ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR IV. Interkalační barviva a sondy Fluorofor – většinou heterocyklická nebo polyaromatická sloučenina, při přechodu z excitovaného do základního stavu fluoreskuje Základní stav Excitovaný stav 10-15 sec. Excitace Relaxace Fluorescence 10-9 sec. Fosforescence 10-3 sec. Zhášení nebo přenos energie Vnitřní konverze Fluorofor (F) Fluorescenční kvantový výtěžek (Fluorescence quantum yield, QY) – poměr emitovaných fotonů k absorbovaným. Molární extinkční (absorpční) koeficient – jak silně daná látka absorbuje světlo o dané vlnové délce A=εcl Fluorofor (F) Intenzitafluorescence Vlnová délka [nm] Stokes shift Excitace Emise Stokesův posun; Jablonského diagram 350 400 450 500 550 600 650 S’1 Základní stav Excitace Absorpce S1 S0 S’1 →S1 Disipace části energie Přechod z S1 do S0 a emise fluorescencehυex hυem Jablonského diagram Zhášení – quenching • Redukce QY (quantum yield) v daném fluorescenčním ději • Absorpce nebo disipace energie – návrat fluoroforu do základního stavu bez emise fluorescence Proximální zhášení – kolizní quenching • Fluorofor velmi blízko zhášeče – přenos energie z F na Q ve formě tepla – nenastane žádná fluorescence • Proximální zhášeče: molekulární kyslík, Cu2+, Mn2+, NO3- http://www.etswebsite.be/ Quenchers – Zhášeče (Q) Základ řady experimentálních metod v biochemii a molekulární biologii • Přenos energie z donorové na blízkou akceptorovou molekulu, donor se vrací do základního stavu bez vyzáření fluorescence; akceptor vyzáří energii ve formě fluorescence • Emisní a absorpční spektra se musí překrývat • Főrsterova vzdálenost obv. 100Ǻ • Energie, kterou donor vyzáří nebo předá musí být dostatečná k excitaci akceptoru • Příklad: FAM-TAMRA, DABCYL, BHQ hυ ex hυ ex hυ em hυ em FRET Fluorescenční rezonanční energetický transfer (FRET) Nejčastěji používané fluorofory Multiplexní reakce • Detekce dvou nebo více targetových sekvencí v jedné reakci (simultánní amplifikace) • Dva nebo více setů primerů • Dva nebo více fluoroforů (FAM, VIC) Detekce amplikonu Specifická vs. nespecifická detekce amplikonu Nespecifická – Interkalační barviva – Quencher Labeled Primers – LUX Primers – Amplifluor Specifická Lineární sondy – ResonSense, Angler Probes – HyBeacons – Light-up probes – TaqMan sondy (Hydrolyzační sondy) – Lanthanidové sondy – Hybridizační sondy – Eclipse – Displacement Hybridization/Complex Probes Strukturní sondy – Molekulární majáky – Scorpions – Cyclicons – Nanoparticle Probes – Konjugované polymery a PNA sondy Nespecifická detekce množství amplikonu – Interkalační barviva – Quencher labeled Primer – LUX Primers – Amplifluor 1. Interkalační barviva Reverzibilní vazba na dsDNA • Relativně levné • Citlivé Nevýhody: • Některá barviva se váží na ssDNA • Nespecifická vazba na jakoukoli dsDNA (primer dimery) • Pečlivý návrh primerů a extenzivní validace, disociační křivky http://www.uic.edu/depts/rrc/cgf/realtime/melt.html Melting curves Melting Curve for Standard Curve Samples in Real Time for GAPDH Melting curves Derivative Melting Curve for Standard Curve Samples in Real Time, GAPDH Endogeneous Control Tm of amplicon 82.5C No contamination Melting curve Primer dimer NO RT CTRL – kontaminace gDNA Ethidium bromid 30ti násobný nárůst fluorescence po vazbě na dsDNA Nepravidelná vazba na DNA Qy = 0,15 Mutagen  SYBR Green SYBR Green II SYBR Gold YO (Oxazole Yellow) TO (Thiazole Orange) PG (PicoGreen) >1000 násobný nárůst fluorescence Rovnoměrná vazba na DNA Qy = 0,60 Bezpečný Interkalační barviva A) SYBR Green B) Ethidium bromide Interkalační barviva DNA Detection: SYBR Green I Dye DENATURATION STEP: DNA + PRIMERS + DYE WEAK BACKGROUND FLUORESCENCE ANEALING STEP:DYE BINDS dsDNA, EMITS LIGHT EXTENSION STEP: MEASURE LIGHT EMMISSION qPCR: SyBr Green  Binds minor groove of doublestranded DNA.  Product can be further tested in a post-amplification melt curve in which sequences have characteristic melting temperatures. 2. Quencher Labeled Primers Použití dvou odlišných molekul PNA (peptide nucleic acid) označenou na C konci zhášečem DABCYL (Q-PNA) + Primer se specifickou sekvencí na 3’ konci a fluoroforem a PNA komplementární sekvencí na 5’ konci Fluorescence udává množství primerů hybridizovaných k templátu /amplikonu plus množství fluorescenčně označených dsDNA amplikonů Real-time i end point Primer >25bp se zhášečem na 5’ konci (QSY 7, QSY 9), Molecular Probes- Invitrogen QSY 7/QSY9 zháší fluorescenci interkalačního barviva (SYBR), které se může vázat na primer dimery nebo primer samotný Po prodloužení řetězce není již fluorofor zhášený Redukce pozadí/ nespecifických signálů QSY 7 2. Quencher Labeled Primers 3. LUX Primery Light Upon eXtension – Invitrogen • Reverse nebo forward primer označený fluoroforem. • Ve vlásenkové konformaci zhášený. Druhý primer je neoznačený. • Po inkorporaci do dsDNA je zhášení uvolněno a emitována fluorescence 4. Amplifluor • 3 typy primerů - Dva specifické pro amplifikovanou sekvenci a jeden tzv. UniPrimer • Jeden ze specifických primerů obsahuje univerzální (Z) sekvenci na 5’ konci, druhý není nijak modifikovaný • 3’konec UniPrimeru je komplementární k Z sekvenci prvního primeru, zbytek směrem k 5’konci tvoří vlásenku označenou fluoroforem (FAM) a zhášečem (DABSYL) • výhoda: každá PCR může být snadno adaptována na Amplifluor PCR, začleněním Z sekvence na 5’konec jednoho z primerů • možnost použít dva různě značené UniPrimery s konci komplementárními k odlišným Z sekvencím – SNP analýza/alelická diskriminace UniPrimer http://www.genxpress.at/ Amplifluor Specifická detekce množství amplikonu Lineární sondy –ResonSense, Angler Probes – HyBeacons – Light-up probes – Hydrolyzační sondy – Lanthanidové sondy – Hybridizační sondy – Eclipse – Displacement Hybridization Probes Strukturní sondy – Molekulární majáky – Scorpions – Nanoparticle Probes Lineární sondy 1. Reson Sense & Angler Probes – urychlení qPCR - optimální fluorescenční signál již po 5 sec. v annealingu – DNA interkalátor (SYBR Gold) – FRET donor + sonda specifická k jedinému amplikonu – FRET akceptor (Cy5 na 5’konci) – buď volně (ResonSense) nebo připojena k primeru linkerem (Angler Probe) – DNA polymeráza bez exonukleázové aktivity v případě ResonSense – Pokud není přítomná cílová sekvence, nebo během denaturace, není SYBR a Cy5 v dostatečné blízkosti aby došlo k FRET a emisi fluorescence – kvantitativní PCR i alelická diskriminace (více různě značených sond) ex 495nm em 537nm ex 495nm em 695nm SYBR gold SYBR gold cy5 FRET www.dstl.gov.uk 2. HyBeacons www.lgc.co.uk • Velmi jednoduchý princip i design • Sonda emituje fluorescenci pouze v duplexu s DNA • P na 3’OH konci – není volná OH skupina pro polymerázu • Snímání fluorescence v annealingovém kroku • Bez nutnosti FRET, návrhu sekundární struktury nebo enzymatického štěpení • Rozlišení blízce příbuzných sekvencí na základě Tm umožňuje detekci SNP i kvantitativní analýzu 3. Light Up Probes • Podobné HyBeacons • PNA s konjugovanou thiazolovou oranží (asymetrické cyaninové barvivo) • PNA neinterferuje s PCR • Nízká fluorescence volné sondy – nárůst po vazbě k DNA (annealingový krok – snímání fluorescence) • SNPs (jediná báze) 11mM LUP2 55mM TCCTTCATTCGCTTC LUP2 nekomplementární LUP2 Lys1-TAGCTGCT-- --CO-(CH2)5-TO-N 55mM ATCGACGAGACAGCTGGCGA LUP2 komplementární Svanvik et al. 2000. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry 281, 26–35 . Light Up Probes 4. Hydrolyzační sondy (TaqMan Probes) • 5’ nuclease assay • Velmi populární design a univerzální použití • Fluorofor na 5’, zhášeč na 3’ konci (snadná syntéza) • 5’-3’ ds exonukleázová aktivita DNA polymerázy • F-Q – FRET (TAMRA) nebo emise tepla (BHQ) • Pokud je přítomen templát, sonda se komplementárně váže na cílovou sekvenci – annealing • Hydrolýza sondy během extension fáze PCR (rozdíl od předchodzích) , uvolnění fluoroforu a ireverzibilní emise fluorescence • Nenavázaná sonda zůstává intaktní a nedochází k fluorescenci • Je nutné sladit annealingovou teplotu proby s optimální teplotou polymerázy F Q F F F Q Q Q • Sloučení annealingového a extension kroku do jediného, obvykle 8-10°C pod Tm sondy (60-62°C) • Kvantifikace, SNP, alelická diskriminace atd. • Multiplexní reakce 5. UPL sondy • Podobné TaqMan sondám • Sekvenčně specifický pár primerů + semiuniverzální sonda - knihovna • Do sekvence sondy začleněna Locked nucleic acid (LNA) – zvyšuje teplotní stabilitu – Tm 6. Lanthanidové sondy • varianta hydrolyzačních sond (TaqMan) • fluorescenční značka – lanthanidové cheláty (terbium, europium) s molekulami, schopnými absorpce UV – úzké emisní spektrum • zhášeny ssDNA – řádový nárůst fluorescence po hydrolýze sondy • time resolved FRET – odečet fluorescence po určité době od excitačního pulzu – snížení fluorescence pozadí • další snížení zbytkové nespecifické fluorescence pomocí krátké sondy se zhášečem – do cyklu je zařazen krok 35°C kdy se váže sonda se zhášečem na nenavázanou reportérovou sondu • kombinace s klasickými fluorofory 7. Hybridizační sondy • dva oligonukleotidy, navržené tak, aby hybridizovaly na templátu vedle sebe • fluorofory tvořící FRET pár • pouze po úspěšné hybridizaci dojde k emisi fluorescence Sondy nehybridizují v dostatečné blízkosti – nedojde k FRET × signál FRET Emise fluorescence Emise fluorescence signál • kvantifikace, genová exprese, SNP 8. Eclipse • Lineární sondy, podobné TaqMan • 3’ konec – fluorofor, 5’ MGB protein a zhášeč • Nejsou hydrolyzovány Taq polymerázou • Pokud není Eclipse sonda hybridizována k templátu, zaujímá konformaci, ve které jsou fluorofor a zhášeč v těsné blízkosti • Přítomnost MGB zvyšuje účinek zhášeče – redukce fluorescence pozadí a umožňuje konstrukci kratších sond s vyšší Tm 9. Displacement Hybridization/Complex Probes • v reakci kromě sondy a templátu je navíc kompetitor • kompetitor blokuje nespecifickou hybridizaci sondy k podobným sekvencím, ale nezasahuje do hybridizace mezi přesně odpovídajícím templátem a sondou • SNP – diskriminace rozdílu i v jediné bázi • fluorescence se měří v annealingové fázi Strukturní sondy 1. Molekulární majáky/ Molecular beacons • vlásenková struktura, konce jsou vzájemně komplementární; smyčka je komplementární k cílové sekvenci • konce označeny fluoroforem a zhášečem • ve vlásenkové konformaci je fluorescence zhášena • po vazbě na komplementární templát dochází k emisi fluorescence • fluorescence je odečtena v annealingovém kroku • po zvýšení na extenzní teplotu, sonda disociuje a nebrání polymeraci • Stratagene 1a. PNA Molekulární majáky • Klasické majáky špatně hybridizují ke komplementární ssDNA v roztocích o nízké iontové síle, poměr signál/šum je různý, ale zvyšuje se s rostoucí iontovou silou • „stemless“ majáky výborně hybridizují i za nízkých koncentrací solí, ale mají nízký poměr signál/šum • PNA „stemless“ majáky kombinují výhody obou systémů • Výhody: - Neobsahují jiné sekvence než komplementární k cílové molekule  výrazné urychlení kinetiky reakce - Rezistentní k nukleázám - Necitlivé k přítomnosti DNA vazebných proteinů - Účinné i v nízké iontové síle a při vyšších teplotách 2. Scorpion primers • kombinace sondy a primeru v jediné molekule • nedochází k enzymatickému štěpení – rychlejší proces • poměr amplikonů a hybridizovaných sond (tedy i fluorescence) 1:1 • vlásenková struktura - sonda (specifická sekvence) kovalentně vázaný primer • PCR blocker – zabraňuje replikaci sekvence sondy a tedy i nespecifickému fluorescenčnímu signálu • zhášení fluoroforu je zajišteno separátním oligonukleotidem • Nízké pozadí • Rychlá analýza • Jednoduchý design • SNP – vysoká citlivost • Multiplex • Jednoduchá příprava Scorpion primers • Hybridní materiály složené z biomolekul (oligonukleotidy) a anorganických látek – např. zlaté koloidní nanočástice • kovové clustery – efektivní zhášeče • hybridní konjugát – ssDNA oligonukleotid, 1,4nm zlatá nanočástice a fluorescenční barvivo • 5’ a 3’ konce oligonukleotidu jsou vzájemně komplementární, struktura podobná molekulárnímu majáku Nevýhody • Nižší citlivost – řešení změna velikosti nanočástic, • Změna absorpčního spektra v závislosti na vlnové délce • Vazba Au-DNA 3. Sondy založené na nanočásticích (nanoparticles probes) Au nanoparticle