IHf ď (g) ^^^^fc I MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ. or w-itiy.n, ■'Jl^^. EVROPSKÁ UNIF ■ A TELOVÝCHOVY p« k™jii™™rt«*i«t ^lífA** INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem Česko republiky Osnova ■ Fluorescence v klinické praxi - přehled metod ■ Molekulární cytogenetika a fluorescence ■ Fluorescenční hybridizace in situ (FISH) ■ Využití FISH ■ Modifikace FISH * Mnohobarevná FISH (M-FISH) a spektrální karyotypování (SKY) ♦ Komparativní genomová hybridizace (CGH) • Array-CGH Fluorescence v klinické praxi ■ využívaná především jako nedestruktivní cesta označení a analýzy biologických vzorků ■ autofluorescence nebo značení s využitím fluorochromů Přístupy analýzy ■ spektrofluorimetr (kyveta/mikrodestička) ■ průtokový cytometr/sorter ■ fluorescenční mikroskop BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskop e v klinické praxi: molekulární cytogenetika Spektrofluorimetrie ■ detekce proteinu, toxinů, biomarkerů ■ detekce a měření koncentrace DNA a RNA ■ testy aktivity enzymů ■ testy toxicity, proliferace buněk Svetelný zdroj Foto násob id Excitační monoc hromátor Kyweta se zkoumaným roztokem Absorpční monothromätor Emisní mor ochroma tor Fotonásobid A 51 trogen Qubit® 3.0 BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskop e v klinické praxi: molekulární cytogenetika Spektrofluorimetr s digitálním mikroskopem Biotek Cytation 5 kombinace fluorescenční mikroskopie {+ světlé pole, fázový kontrast) a čtečky mikrodestiček {umožňuje snímat i mikroskopická skla: Petriho misky nebo kultivační láhve) ■ možnost využiti standardních fluorimetrických metod současně s automatizovanou analýzou obrazu ■ zobrazení živých buněk, snímání v čase, fenotypizace, počítání buněk/populací... SI ■ Cd Counting Cel Viability Confluence Pheftotypc Assays Live Ceil Imaging Průtoková cytometrie a FACS Fluorescence activated cell sorting ■ klinická imunologie (imunofenotypizace lymfocytů, funkční testy, stanovení produkce cytokinů, H LA typizace...) ■ hematoonkologie (imunotypizace leukémií, stanovení minimální reziduálni nemoci, třídění buněk pro následné analýzy - např. FISH) ■ nádorová a molekulární biologie (nádorové markery, proliferace, buněčný cyklus, apoptóza, léková rezistence...) Výhody ■ rychlost = vysoká frekvence analýzy částic ■ citlivost = lze analyzovat velké množství částic a detekovat i nepočetné populace Nevýhody ■ potreba buněk v suspenzi (nejčastěji živých) ■ nutnost zkušené obsluhy pro nastavení prístroje i analýzu výsledků (bez intuitivní vizuální kontroly) Zobrazovací průtoková cytometrie Imaging Flow Cytometry ■ jednotlivé částice (události) jsou snímány při průchodu kapilárou pomocí CCD kamery > pro každou částici existuje příslušný obraz —> obrazová analýza ■ kombinace výhod průtokové cytometrie (rychlost, citlivost) a mikroskopie (morfologie, lokalizace a četnost struktur...) Zobrazovací průtoková cytometrie Lokalizace transkripčního faktoru NFkB FISH chrom. 8 NON 1K.WS[.( K VI \.I> M ( 1 KAR TRANSŮM A HON OlGSOqí ;® • m i • m • • ■i 0 • < OYIRÍH ( KUS iranslceaied -I J C 1 * É Snnilanty_Diia»eI |i i* II K Vl ii ií ti i* ) i Laboratoř DNA/RNA diagnostiky DNA RNA molekulárně-genetické vyšetření klasické molekulárně-cyto gen etické BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskop e v klinické praxi: molekulární cytogenetika Vybavení molekulárně-cytogenetické laboratoře ■ fluorescenční mikroskop vybavený sadou fluorescenčních filtrů ■ citlivá černobílá CCD kamera ■ počítač a specifický software pro metody FISH, Fluorescenční hybridizace in situ (FISH) Fluorescence in situ hybridization ■ 1969 Parduová a Gali - radioaktivní značeni ■ 1986 Pinkel et al. - fluorescenční značení sondy (FISH) Hybridizace fluorescenčně značené sondy s DNA metafázních chromozomů nebo interfázních jader na cytogenetickém preparátu ■ zhotoveni kvalitního preparátu obsahující cílové místo na DNA (metafázní chromozómy interfázní jádra, tkáňové preparáty) ■ denaturace cílového místa (preparátu) ■ denaturace sondy ■ hybridizační reakce mezi sondou a cílovým místem ■ odstranění nenavázané či nespecificky vázané sondy ■ barvení pozadí ■ vyhodnocení a zpracování fluorescenčního signálu BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskop e v klinické praxi: molekulární cytogenetika Princip FISH ds l)[S A ss DIVA DNA- -- Příprava chromozómových preparátu Cílová sekvence Sonda Denaturace m I Hybridizace | Značení fluoroe hromem T Zračena sonda hybridizovaná | * | s cl lovců 5e kvenc f TTTTT ' .......HHH....... Vyhodnocení na fluorescenčním rti i kro Sk opu Zdroje DNA pro přípravu sond ■ klonované sekvence DNA inkorporované do vektorů, plazmidů, kosmidů ■ chromozomy získané FACS ■ mikrodisekce chromozomu či jejich součástí a j Značení - dle způsobu detekce sond ■ radioaktivně ■ hapteny (biotin, digoxigenin) - nepřímé značení ■ enzymy (HRP, AP) ■ fluorochromy (FITC, TRITC, Texas Red, SpectrumGreen, SpectrumOrange, SpectrurnRed, SpectrumBlue, SpectrumGold) l'i mi /n.i- i r i Ncpřimi1 niiírni nud mtd — -* *_HH w _ Fluorescenční barviva v genetice DAP I Cy3 Alexa 563 EXCITATION 420 ľ'in 460 nm ^0 nm 540 nm 580 nm 620 nm 660 nm EMISSION DFr FLUOROCHROM EXCITAČNÍ MAX. f n m) EMISNÍ MAX. (nm) BARVA FLUORESCENCE a)značení sond AMCA 350 45C modrá Fluorescein - FITC 495 515 zelená Rhodamin 550 575 červená Rhodamin - TRITC 575 600 červená Texas red 595 615 červená Cv3 552 565 červená SpectrumOrange 559 588 červená SpectrumGreen 509 538 zelená SpectrumAqua 433 480 nccrá b) barvení pozadí DAPI 355 450 modrá Hoechst 33253 356 465 ncdrá Propidium Jodid 53.0 615 červená Typy sond dle místa vazby a) Centromere Telomere probe 51n.i1- b) Whole chrom o som e Arm specific panting probe probe NOR Alu probe prebe - 1 Band specific Cloned DNA probe probe Lokusově specifické Centromerické Telomerické Celochromozomové Lokus SNRPN (Abbott Molecular) Delece v oblasti 15q 11 -q 13 vedou ke vzniku mikrodelečních syndromů Angelmannův syndrom (maternální chromozom) a Prader-Willi syndrom (paternální chromozom) o \5pli.2Dl5Zl (SpectntmGreen} I5qll-ql3 SNRPN f SpectmmCfrange) \5q22PHL 15 15q11-q13 Region i8 í ÜJ « 3 S S $ S S 5 o o 5 3 i i i i -12S expresí vzniká fúzní protein, konstitutivní kinázová aktivita > deregulace buněčného dělení a dalších procesů Translokace BCR/ABL - interfáze t(9;22)(q34;q11) Ph+ BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskop e v klinické praxi: molekulární cytogenetika Translokace SS18 - split sonda Translokace genu SS18 asociována se synoviálnim sarkomem - diagnostika Součást molekulárně patologického vyšetření - tkáňové řezy LSI S51S Dual Color, Braak Apart Rcarrangomanl Prot» _L3iS3i6..-SM'" íl if! FISH Výhody ■ nevyžaduje přítomnost mitóz (ve většině případů) - lze analyzovat buňky v interfázi i tkáňové řezy ■ rychlé (relativně) zhodnocení velkého počtu buněk Nevýhody ■ neposkytuje celogenomový pohled ■ není vhodná pro analýzu neznámých aberací FISH a její modifikace ■ FiberFISH ■ RxFISH ■ ZOO-FISH ■ Mnohobarevná FISH (M-FISH) ■ Spektrální karyotypování (SKY) ■ Mnohobarevné pruhování (M-banding) ■ Komparativní genomová hybridizace (CGH) ■ Technologie array-CGH BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskop e v klinické praxi: molekulární cytogenetika Fiber FISH Princip ■ extrakce vláken DNA z jádra —► roztěr na mikroskopické sklo > jednotlivá natažená vlákna DNA ■ jednotlivé geny jsou viditelné na základě fluorescenčních signálů ■ rozlišení kolem 1 kb a b c Technika RxFISH Cross-species color banding ■ hybridizace lidských chromozomů s celogenomovou DNA sondou odvozenou z genomu gibona {x = cross species) ■ DNA člověka - DNA gibona: 98 % sekvenční homologie, avšak u gibona se vyskytují mnohonásobné přestavby chromozomů Výsledek: ■ 18 párů s mnohobarevným vzorem (r = rainbow of colors) ■ 6 párů v jedné barvě ■ můžeme detekovat intrachromozomové přestavby RxFISH Inv 1 II II II II SS II II II 6 7 • S !■ 11 12 • « If II 21 13 1 4 IS IK 17 IS II «ft II Applied Imaging CytoVision BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskop e v klinické praxi: molekulární cytogenetika FISH v komparativní cytogenetice - ZOO FISH komparativní cytogenetika - studium evoluce lidského karyotypu založena na použití celochromozomových DNA sond, které jsou hybridizovány na chromozomy jiného druhu např. chromozom 2 u lidí - fúze chromozomu 12 a 13 u šimpanze ZOO-FISH: hybridizace DNA různých živočišných druhů n r i n l_ I- H 4 I If I- = I: N 19 It I? I I I I LI i :P" Hlť i I ■iiiiimiiiEibn 1 J > J í * + » i p ii ii il U il 11 ...... ji .-i x BHl> t WQUWU LlHUIIlimi fttj f * blianili »«itfl ri miiOia 'tilu J-JIX*:.i« rc-i"» »f™»> kn"i*(p MH hmiiiiia (www rbuwiH ikw Mull til DKUm in, wnrt » a m ul> -*o-i-.i. iu udHg tn '*b 11 ml 9 J V i«mi 1» Sw pwiM Lim tmmotf u ,«tuj u-i uwwa Hf—HUu* * I»J?piw» mu w-i TKh» rrj«« uW4 una Hiiia pmd jn*r«i skit TK« xiKUH i M W1DI inr mm** Umi iWíWí »m»wlao'm* m ten i ;*iři c*irt» M O Uimi nd BÉÉ0I riH Zfe-FISH M Mnohobarevná FISH (M-FISH) a spektrální karyotypování (SKY) ■ Speicher et al., 1996 (M-FISH), Schröck et al., 1996 (SKY) ■ vícebarevné FISH techniky - detekce více značených sond na jednom preparátu ■ v jedné hybridizační reakci simultánní vizualizace všech 22 autozomů a chromosomů X a Y v odlišných barvách kombinatorní značení - 2 fluorochromy 3 sondy (= chromozomy) 3 fluorochromy 7 sond 4 fluorochromy 15 sond 5 fluorochromů 31 sond Počet kombinací: 2N - 1 Chromosome 1 Chromosome 2 Chromosome 3 ^abe color red green intensity : green M-FISH a SKY ■ hybridizace preparátu se směsí 24 chromozómově specifických celochromozomových sond vzniklých kombinatorním značením (5 fluorochromů) ■ každá sonda je charakterizovaná emisním spektrem, které umožňuje identifikaci chromozomu 'i.n.i-CO! CJ;< ■ X 2 3 4 X b 6 X 7 a X X 10 11 1? X 13 X 14 15 16 17 18 X X 19 ^ 21 22 X X FIT C Cy3 X X X X X X X XX X X Cy3 S X x x X x x X X X X Cy5 X X X X X X X X X X Cy7 X X X X >: X X > X X 4991799479254925 M-FISH Mikroskop vybavený: ■ 6 fluorescenčními úzko pásmovým i filtry (pro 5 fluorochromů + DAPI) ■ citlivou CCD kamerou ■ specializovaným softwarem pro analýzu obrazu (napf. Lucia MFISH, MetaSystems Isis mFISH...) Postup ■ snímání jednotlivých fluorochromů ■ složení obrazu ■ počítačová analýza - dle kombinace fluorochromů přirazení pseudobarev ■ vyhodnocení BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskop e v klinické praxi: molekulární cytogenetika M-FISH Snímání jednotlivých fluórochromů, složení obrazu •w i i . *'i1 v *\ 1 I" "Z t 1 ■ ty ^ 9,-ř, «t i,4 r ,1 ať http: //www. lucia.cz/cs/front-page/lucia-rrifish M-FISH Počítačová analýza - přiřazení pseudobarev, vyhodnocení http: //www. lucia.cz/cs/front-page/lucia-rrifish Spektrální karyotypování (SKY) ■ mikroskop vybavený filtrem pro DAPI a specializovaným systémem (interferometr) pro měření spektra emitovaného světla (GenASIs HyperSpectral) ■ emise fluorochromů (Spectrum Orange, Spectrum Green, TexasRed, Cy5, Cy5.5) snímána najednou (rozdíl oproti M-FISH) ■ systém měří spektrum pro každý pixel obrazu ■ speciální počítačový program přiřadí na základě měření vlnových délek každému páru chromozomu barvu, ty se označují jako pseudobarvy GenASIs HyperSpectral (Applied Spectral Imaging ) Analýza obrazu pomocí software HiSKY Software automaticky rozliší chromosomy dle změřeného spektra a zobrazí je v odpovídajících pseudobarvách - lze snadno rozlišit chromozómové páry a případné chromozomální aberace. Automaticky sestaví karyotyp... ■ Pacientovi diagnostikován neuroblastom. Pomoci SKY detekována translokace t(11;22) specifická pro Ewingův sarkom —► změna diagnózy a léčebného protokolu. M-FISH a SKY Výhody ■ odhaleni balancovaných přestaveb ■ detekce aberaci v jednom kroku • kryptické translokace a inzerce • marker chromozomy • nadbytečný materiál neznámého původu • komplexní přestavby Nevýhody ■ vyžaduje kvalitní mitózy - vhodný materiál, metodicky a časově náročné ■ úspešná hybridizace ■ finančně nákladné ■ nelze detekovat inverze, duplikace/delece menšího rozsahu Mnohobarevné pruhování (M-banding) ■ parciální malovací sondy ze specifických oblastí chromozomu ■ fluorescenční signály jednotlivých sond se podél sledovaného chromozomu částečně překrývají a dochází k jejich kombinaci 5 BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskop e v klinické praxi: molekulárni cytogenetika Mnohobarevné pruhování (M-banding) ?, n íl * • t I 4 Í ?! Sa Ü a ♦ " "» •---* M §§ H_ u h n m n ti Chromsom 1 Chromosom 5 Chromosom 7 5,3-1 í 1-Ľ 1 3-í í 1-f ll-J 1.2- [ 3 l-[ 3.3- [ 3.2- 1.1- 1.3- U- i-15 í I- 14 13.2 -12 -11.1 r. 13.2 U -23 I ■23 3 ■312 ■32 ■33.2 ■34 ■33.2 □ DEAC □ FITC B Spectrum Orange H Texas Red □ Cy5 charakíe/izace místa zlomu ... Chromozom 5 , , v , . rozlišeni inTracnromozomovych přestaveb Komparativní genomová hybridizace (CGH) Comparative genomic hybridisation Hybridizace: metoda založená na technice FISH Genomová: umožňuje v jedné hybridizační reakci detekovat nebalancované změny v celém genomu; stanovit chromozómové změny vedoucí ke ztrátám (monozomie, delece) či zmnožení (zisky, amplifikace) sekvencí DNA Komparativní: založená na porovnávání dvou genomů BÍ8920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika Vývoj CGH byl podnícen snahou o rozvoj cytogenetiky solidních nádorů Comparative Genomic Hybridization for Molecular Cytogenetic Analysis of Solid Tumors Anne Ksllioniemi.* OlliP Kallionietni. Damir Sudar, Denis Rutovrtz. Joe W. Gray. Fre*««ior. I* datactad «rth TWO dftajrent BuorocfiromM. RegnnG Of «an ork»«ofONA»qil*X»». »uch ed h> Juki O ifMincjnon Ii. 5). Hoaevet. weh owlet-■ awttoca an hajhU knnwd; rtirv tarjrt t ajHClác (m » chnnnumt lej-ion at ■ i ihr maaxiry té the «enjmr Taa tli Vt havt dc-veli^ieJ a molecular cvr-*f neUt. method, riane-rattve «elvwuc hy hndiranm (OCH), rrur Li capable H Jr-ttrtmi and m^rin» relative [IM A ouente i.v%rt ntieaSei between (rmrnn. A tofif nutnrxT l»rr>nvpe- un he itentraird fat a tumre hi th» etmpanion .* 11MA. fnan tnalufjiant and lunal teil«. ikrrrU ■dentalvaral «fa.*» nf »ain of lo» id LINA. In ihn ir-rt■*>*>-'" •" 1 t-H. hum vi i-.-1 * vit • to ornw» i«: CGH nevyžaduje mitotickou aktivitu zkoumaných buněk - materiál pro CGH je DNA! Jednotlivé kroky metody CGH ■ príprava normálních metafázních chromozomů (od zdravého jedince) ■ izolace DNA z nádoru, periferní krve, kostní dřeně (2-3 |jg) + referenční DNA ■ značení testované a referenční (normální) DNA rozdílnými fluorochromy (nick-translace, fragmenty 600 - 2000 bp) ■ denaturace, hybridizace značené DNA na normální metafázní chromozomy ■ snímaní metafáz (10-20) citlivou CCD kamerou pod jednotlivými filtry ■ karyotypování chromozomu nabarvených DAPI ■ statistické zpracování a počítačové vyhodnocení poměrů intenzit fluorescence podél jednotlivých chromozómů pomocí speciálního programu ■ místa s vyšší či nižší intenzitou fluorescence odpovídají oblastem zisků a ztrát sekvencí DNA - profily Izolace a kvantifikace genomové DNA ■ v následujících krocích použito stejné množství testované a referenční DNA Značení (nick-translace) vzorků DNA odlišnými fluorochromy ■ obvykle testovaná zeleně a referenční červeně Smíchání ekvivalentních množství DNA a aplikace směsi na metafázní chromozomy > hybridizace ■ sondou je celogenomová DNA Princip CGH Ve směsi využita Cot-1 DNA ■ připravena z placentálni DNA ■ potlačuje hybridizaci Alu a dalších repetitivních sekvencí Fragmentace značené DNA ■ optimalizace hybridizace na metafázní chromozomy Referenčná DNA Cot-1 1 ť L v ^ ^i n 1 ■ ■ i _ Testovaná DNA piii - f I 1 T 1 I 0>> V IU,L' Cot-1 potlačuje hybridizáciu repetitivných sekvenci i t*ijijiiiijiji"iiij1Tiijiiirir~r!"i!i n 111 i i j*í rj_i_i_j ... následuje 48-72 h hybridizace, odmytí nenavázané sondy, podbarvení chromozomů pomocí DAPI a snímaní pod fluorescenčním mikroskopem. Nasnímání mitóz citlivou CCD kamerou v modrém, zeleném a červeném spektru > složený obraz ■ výrazné barevné odchylky naznačují přítomnost chromozómových aberací Ar U 11 li u ví li ft II 11 M !s Iff W T -1 * T? II 1] MHU II *a i* 11 11 * i 4» ^ II II 11 ll li 17a ii 11 II ti 11 II II II * T t 1 4 11 11 Pomocí DAPI podbarvení se na chromozomech vytvoří pseudo G-pruhování ■ identifikaci jednotlivých chromozomů - zobrazení jako karyogram Počítačová analýza obrazu: Zelená s červenou Referenční DNA Testovaná DNA I m Interpretace výsledku CGH enh -> zisky, amplifikace dím -» ztráty, delece heterochromatin zelená - zisk hranice 0,8 červená ■ ztráta výsledný poměr fluorescence hranice 1,2 18(24) č, chromozomu \ hodnota 1 počet hodnocených chromozumů BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskop e v klinické praxi: molekulární cytogenetika < .! i.j, < ( řev ish enh (15q) řev ish dim (17p, 18q3 Y) Ukázka profilu CGH zpracovaného počítačovou analýzou obrazu u pacienta s CLL Sumarizace výsledků z více vzorků B 7 B 3 10 11 12 15 20 21 22 X V Souhrny výsledek CGH u 15 pacientů s neuroblastomem Výhody a nevýhody klasické CGH Výhody ■ nevyžaduje mitózy pro testovaný vzorek ■ poskytuje přehled numerických změn v celém genomu v jedné hybridizační reakci Nevýhody ■ nemožnost využití u změn, pri kterých se nemení počet sekvencí - balancované aberace (translokace, inverze) ■ není vhodná k odlišení ploidie (normalizace) ■ možnost identifikovat jenom změny prítomné min. v 50 % buněk ■ rozlišovací schopnost 10 Mb f.y I DNA lluor«K«rK« Ajnn/nid l ' J0 —IL. I prottitbtitd vthrrí laiHHi f(u*«hfwiwi -> HR-CGH, aCGH BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskop e v klinické praxi: molekulární cytogenetika Komparativní genomová hybridizace s vyšším rozlišením (HR-CGH) Kirch hoff etal., 1997 Princip HR-CGH: ■ laboratorní postup stejný jako v případě CGH ■ odlišné vyhodnocování pomocí speciálního software - statistika! (Laboratory Imaging s r.o., Praha) ■ rozlišovací schopnost - 4 Mb ■ klonální zastoupení - 30 % i- Porovnání výsledku CGH a HR-CGH u pacienta s CLL CGH HR-CGH i i i i i j i j n. S ] 6 / řev ish enh (15q) řev ísh dim (17p, 18q, Y) řev ish enh (15q) řev ísh dim (4p, 9p, 9q12, 13q14, 17p, 18q, Y) DNA čipy skládají se z jednotlivých molekul DNA o známé sekvenci (sondy), které jsou upevněny ve shlucích (spoty) na pevném podkladu (sklo, syntetické materiály) počet spotů se pohybuje od řádově stovek do desetitisíců podle typu čipů umožňují detekci chromozómových aberací, mutací a polymorfizmu, sekvenační analýzy ale i studium genové exprese principem metody je hybridizace značené vyšetřované DNA s imobilizovanými sondami na čipu I 1 ^ 2 MICROARRAY 6 I \ / ***** w\ \ V Aplikace DNA čipů Analýza genomu ■ materiál: genomová DNA ■ array-CGH, SNP čipy, resekvenační čipy Expresní a funkčně specifické studie ■ mRNA, proteiny (napr. transkripční faktory) Epigenetické studie ■ ChIP-on-Chip (vazba proteinu/komplexu na DNA) Ch IF-oři-eriip wet-l ab porllon oí th t workflow BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskop e v klinické praxi: molekulární cytogenetika Array-CGH ■ Solinas-Toldo et al., 1997 ■ vychází z principu klasické (chromozomální) CGH ■ nahrazení chromozomů separovanými klony (BAC, c-DNA klony, oligonukleotidy) ■ duplikace, delece, amplifikace - CNV(copy number variants) ■ nedetekuje balancované přestavby Array-CGH Postup Izolace DNA Kontrola kvality, stanovení kvantity • Celogenomová amplifikace (WGA) Naštěpení DNA Naznačení DNA - fluorescence Hybridizace Odmytí Skenování Analýza dat Dostatečné množství DNA pro array CGH Málo DNA pro array-CG H WGA — Princip array-CGH o CONTROLDNA PATIENT DNA Pattern and control DNA labeled with fluorescent dyes are applied to the mi:.i ;>.ir r.iy © Patient and control DNA are hybridized to the microarray. L Hybrid«zATIOn DNA GAIN DNA LOSS NO CHANGE The fluorescent signals are measured by the micro array scanner The data is then analyzed by computer software which generates a plot. DNA DOSAGE JÍGWNCfJUEKFTlCS INC Príprava DNA čipů pro techniku array-CGH 1. Target loading 2. Assemble hybrid, chamber 5. Scanning www.agUent.corn Vyhodnocování array-CGH aCGH Analytics Software, Agilent Technologies BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskop e v klinické praxi: molekulární cytogenetika Celogenomová analýza u pacienta s neuroblastomem pomocí aCGH Genome Overview Rozlišení array-CGH 1. Velikost klonů Úseky genomové DNA vložené do vektorů BAC (Bacterial Artificial chromosome) - 50-200 kb PAC (Phage Artificial chromosome) - 75-200 kb Rozlišení ~ 1Mb DNA - 1-2 kb Pouze genové oblasti Rozlišení - 1-2 kb Oligonukleotidy - 25-85 bazí Rozlišení pod 1 kb s krátkymi nebo dlouhými oligonukleotidy v současnosti nej rozšířenějším typem, použitelné pro prakticky všechny aplikace BAC array LOSS 0: n i—i—i—i—i ■I -01 9 DJ 1 Rozlišení array-CGH 2. Rozložení a vzdálenost klonů Cílená aCGH - vybrané oblasti zájmu, Chromozomově-specifická aCGH Celogenomová aCGH ■ sondy v určitých intervalech ■ překrývající se - tilling arrays Interval Markers např. mikrodelece, mikroduplikace Tiling Resolution ratio 1 Lilt al genomic miLtujiiiyi available Mirrwmiy nana Ccvfloga Genonewce mtcroirrarB 1 or 3 Mb BAC am* l BACconepa 1 or3Mb ŕ.LÄ>;-lu,'5flCClW Qctukucs (wNWjpectmlg(nanic&«nil 33kBACa*ay 1 BAC cone p* BSfcb 1 rliscwiLrloc-idr- r*v 70 kb AgJwTl Iww.acioiiíiiůr) 3m SNP jiu> i SNP pM lOih Hwwn kiY»'-*i*T»pa.cíni] 385k diganurjeoljo» tniy 1 digaruclMKidrj pot 8 kb Nnbtogon (ww».rmtp«gerLůom) IS w IWorWOtSNParray 1 SNPpw300 «3[>rjr6kti Ahyntfiw (wwwanynwiwOTnl H n ,■ Š.:. :■: M II sjbMomarss and -\iaoaetetai Sicř*ur» tin*:™* ■yncknns irc.riT. t*w«j(gr*liir*geíKmťa.mřn( GmSena utlbnarei md ruicrcúeielH* Vysis |www.lryt*.crn| ChrcflKMfflfr Dťltiura) analy^E am) nyr-ffcrirw rgr/wf wbfdomsiBB and nwodaiabc* syrd-ume ri^pcuj (w»w.bcmgsfnbäat&Qrgí Pirna ;lt;y 1 BAC dora par 10 Mb. nigři* Wdlum Tru* Strgm kutJM* ws^y at raruosvlian Syrfl-3Tií fíCĚrli Davies et a/., 2005 Agilent Human CGH Microarray Oligo arrays 8x15K 4x44K 2x105K 1x244K custom chip 43 kb rozlišení 21 kb rozlišení 9 Kb rozlišení Nové typy - Sure Print G3 Human 8x60K 4x1 BOK 2x400K 1x1M 41 Kb rozlišeni 13 Kb rozlišeni 5 Kb rozlišeni 2 Kb rozlišeni ■ M II on 1 HRCGH negativní :.:x 190tí MK. e INK " WOK j Ě e 1SDK H 111 I'll II III III III del(1)(p36), cca 3 Mb n ■ 7^ 8x15K negativní 4x44K del(1)(p36) Array-CGH Výhody ■ přehled numerických změn v celém genomu v jedné hybridizační reakci ■ přesná lokalizace změn - vysoké rozlišení Nevýhody ■ neodhalí balancované aberace (translokace, inverze) ■ neodhalí změny ploidie (napf. tetraploidní nádor) ■ časová a finanční náročnost BÍ3920 Fluorescenční mikroskopie - Fluorescenční mikroskopie v klinické praxi: molekulární cytogenetika Molekulární karyotypování - 1000x citlivější než klasická cytogenetika ■trr|i> l'i i/p ji-kl mim lLi ■ ■! m ľ i r |i.ii .11 i-in ■ Cftogtnvticf i i ■ ■ K.l.<,.|.. " i Resolution Coverage Karyotyping >iauh Complete SKY >2Mb Complete TrarJilnnal CGH >2 Mb ictlatanJl Complete FISH {mtcrphau, 20 Kh Probe Specific FISH (mrlaphascl ^ 100 Kb Probe Specific BAC IM Kb (Special Genomics ■ 2 Mb I Complete am Germ Onhr OlfrjD (CO nm| tmu CwTipJtTlB' G. F I ti j q-e ínaty&is Elu S bI ... |,r,[, HII II II If II..... lili i I Í íl, II I I f i M « I - i u , t I - i ! ALE [ Redukuje informaci o heterogenite analyzované buněčné populace Klinická cytogenetika: Prenatální cytogenetická diagnostika Vyšetrovaný materiál ■ kultivované i nekultivované buňky plodové vody, fetální krev, choriové klky FISH AneuVysion Assay Kit (Abbott Vysis) ■ trizomie chromozomů 13, 18, 21 (Patau, Edward, Down sy) ■ vyšetření sestavy a počtu gonozomů (XX, XY) Mikrodeleční syndromy ■ DiGeorge sy (del(22)(q11.2)) Array-CGH: ■ Celogenomový screening Prenatální cytogenetická diagnostika Klinická cytogenetika: Postnatální cytogenetické analýzy Vyšetrovaný materiál ■ periferní lymfocyty, bukální stery ■ Mikrodeleční syndromy - FISH ♦ DiGeorge sy, Prader-Willi/Angelman sy, Williams-Beuren sy, 1p36 mikrodeleční sy a další ■ Původ marker chromozomu - CGH, SKY, WCP FISH ■ Identifikace a specifikace numerických a strukturních chr. aberací - CGH, SKY ■ Detekce gonozomálních mosaik - FISH (X/Y sondy) Postnatální cytogenetické analýzy DiGeorge syndrom del22q11 FISH: DiGeorge syndrom U II II um li if at .u ti lil 14 ľl 22 M •* 4» 16 17 19 XX, XY SKY: identifikace marker chromosomu (chr. 11)