocytochemie (ICC) • soubor metod, které umožňují detekci antigenu v tkáni nebo buňce [in situ) • pomocí značených protilátek Albert Hewett Coons, M.D. (1912- 1978) zakladatel imunofluorescence * použití fluorochromem značené protilátky Coons, A. H,, Creech, H.J. and Jones, R. N. (1941). 'Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.' Proc. Soc. exp. BioL {N.T.)y 47\ 200. LOCALIZATION OF ANTIGEN IN TISSUE CELLS IL Improvements e* a Method for the Detection of Antigen by Means of Fluorescent Antibody*- % By ALBERT H. COONS, M.D.f and MELVTN H. KAPLANJ {From the Department oj Bacteriology and Immunology, Harvard Medical School, Boston) (Received for publication, August 6, 1949) BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Protilátky • patří do skupiny imonoglobulinů • třídy: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM • složení: 2x těžký řetězec (H), 2x lehký řetězec (L) • H řetězce: různé dle antigenních a strukturálních vlastností Ig ->podtypy (alfa, delta, epsilon, gama, mí) • L řetězce: lambda nebo kapa - různě, v závislosti na typu Ig • H a L - spojení disulfidickými vazbami, podíl na terciární struktuře, udržuje stabilitu Ig • nejčastěji pro imunofluorescenci IgG a IgM Name Heavy Chain Description Antibody Complexes lgAl.2 a Found in mucosal areas, such as the gut. respiratory tract and urogenital tract, where it prevents colonization by pathogens. Also round in saliva, tears.and breast milk. IgD A Functions mainly as an antigen receptor on B cells that have not been exposed to antigens. It has also been shown to activate basophils and mast cells to produce antimicrobial factors. IgE Binds to allergens and triggers histamine release from mast cells and basophils, and is involved in allergy. Also protects against parasitic worms. IgG 1,2,3,4 V In its four forms, provides the majority of antibody-based immunity against invading pathogens. The only antibody capable of crossing the placenta to give passive immunity to the fetus. IgM Expressed on the surface of B cells asa monomer, and in a secreted form as a pentamer with very high avidity. Eliminates pathogens in the early stages of B cell mediated (humoral) immunity before there is sufficient IgG, Monomer: IgO, IgE, IgG Dimer: IgA Pentamer: IgM BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Antibody Human and Mouse Human Mouse Light Subtype Heavy Light Subtype Heavy Chain Chain Cham Chain K or A IgGi Vi K or A ■■■i K or A ■12 K or A Y2a K or A n K or A lgG2o V2b K or k V4 K or A lgG3 V3 BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. IgG obecný vzorec: gama2 lambda2 nebo gama2 kapa2 průměrná Mr = 150kDa, H = 50kDa, L = 25kDa domény - variabilní (V) a konstantní (C), velikost 80-120AA na N-koncích : L řetězec: lx VL doména H řetězec: lx VH doména na C-koncích : L řetězec: lx CL doména H řetězec: 3x - CHly CH2, CH3 BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. VL a VH tvoří vazebné místo antigénu, v této části hypervariabilní oblasti - tyto se během reakce s antigenem dostávají nejblíže (0,2-0,3 nm) Struktura vazebného místa, která je unikátně charakteristická pro danou protilátku, se nazývá idiotyp -> každý klon protilátky má jiný idiotyp cwilBfit ťTvrtuogtobuiin wuM •mmuogtabultfi i: r-., i dorrmn Struktura -odvozena od enzymatického štěpení • papain- štěpí v pantové oblasti H řetězce vznik: > 2x monovaletních Fab (Fragment antigen binding) > lx Fc (Fragment crystallizable) * pepsin - štěpí v C-koncové oblasti H řetězce vznik: > lx bivalentní F(ab')2 > zbytek Fc fragmentu je degradován IgM pentamer, Mr=900kDa, 5x podjednotka po ISOkDa obecný vzorec (mí2 kapa2)5 nebo (mí2 lambda2)5 struktura spojena řetězcem „J" (15kDa) stejné štěpení proteinázami jako IgG, vznik lOx Fab a Fc; 5x F(ab}2 Fc - cyklický pentamer (340kDa) "SM (S Pentamer disuHide Imunitní odpověď • imunizace antigenem - vyrovnání koncentrace mezi intra a extravaskulárním prostorem • zachytávání antigénu v uzlinách • latentní (indukční) fáze - asi týden • první tvorba IgM - primární odpověď • později nebo po další imunizaci (booster)- převážně tvorba IgG -sekundární odpověď • různá délka poločasu - IgM = 4-6 dní, IgG = 3 týdny . P mi "ľ- J- ,-.-vj VjŕCLňAtlQň Dost Polyklonální protilátky pro ICC * produkce různými klony B- lymfocytů * reakce s různými epitopy daného antigénu * nejčastější producent - králík (New Zeeland White rabbit), koza, prase, ovce... RAISING ANTIBODIES IN ANIMALS Antibodies can be made in the laboratory by injecting an animal i usually a mouse, rabbit, sheep, or goat) with antigen A. injecl antiij*n A Idke blood later Repeated injections of the same antigen at intervals of several weeks stimulates specific B cells to secrete large amounts of anti-A antibodies into the bloodstream. Because many different B cells are stimulated by antigen A, the blood will contain a variety of anti-A antibodies, each of which binds A in a slightly different way. BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Příprava polyklonálních protilátek • navržení a syntéza peptidu • ověření čistoty hmotnostní spektrometrií a chromatografií • coupling - vazba s KLH glykoproteinem Jíl in- Vím- iixníKi- v..... KLH - Keyhole limpet hemocyanin měkkýš {Megathura crenulata) produkce vysoce imunogenního glykoproteinu KLH dodá imunogenitu i peptidu BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. ^4 NA** Příprava polyklonálních protilátek * imunizace - kontrola specificity vůči antigenu • získání séra Nom ▼ Date ▲ Description 1 03.12.2009 Peptide ordered 2 28.12.2009 Peptide ready 3 05.01.2010 Peptide coupling via C-terminal cysteine 4 08.01.2010 Immunisation of rabbits number 26 and 27: 1st injection 5 29.01.2010 Immunisation of rabbits number 26 and 27: 2nd injection 6 05.02.2010 Rabbrt sera after second injection of antigen 7 09.02.2010 Testing of the sera after 2nd injection of antigen using dotblot 8 01.03.2010 Immunisation of rabbits number 26 and 27: 3rd injection 9 08.03.2010 Rabbrt sera after third injection of antigen 10 11.03.2010 Testing of the sera after 3rd injection of antigen using dotblot 11 01.04.2010 Immunisation of rabbits number 26 and 27: 4th injection 12 08.04.2010 Final bleed after fourth injection of antigen BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Příprava polyklonálních protilátek • imunizace Imni itnisaított protocol 1 \ Fusi in j lvi inn - day I: suk-uiaiieous injection of 100 - 500 ug of purified protein or peptide coupled m KI,H tin complete Freunďs adjuvans). 2) Second injection - day 15: subcutaneous injection of 100 - 500 [lg of purified pmtein nr peptide cmipleil in KI.H (in incnmplclc Freund's adjuvans). 3) Tesi sera -day 20: 5 mls <>j lest sera 4) Third injection - day 46: subcutaneous injection nf IfKl — 500 py of purified protein of peptide coupled to KI,H tin incomplete Frcund's adjuvans). 5) Tesl sera or final bleed - day 54 eillvr 5 mis nf Ihe lest sera nr 50 - SOmls of the final ■ierci. f» Fourth injection - day 76 subcutaneous injection of 100 - 500 pg of purified protein or peptide coupled to KLH (in incomplete Freund's adjuvanst 7) Final sera collection - dav X4. 50 - SOmls of the final sera. BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Ověřování afinity protilátky k antigénu metoda: dot-blot 1) na membránu nanesen antigén 2) kapka různě ředěné protilátky 3) detekce anti-králičí protilátkou konjugovanou s chromogenem Monoklonální protilátky pro ICC • produkovány pouze jedním klonem B-lymfocytů • všechny molekuly imunoglobulínu jsou totožné • reagují pouze s jedním specifickým epitopem na antigénu • nejčastěji myší • příprava pomocí hybridomů: fůze B-lymfocytu a myelomové b. tumor cell from cell culture divitles indefinitely but does not make antibody B cell from animal injected with antigen A makes anti-A antibody but does not divide forever FUSE ANTIBODY-SECRETING B CELL WITH TUMOR CELL d5 hybrid cell makes anti-A antibody and divides indefinitely BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. •f ■J-. i Tvorba monoklonalních protilátek http://site5.5inauer.com/cooper7e/ani mation0413.html mouse immunized with antigen X mutant call line derived from a tumor of B lymphocytes A cell making mA* anti-X antibody *0* B lymphocytes (will die after a few days in culture) (cells will grow indefinitely In normal medium, but will die in selective medium) FUSION I producta plated in multiple well* secreted J / anti-X antibody i i i only hybridomas grow on the selective medium test supernatant for enli-X anlibc dy and c lane ce I Is from positive well al -1 call par well (TTTTTTTT allow cells to multiply, than tast supernatant for anti-X antibodies: positive clones provide a continuing source- of anti-X antibody BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. > •f První monoklonální protilátka (1975) myší monoklonální protilátka - klon Spi (IgM) proti SRBC (sheep red blood celis) fůze myších buněk z myelomu a sleziny Nature Vol. 256 August 7 1975 Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity MRC Lalxtratory of Molecular Biohftw Hilh Roati, Cambridge CB2 2QHy UK G. Köm.FH C. MtLSTEIN Myeloma cells (10- P3-X67A g8) were fused to 10* spleen cells from an immunised BALB/c mouse. Mice were immunised by intraperitoneal injection of 0.2 ml packed SRBC diluted 1:10, boosted after I month and the spleens collected 4 d later. After fusion, cells (Sp-I) were grown for 8 d in HAT medium, changed at 1-3 d intervals. Cells were then grown in Dulbceco modified fcagle's medium, supplemented for 2 weeks with hypoxanthtne and thymidine. Forty days after fusion I he presence of ant i-SRBC activity was revealed as shown in a. The ratio of plaque forming cells/total number of hybrid cells was 1/30. BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Konjugace protilátky s fluórochromem vazba přes aminoskupinu, vznik amidu R-c o O-R' ester + H2N-R amin R-C N-R" H amid NH,-Reactive Fluorescein Fluorescein - IgG conjugate BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Konjugace protilátky s fluórochromem • vazba přes thiolovou skupinu (-SH) • nutné v redukujícím prostředí- porušení disulfidických vazeb • vyšší senzitivita konjugátu - specifičtější místo značení Přímá vs. nepřímá imunofluorescence • přímá imunofluorescence - původní metoda (1942) • přímá vazba protilátky s fluorochromem na antigén • rychlá, méně univerzální, nižší intenzita signálu • využití pro flow-cytometrii fluorochrom epitop antigénu imunoglobulin BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Přímá imunofluorescence a) značená protilátka od dodavatele b) vlastní označení zvolené protilátky vybraným fluorochromem Lightning Link'-Rapid prepare and add the Label _ modified antibody solution add the quench Labeled antibody ready to use 00.00 -—1 29 sees 15 minutes Isec 4 minutes <20 minutes BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3 I n nova Biosciences, Lightning-Link® •f ■J-. Nepřímá ímunofluorescence _ A dvoukroková ££3 1) primární protilátka x antigénu 2) sekundární značená protilátka x primární protilátce x Sccsndory trilibody 9Pm • univerzální, více primárních protilátek z jednoho organismu lze kombinovat s jednou sekundární protilátkou • vyšší citlivost - na I. Ab více rozeznatelných epitopů, více navázaných molekul II. Ab BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Základní postup imunofluorescenčního barvení buněčných kultur 1) fixace 2) permeabilizace 3) blokování nespecifických vazeb 4) inkubace s protilátkou / protilátkami 5) counterstaining (detekce DNA) 6) montování BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Základní postup imunofluorescenčního barvení tkáňových řezů 1) parafínové řezy (±4 jum) na podložním skle 2) deparafinízace - xylen 3) rehydratace - sestupná alkoholová řada 4) reaktivace antigénu (antigén retrieval) v tlakové komoře pri vyšší teplotě (97°C) 5) blokování nespecifických vazeb 6) inkubace s protilátkou/-ami (chromogen - platí jen pro IHC) 5) counterstaining 6) montování ^ iiáŕr, BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Fixativa požadavky • rychle proniká do buňky/tkáně • fixuje b. struktury a zabraňuje reakci buňky a tím vzniku strukturálních artefaktů • zamezí ztrátě rozpustných proteinů • nesmí vykazovat autofluorescenci • rozdíly v závislosti na detekované struktuře • chemická fixativa • mrazová substituce • mikrovlnná fixace BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Chemická fixativa koagulační chemická fixativa • MetOH - nejčastéji/-2Q°C, bez permeabilizace • EtOH • aceton výhody • rychlá fixace, díky dehydrataci • proteiny jsou koagulovány nebo extrahovány • zachovává rozpoznání antigénu nevýhody • výrazné smrštění vzorku (až o 50%) • zkreslení morfologie a velikosti BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Crosslinkujřcí chemická fixativa vytváří metylenové vazby -CH2- (crosslinks) mezi různými skupinami makromolekul o • formaldehyd hAh • glutaraldehyd.. o^^^^o H HO- -C-0 nejčastěji paraformaldehyd (4% PFA) [H • reaktivní skupiny: amidová, guanidinová, thiolová, fenolová, imidazolová a indolylová • crosslinky i v nukleových kyselinách (ne však v lipidech) • pomalejší vytváření crosslinků, ale rychlejší průnik do buňky (než glutaraldehyd) • toxický, potenciální karcinogén BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Permeabilizace • použití v závislosti na umístění detekované molekuly • na externí straně pl. membrány - netřeba • po fixaci aldehydy, nutnost permeabilizovat membránu, aby mohly být detekovány intracelulární molekuly • použití organických rozpouštědel nebo detergentů Blokování nespecifických vazeb nutnost vyvázání: • nespecifických vazebných míst, na která by mohla nasednout protilátka • nevymytého fixativa • polárních nebo velmi hydrofobních struktur • zvyšuje specificitu protilátky • snižuje signál z pozadí nejčastěji používané: • bovinní sérový albumin (BSA): 1-10%, • sérum (ze stejného zvířete jako II. Ab, nebo jiné než I. a II. Ab) • želatina BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Přímá a nepřímá imunofluorescence v / / 2* I řiďtinťret whítbbHrd Én1 itudy 1 AíiljSHi.«jie(it _ ■/-.I JI I' 'luf........I .inli1i:il-, wjthi li iví.,,- _3 _ i_ n c f lil nr. ti w ikk nbi rrurfl wIifif inll|i i| pj \v.-..I, l LVLl|H I lunniaiHJE «tiri«i whiinii inB^hli Ivulnl BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Dvojité značení nepřímá imunofluorescence http://www.youtube.com/watch?v=QH2GFeaGV6w Celkový postup nepřímá imunofluorescence http://www.youtube.com/watch ?v=pte06FRWo3g BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Negativní kontrola * nutné pro vyloučení falešných výsledků * vícenásobné značení - kontroly pro jednotlivé fluorochromy * použití isotypové kontroly - stejný typ protilátky s fluorochromem bez specificity * použití neznačených buněk - vyloučení autof luorescence Pozitivní kontrola * detekce „ověřeného" proteinu (tubulin, aktin) * linie s ověřenou expresí daného proteinu * transfekovaná linie s over-expresí daného proteinu HeLa: a-tubulin A431: EGFR BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Montovaní = uzavírání • uchování preparátu na delší dobu • bez přístupu vzduchu • v prostředí bránícím vyhasínání fluorescence • mohou současně označovat nukleové kyseliny (+DAPI, aj.) tuhnoucí vs. netuhnoucí montovací média * na bázi polyvinyl alkoholu (např. Mowiol) - tuhne • na bázi glycerolu (např. Vectashield) - potřeba zarámovat sklo -gel, parafín, lak na nehty.. Celkový postup nepřímého imunofluorescenčního značení - 1. část Zi-h .in hj-.vitedb. nlxPBS - poly l tfinr i*d»» 3HH mafciW kiDi <- MnUnl urll membráne FcnEMiHl <- BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. i Celkový postup nepřímého imunofluorescenčního značení - 2. část .-r-i-ir i- -.......■ Li ľ,ir I v lů J rVf_ML%#Hjre Offvprrloni M i-. ■** ? fl 1 1M | '■ í- i 1 1.^-1. tmím itt±iMÍ*v - /ty"** * & DaPi r« otw Lw, mh| BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Nepřímá vazba fluorochromu - značky navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, phalloidin.. Phalloidin • mykotoxin - obsažen v některých jedovatých druzích muchomůrek • Amanita phaíioides - muchomůrka zelená (obsah přibližně 0,01 %) • inhibice depolymerizace aktinových filament • vazba na F-aktin BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Annexin V + fluorochrom detekce fosfatidylserinu („eat me" signál) v apoptóze Phosphatidylserine "Flip" Apcp'OS.1 I aftvr Annexin V Conjugates F Apúptotic _\ Cil & m> Annexin V n> Annexin V EGFP BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3. Interaktivní materiály 'http://www.proteinatlas.org/ 'http://www.abcam.com/ 'http://wwwxell5ignal.com/index.isp 'http://www.agilent.com/en/dako-products *http://www.thermofisherxom/cz/en/home/brands/molecular-probe5thtml 'https://www.scbt.com/scbt/home/ 'http://www.sigmaaldrich.com/czech-republic.html 'http://www.protilatky.cz/ BÍS920 Fluorescenční mikroskopie - jaro 2017 - 03 / 22.3.