U VOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR V. Návrh primem a sond Design primerů a sond Hybridizace • Úspěšný annealing sondy a primerů je kritický předpoklad úspěšné PCR - Sekvence - Koncentrace solí - Tvorba heterodimerických stabilních struktur - Párování bazí - nejen Watson a Crick - Sekundární struktura - Teplota tání DNA Tm Design primerů a sond Melting temperature Tm I •jeden z nejdůležitějších parametrů, determinující annealingovou teplotu • Tm - teplota, při které je 50% daného oligonukleotidu denaturováno • „cooperativní melting" - usnadněná denaturace po disociaci prvního páru bazí • Sekvence: A=T < G=C • Rychlost renaturace (a tedy i Tm) přímo úměrná délce řetězce a jeho koncentraci a nepřímo úměrná komplexitě molekuly (struktura) • Elektrostatické interakce mezi fosfátovýnmi molekulami • kationty maskují + náboje fosfátů - vyšší iontová síla vede k vyšší Tm Oligonukleotidy kratší než 20bp 100 Tm = 2 x (A+T) + 4x (G+C) % ss Iontová síla, %GC a délka řetězce (N) 50 Tm=81,5+16,6 (log10[Na+]+0,41 (%GC)-(625/N) Web-based kalkulátory http://inSiliCO.ehU.eS/tm.php Tm Temperature Design primerů a sond Melting temperature Tm 100 * 80 I 60 + 40 ■ c 'c (u ' 20 C3 60 Tm lower in lower salt concentration Tm higher in higher salt concentration 90 °C 100 110 GCTATTCAACTGAAGAGGGCACAGC GCTATT GAACT GGAGAGGGGACAGC CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG CGATAAGT T GACT T CT CCCGT GT CG Tm - 25( >T m T - 25' 1 m >T m GCTATTCAACTGAAGAGGGCACAGC CGATAAGTTGACTTCTCCCGTGTCG GCTATTCAACTGAAGAGGGCACAGC CGATAAGTTGAC_TCTCCCGTGTCG T note: T * is 4° lower than T m m (In general, there is a 1° drop for every 1 % mismatch) Design primerů a sond Gibbsova (volná) energie a její změna (AG, AG0) •Schopnost látek jít do reakce •Sekundární struktura DNA • AG závisí na změně vnitřní energie a entropie • Změna volné energie AG° (množství energie uvolněné nebo absorbované během reakce za stejné teploty a tlaku) - spontánní reakce - AG<0 • Znalost termodynamického příspěvku párování bazí, mismatches, volných konců, vlásenkových struktur a smyček - predikce parametrů hybridizace • Predice sekundární struktury - nearest neighbor - helix initiation factor (GC/AT) - helix propagation energie nutná pro vytvoření následujícího hybridizačního páru - symetrie sekvence (duplexu) - Loop regions - smyčky, vlásenky, výdutě atd. Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu 1. Počet odpovídajících párů bazí - Kombinace vodíkových můstků a hydrofobních interakcí - Pozice a typ neodpovídajícího páru (mismatch) 2. Sekvence - nearest neighbor 3. Sekundární struktura - Charakter cílové sekvence - Kompetice primem nebo sondy s komplementárním řetězcem cílového duplexu 4. Volné konce - Interakce mez 5' a 3' konci hybridizovaného oligonukleotidu a nejbližší sousedící báze - Příklad: AG° (GC) -0,96kcal/mol AG° (AT) -0,50 kcal/mol AG° W-C (TA/AT) -0,58ckcal/mol AG° W-C (GC/CG) -2,24 kcal/mol GTAGACAATCTCCATCTCCTATCCTGATTAGAG GTTAGAGGTAGAGGATAGGA Faktory ovlivňující stabilitu DNA DNA/RNA duplexu 5. Iontová síla - Koncentrace iontů, zejména Mgll+ - Kationty kompenzují negativní náboj fosfátových skupin a usnadňují formování duplexu - Stabilita duplexu (Tm) je úměrná koncentraci iontů 6. Teplota - Se stoupající T je udržení duplexu energicky náročnější, po překročení určité T je preferována ssDNA- vyšší entropie celého systému Není tedy nutná shodná Tm, ale shodná účinnost hvbridizace obou primem. Primery se stejnou Tm, ale rozdílnou AG°, mohou vykazovat rozdílnou úspěšnost při tvorbě duplexu než primery s odpovídající AG°. Design primerů • Optimálně: primery jejichž 5'konce tvoří stabilní duplex, AG° <10 kcal/mol/37°C • Plynulý přechod AG° směrem k 3'konci až k cca -6kcal/mol. • Eliminace misprimingu (vzniklého hybridizací pouze 3'konce) • Vyloučení repetitivních oblastí, které mohou tvořit sekundární struktury • Komplementarita primerů - primer dimery • Specifita - hybridizace k jedinečnému místu v genomu (BLASTn) Vliv reakčního prostředí - i ideálně navržené primery mohou měnit své vlastnosti v závislosti na použitém PCR pufru a dalších parametrech PCR -vždy je nutná optimalizace jednotlivých PCR CCOCATGCTTí "ACAAGQAAGT j Region of DNA to ^ be amplified by PCR ATCCTATGGTTGTTTGGATGGGTG are j Design sond • Různý design podle toho, zdaje cílem kvantifikace DNA, mRNA nebo provedení alelické diskriminace nebo SNP • Použitá chemie • Detekce DNA, RNA nebo obou zároveň? Rozlišení HIV RNA od DNA začleněné do genomu • Kombinace fluoroforu a zhášeče • Modifikace sondy - LNA, PNA, MGB atd. • Multiplex assay Design hydrolyzačních sond • qPCR TaqMan - dvoukrokový proces - denaturace a annealing/extension • Co nejnižší Ct a nejvyšší AR (ARn) • Umístění 5' konce sondy v rámci stanovované sekvence co nejblíže 3' konci jednoho z primem - účinné štěpení sondy • Optimální délka do 30 nukleotidů, obsah GC do 30% • AT bohaté sekvence - začlenění LNA, PNA nebo MGP • G - účinný quencher • Minimum repeticí, zejména GGGG, začlenění inosinu do repetice řeší tento problém • Tm proby od 10°C vyšší než Tm primem Design hybridizačních sond (Lightcycler probes) Sondy by měly být umístěny co nejdál od primeru 5' - odečet fluorescence v annealingové fázi GC 50% Každá sonda má délku 23-35bp Sondy o stejné Tm - musí se vázat současně ; Tm sond o 5-10°C vyšší než Tm primem 3' konec akceptorové sondy fosforylován Donor FAM, akceptor Cy5 nebo Lightcycler Red 640/705 Vzdálenost mezi sondami 1-5 bazí (zajištění FRET) Template DNA I M M M M- Exci tatton lor donor (U 7? TD u. I FRET IUI.....I JU"...... Emission by acceptor Detection 'm Temperature Design molekulárních majáků Vazba majáku ideálně uprostřed amplikonu Tm komplementárních ramen o 7-10°C vyšší než Tm primerů Délka do 39 bp - omezení sekundárních struktur Design scorpion primers PCR Product-Specific Nucleotides Fluorescent Reporter Dye R Quencher Dye Sonda připojena k 5' konci primerů a je komplementární k nově syntetizovanému řetězci • vlastní hybridizace sondy je intramolekulární událost • 17-27bp; Tm sondy i>:n :i)'Wt*ľ «Mf'niln fini ar G*n »*1H(*iCiMí' >lľ^t" irniirriiiB[- -lilii rírmiinnmr Uouir tttwcrin «otrirapd+wtli un jjir^wm ■ ■ #h riptrn ni Mow >*• *rfwi all»" rifcT* ml ;-z: -:rz u b Hfl f HO I « MOTU. ■ l4>t| Hm n-1 6* BttOi . Pít™ F -pHWHjfc->WP*5FrjjL 1 vjřoCKMUl.t ť tj-jr), TTriT^rW Ir.n.HTm. PCB w* ptf «M CMJB1 iVwíllUIÍUtrtf lil I IIMÍJ p.nio^ iiRUJiF ai.TTrNf >*ř: 3nnwrati[,r)hiii hrr»p-*nniii ma Real Time PCR Primer Sets Validated Primer Sets for Quninitnthe Real Time PCR Are you normalizing gene expression to just one housekeeping gene? Set of 10 Validated Housekeeping Gene Primer Sets - Only S79.95 Available atwww.realtimeprimers.com ľonftgu™ Ssquanea ritaitiLj-AB C1 ltd ft ai tí träíTi i, u RPJ| Tin,- arn ftp I ľťBP, (Veen Pibners 11 Hybridiŕalion Piobes | Hydrolysis Piobes j Mo lobular (Jeaeons | ^ur>mir rrimcr&ri rotxsc Linke QPPD Home Search Primer tik Design primerů a sond Design primerů a sond- web resources primer tool Primer 3 http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3 www.cqE Primer Express http://www.appliedbiosvstems.com H,J>*ii.|w»i«n4»>;l«n«r^,»« —.Mi—--ifci«.,—Jicu Premier Biosoft International http://www.premierbiosoft.com l^lrTiJ Pntľ ťHlMi LUhUM Com!« " (V10 y«r hub lU-'ä M.-. ■ Mala Ol P...-.I r. \t» i* Ud PREMIER Biosoft International HOME COMPANY PRODUCTS SERVICES DOWNLOAD ORDERING Software to Accelerate Research in Life Sciences ü AllelelD® ■ Real Time PCR & Microarravs Array Designer ■ Micro arrays EJ Beacon Designer™ ■ Real Time PCR Oliao Design PrimerPlex • Oliao Desian for xMAP® Based Multiplex Systems i.—i m Primer Premier • PCR. Primer Desian 9 SimGlycan™ ■ MS/MS Data Analysis SimVector ■ Draw Plasmid Maos Bt Plan Clonina Experiments TMA Foresight ■ Tissue Hicroarrav Data Analysis e Xpression Primer ■ Taaaed Primer Desian Design primem a sond Návrh primem a TaqMan sond - Primer Express 61 121 181 241 301 3 61 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 / clij XĽel = rrUĽti:JTIJ:47741^rr 1090. .5-1143 /gene="FQS" /gene_synonym-" AP-1" /gene_synonym="C-FOS" /stanclard_naTňe=rrBP2 5GG15A10G9rr /db xref = rrUniSTS:5jL921Brr atgatgttct tccccggccg ggctcgcctg attcccacgg ctcgtctcct ccctccgctg cagagcattg agaatccgaa ct.gact.gata accgagattg cgacctgcct cttgatctga ctgcctctcc agcatggagc agtggctctg gcagactggg gagcccctgt ttcgtcttca ggcagcagca tga cgggcttcaa gggatagcct tcaacgcgca tcactgccat ctgtggcccc gggcttactc gcaggagggg gggaaaggaa cactccaagc ccaacctgct gcaagatccc ctgggggcct tcaatgaccc tgaagaccga agacagcccg agcctctgca gcactccggt cctaccccga gcaatgagcc cgcagactac ctcttactac ggacttctgc ctcgaccagt atcgcagacc cagggctggc caaggtggaa taagatggct ggagacagac gaaggagaag tgatgacctg gccagaggtt tgagcccaag gccctttgat ctccgtgcca cagtggctcc ggtcacctgt ggctgactcc ttcctctgac gaggcgtcat cactcacccg acggacctgg ccggacctgc agagcccctc gttgtgaaga cagttatctc gcagccaaat caactagaag gaaaaactag ggcttcccag gccaccccgg ccctcagtgg gacttcctgt gacatggacc ctggggatgg actcccagct ttccccagct tcgctcagct cctcccgctg cagactcctt ccgtctccag agtggctggt accctttcgg ccatgacagg cagaagaaga gccgcaaccg atgagaagtc agttcatcct aagagatgtc agtctgagga aacctgtcaa tcccagcatc tatctgggtc ggcccatggc gcactgctta gtgcagctgc cacccacgct cagcagcgcg ctccagcatg tgccaacttc gcagcccgcc agtccccgcc aggccgagcg agagaaaagg gaggagggag tgctttgcag ggcagctcac tgtggcttcc ggccttcacc gagcatcagc atccaggccc cttctatgca cacagagctg cacgtcttcc ccaccgcaag gctggccctg Disclaimer | Write to the Help Desk NCBI | NLM | NIH Primer Express® Software for Real-Time PCR Version 3-0 CCopyrighl 2004. Applied Biosyslems. All rights reserved. ĚŠÍ Primer Express 3.0 File E dit View T cols Window Help £TöqMan®MGB Quantification # 1 Sequence!] Parameters Primers I Probes| Order| 0) File Nome | @ ► ■ ■ -H-l 1144 □ Double Stranded ...............T....... □0® Iatgatgttct IcAGCAGCGCG IcAGACTCCTT acggacctgg ctcgaccagt CTGTGGCCCC ccctccgctg aggccgagcg cagaagaaga gcagccaaat GGAGACAGAC ccaacctgct IcGACCTGCCT tgtggcttcc agtctgagga ccctcagtgg gccctttgat Iagacagcccg gcagactggg cgggcttcaa tccccggccg ctccagcatg ccgtctccag ccggacctgc atc gc ac-ac c gggcttactc cagagcattg agagaaaagg gccgcaaccg caactac-aag gaaggagaag gcaagatccc cttgatctga ggccttcacc aacctgtcaa gacttcctgt ctccgtgcca agcctctgca cgcagactac gggatagc ct ggctcgcctg tgccaacttc agtggctggt agagcccctc cagggctggc gcaggagggg agaatccgaa gaggagggag atgagaagtc gaaaaactag tgatgac ctg ctgggggcct ctgcctctcc gagcatcagc tcccagcatc gacatggacc cagtggctcc gaggcgtcat ctcttactac tcaacgcgca attcccacgg gcagcccgcc accctttcgg gttgtgaaga caaggtggaa gggaaaggaa ctgactgata tgctttgcag agttcatcct ggcttcccag gccagaggtt tcaatgaccc agcatggagc atccaggccc tatctgggtc ctggggatgg cctcccgctg cactcacccg ggacttctgc tcactgccat ctcgtctcct agtccccgcc ccatgacagg cagttatctc taagatggct cactccaagc accgagattg ggcagctcac aagagatgtc gccaccccgg tgagcccaag tgaagaccga agtggctctg cttctatgca ggcccatggc 11' i. 150 200 250 300 350 400 450 500 550 650 700 750 '.' 900 950 To find Primers & Probes, click the "Find Primers/Probes" button Design primerů a sond v: Sa TaqMan® MGB Quantification U 1 I Sequence|! Parameters; Primers / Probes II Order 1 Parameter Value Min Primer Tm 58 Max Primer Tm SO Man Difference in Tm of Two Primers 2 g Primer GC Content Min Primer %GC Content 30 Man Primer %GC Content 80 Max Primer 3' GC's 2 Primer 3' End Length 5 Primer 3' GC Clamp Residues 0 g Primer Length Min Primer Length 9 Man Primer Length 40 Optimal Primer Length 20 g Primer Composition Man Primer G Repeats 3 Max Num Ambig Residues in Primer 0 g Primer Secondary Structure Man Primer Consec Ease Pair 4 Man Primer Total Ease Pair 8 g Primer Site Uniqueness Man % Match in Primer 75 Man Consec Match in Primer 9 Man 3' Consec Match in Primer 7 |g Probe Tm Min Probe Tm 68 Man Probe Tm 70 g Probe GC Content Min Probe %GC Content 30 Man Probe ZGC Content 80 g Probe Length Min Probe Length 13 Man Probe Length 25 0 Probe Composition Man Probe G Repeats 3 Man Num Ambig Residues in Probe 0 No G at 5' End in Probe 0 Select Probe with more C's than G's □ 0 Probe Secondary Structure Man Probe Consec Base Pair 4 Man Probe Total Ease Pair 8 3 Arnplicon Min Amplified Region Tm 0 Max Amplified Region Tm 85 Min Amplified Region Length 50 Man Amplified Region Length 150 3 General Man Primers 1 Probes 50 Design primerů a sond iTaqMan® MGB Quantification # 1 Sequencej Parameters] Primers ! Probes [ Order | 0 [-Candidate Primers Si Probes— [ft [[FwdStart ][FwdStop ][FwdLen... jfFwdTm ][ Fwd ZGC ~~][ Fwd Seq ][RevStart [[RevStop ] [Řev Len... [fRevTrn ][ Rev %GC ~][ Rev Seq [[Probe 1 162 181 20 58 |55 CGTCTCCA... 217 199 19 58 63 GGTCCGGA... 183 2 161 180 20 59 60 CCGTCTCC... 217 199 19 58 63 GGTCCGGA... 182 3 161 180 20 59 60 CCGTCTCC... 217 199 19 58 63 GGTCCGGA... 183 4 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 5 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 6 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 809 790 20 59 55 TCAAAGGG... 765 7 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 8 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 9 800 822 23 60 48 AGCCCTTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 10 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 11 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 12 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 791 20 58 50 ATCAAAGG... 765 13 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 14 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 15 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 810 790 21 59 52 ATCAAAGG... 765 16 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 17 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 18 799 821 23 60 48 GAGCCCTT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 19 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 20 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 21 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 811 792 20 58 55 CATCAAAG... 765 22 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 820 23 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 820 24 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 821 25 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 821 2G 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 822 27 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 827 28 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 828 29 798 818 21 59 52 CGAGCCCT... 864 847 18 59 67 GGAGCGGG... 829 30 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 812 793 20 58 50 TCATCAAA... 765 31 745 762 18 58 61 CCCAAGCC... 812 793 20 58 50 TCATCAAA... 765 < Nil > [TjClick to show Locations [F]Click to show Secondary Structures Design primerů a sond Name Value 0 Forward Primers Total primers tested: 35792 GC test passed: 35149 Ambiguity test passed: 963 Clamp test passed: 963 Tm test passed: 963 Avoid Excluded regions test passed: 963 Repeat test passed: 900 Self compare test passed: 741 Limit GC test passed: 214 Sequence compare passed: 84 Reverse sequence compare passed: 83 □ Reverse Primers Total primers tested: 35296 GC test passed: 34657 Ambiguity test passed: 946 Clamp test passed: 946 Tm test passed: 946 Avoid Excluded regions test passed: 946 Repeat test passed: 861 Self compare test passed: 703 Limit GC test passed: 205 Sequence compare passed: 95 Reverse sequence compare passed: 95 □ Primer Pairs Total pairs tested: 7885 Amplicon Length test passed: 691 Avoid Excluded regions test passed: 691 Tm Difference test passed: 691 Amplicon Tm test passed: 630 I-.....rM - ■.......■ ■1 r -■ ■ - - 0 TaqMan Probes Total probes tested: 14450 GC test passed: 14128 Ambiguity test passed: 1178 Tm test passed: 1178 Avoid Excluded regions test passed: 1178 Repeat test passed: 1126 Self compare test passed: 1076 Sequence compare passed: 475 Reverse sequence compare passed: 458 Probe start test passed: 351 Design primerů a sond A| B C 1 D 1 E 1 F 1 1 > 1 K 1 L M NO P Q 1 R S 1 T 1 U 1 V 1 W 1 X 1 Y 1 ff |Fwd Start FwdStop Fwd Length FwdTm Fwd%GC Fwd Seq Rev Start RevStop Rev Length Rev Tm |Bev%GC RevSeq ProbeStart ProbeStop Prcbe Length PrcbeTm Probe%GC ProbaSaq AmpTm Amp%GC AmpTa Amp Len Penalty 2 l| 1G2 131 201 5s| 55 CGTCTCCAGTGCCAACTTCA 217 19\ 5s| 63 GGTCCGGACTGGTCGAGAT 133 137 151 591 67 TCCCACGGTCACTGC 84| 6l| 62| 5e| 3l| 3 2 161 ISO 20 59 60 CCGTCTCCAGTGCCAACTTC 217 ĽíŠl 13 58 63 G GTCCG GACTG GTCG AGAT 132 137 16| 69 63 TTCCCACGGTCACTGC 85 61 62 57 36 4 3 iei ISO 20 59 60 CCGTCTCCAGTGCCAACTTC 217 lŠŠ] 13 58 63 GGTCCGGACTGGTCGAGAT 133 137 ÍŠ] 69 67 TCCCACGGTCACTGC 85 61 62 57 36 5 - 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 809 790\ 20 59 55 TCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 780 16 63 50 TGTCAAGAGCATCAGC 83 57 61 65 77 e 5 74S 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 809 790 20 59 55 TCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 731 17 69 47 TGTCAAGAG CATCAGCA 83 57 61 65 77 7 G 74S 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 809 790 20 59 55 TCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 782 13 69 50 TGTCAAGAG CATCAGCAG 83 57 61 65 77 7 800 822 23 60 48 AGCCCmGATGACTTCCTGTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 844 13 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 84 60 62 65 80 9 3 800 822 23 60 48 AGCCCmGATGACTTCCTGTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 828 845 13 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 84 60 62 65 80 10 3 800 745 S22 ■jsi 23 i n 50 4S 61 AGCCCTTTG ATfl acTTCCTflTTC CCCAAG CCCTCAGTG GAA Rfid S10 791 in 20 5S 67 50 ATCAAAG G G CTCG G TCTTCA _823. 765 nat 7S0 17 16 ffl 68 fff 50 TCATCCAGGCCCAGTGG TG TCAAG AG CATCAG C S4 S3 &: 56 £2 EZ 65 66 80 S2 12 11 7-5 ?£2 18 58 Gl CCCAAGCCC 1 cAJJ 1 títí AA S1U -79T -20- -SB- -SO ATCAAAGGGCTCGGTCTTCA- -765" -7BT -rr -E3" A) 1 U 1 UAALiAlj UAI UALi UA S3 56 60 66 32 13 12 745 762 18 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 810 791 20 58 50 ATCAAAG G G CTCGGTCTTCA 765 782 13 69 50 TGTCAAGAG CATCAGCAG 83 56 60 66 82 14 13 745 7621 181 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 810 790 21 59 52 ATCAAAGGGCTCGGTCTTCAG 765 780 16 63 50 TGTCAAGAGCATCAGC 83 56 60 66 83 15 1- 745 7£2 13 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 810 790 21 59 52 ATCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 731 17 69 47 TGTCAAGAG CATCAGCA 83 56 60 66 83 16 15 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 810 790 21 59 52 ATCAAAG G G CTCG GTCTTCAG 765 782 13 69 50 TGTCAAGAG CATCAGCAG 83 56 60 66 83 17 16 793 321 23 60 48 GAGCCCmGATGACTTCCTGTT 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 844 13 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 84 61 62 66 85 13 17 793 321 23 60 48 GAGCCCmGATGACTTCCTGTT 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 828 845 13 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 84 61 62 66 85 19 13 793 321 23 60 48 GAGCCCmGATGACTTCCTGTT 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 829 845 17 69 65 TCATCCAGGCCCAGTG G 84 61 62 66 85 20 13 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 311 792 20 58 55 CATCAAAGGGCTCGGTCTTC 765 780 16 63 50 TGTCAAGAGCATCAGC 83 57 61 67 87 21 2C 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 311 792 20 58 55 CATCAAAGGGCTCGGTCTTC 765 731 17 69 47 TGTCAAGAG CATCAGCA 83 57 61 67 87 22 21 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 311 792 20 58 55 CATCAAAGGGCTCGGTCTTC 765 782 13 69 50 TGTCAAGAG CATCAGCAG 83 57 61 67 87 23 22 798 313 21 59 52 CGAGCCCmGATGACTTCCT 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 820 835 16 69 50 TTCCCAGCATCATCCA 85 61 62 67 88 24 23 798 313 21 59 52 CGAGCCCmGATGACTTCCT 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 820 336 17 69 53 TTCCCAG CATCATCCAG 85 61 62 67 88 25 2- 738 313 21 59 52 CGAG CCCTTTGATG ACTTCCT 864 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 321 835 15 69 53 TCCCAGCATCATCCA 85 ei 62 67 88 26 25 798 313 21 59 52 CGAGCCCmGATGACTTCCT CGAGCCCmGATGACTTCCT 36-36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 321 336 16 69 56 TCCCAGCATCATCCAG 85 61 62 67 88 27 2£ 798 313 21 59 52 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 822 33- 13 69 62 CCCAGCATCATCC 85 61 62 67 88 23 2? 798 313 21 59 52 CGAGCCCmGATGACTTCCT 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 844 13 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 85 61 62 67 88 29 23 798 313 21 59 52 CGAGCCCmGATGACTTCCT 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 828 845 13 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 85 61 62 67 88 30 23 798 313 21 59 52 CGAGCCCmGATGACTTCCT 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 829 845 17 69 65 TCATCCAGGCCCAGTG G 85 61 62 67 88 31 3Z 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 312 793 20 58 50 TCATCAAAGGGCTCGGTCTT 765 780 16 63 50 TGTCAAGAGCATCAGC 82 56 60 63 92 32 31 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 312 793 20 58 50 TCATCAAAGGGCTCGGTCTT 765 731 17 69 47 TGTCAAGAG CATCAGCA 82 56 60 63 92 33 32 745 762 13 58 61 CCCAAGCCCTCAGTGGAA 312 793 20 58 50 TCATCAAAGGGCTCGGTCTT 765 782 13 69 50 TGTCAAGAG CATCAGCAG 82 56 60 63 92 34 33 797 3ie 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 820 835 16 69 50 TTCCCAGCATCATCCA 85 62 62 63 92 35 3- 797 3ie 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 820 336 17 69 53 TTCCCAG CATCATCCAG 85 62 62 63 92 36 35 797 3ie 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36-36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 321 835 15 69 53 TCCCAGCATCATCCA 85 62 62 63 92 37 36 797 3ie 20 58 55 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 321 336 16 69 56 TCCCAGCATCATCCAG 85 62 62 63 92 33 3? 797 3ie 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 822 33- 13 69 62 CCCAGCATCATCC 85 62 62 63 92 39 33 797 3ie 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 822 336 15 63 60 CCCAG CATCATCCAG 85 62 62 63 92 40 33 797 3ie 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 823 837 15 63 60 CCAGCATCATCCAGG 85 62 62 63 92 41 LZ 797 3ie 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 840 14 63 64 CATCATCCAGGCCC 85 62 62 63 92 42 -1 797 3ie 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 842 16 63 63 CATCATCCAGGCCCAG 85 62 62 63 92 43 -2 797 3ie 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 827 844 13 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 85 62 62 63 92 44 -3 797 3ie 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 828 845 13 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 85 62 62 63 92 45 -- 797 3ie 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 829 845 17 69 65 TCATCCAGGCCCAGTG G 85 62 62 63 92 46 -5 797 3ie 20 58 55 CCGAG CCCTTTGATG ACTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 830 845 16 63 69 CATCCAGGCCCAGTGG 85 62 62 63 92 47 -6 800 822 23 60 48 AGCCCTTTGATGACTTCCTGTTC 867 351 17 59 71 CACGGAGCGGGCTGTCT 827 844 13 70 61 CATCATCCAGGCCCAGTG 84 60 62 63 96 43 47 800 822 23 60 48 AGCCCTTTGATGACTTCCTGTTC 867 351 17 59 71 CACGGAGCGGGCTGTCT 828 845 13 70 61 ATCATCCAGGCCCAGTGG 84 60 62 63 96 49 -3 800 822 23 60 48 AGCCCTTTGATGACTTCCTGTTC 867 351 17 59 71 CACGGAGCGGGCTGTCT 829 845 17 69 65 TCATCCAGGCCCAGTG G 84 60 62 63 96 50 -3 796 3ie 21 59 52 ACCGAGCCCTTTGATGACTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 820 835 16 69 50 TTCCCAGCATCATCCA 85 61 62 69 98 51 5Z 796 3ie 21 59 52 ACCGAGCCCTTTGATGACTTC 36- 847 13 59 67 G GAG CG G G CTGTCTCAGA 820 336 17 69 53 TTCCCAG CATCATCCAG 85 61 62 69 98 52 Design primerů a sond Applications & Technologies Log In or Register to see your product prices St to place orders. Learning Si Events Products > Real-Time- PCR > Gene Expression Assays, Plates & Arrays > Assays :> TaqManig Gene Expression Assays TaqMan® Gene Expression Assays Click a tab below to learn more about TaqMan Gene Expression Assays. To find and order assaysr click the Search tab Ordering Information Product Description Assay Searcli To begin, select a search method below - Keyword: Search by gene symbol, gene name, public accession number, biological process, or molecular function, - Batch ID: Search by uploading a file containing multiple assay IDs, RefSeq accession numbers, GenBank GI *s, LocusLink IDs, gene symbols,. IMAGE Clone IDs, or species. Keyword Search | Batch ID Search Search for I All Text" |T| Disable wildcard search EE] Advanced Keyword Search www.appliedbiosystems.com Choose Species Filter by Am pi icon Lengths □ H, sapiens A. thaliana □ Amplicon length less than 70 □ P, norvegicus D. melanogaster □ Amplicon length between 71 and 35 □ M, m uscu1 us C. e leg ans □ Amplicon length between Sfi and LOO □ M, mulatta [Rhesus] [Ť] C. familiaris [Canine] □ Amplicon length greater than or equal to 101 n D. reríd (Zebrafish) [P] B. taurus (Cow) □ G, gallus (Chicken) [Ť] O. cunículus (Rabbit) n S, scrofa (Pig) Choose Set Membership I Search All Assays [excludes Gene Copy Number Assays) I Search Gene Copy Number Assays I Limit Assay Sets to: TARGET CLASS ^1 Apoptosis □ Fusion Transcripts ASSAY ATTRIBUTE MICRDARRAY VALIDATION H] Ambion siRNA □ Endogenous Controls □ 1700 0 3' Most COLLABORATOR SETS [r] Immure Tolerance Metv-ork P] Mammalian Gene Collection Order,.ti Information Assay Search Product Description Specifications Literature/Support arch f^^^-Fos in i I to reFir^^ycur se vf other cr^Eria, s Your search Fo^^-Fos in All Text ' returned 2.7 results. ( Species: Homo sapiens Amplicon Length: ALL Set Membership: ALL ) If you wish to refir^^rour search results by product availability, click a radio button below, and then click Filter Results, To filter your suits by other cr^eria, select From the categories list to the left of your results. Related Products Search Help Previous | 1 | 2 | Next View Results by Category Panther Classification: ■ Panther Function (26) ■ Panther Process (26) Filter Results by availability O Inventoried Assays Made to order Assays 1 Im entoried and Made to order Assays | Filter Results | Please Log In to add products to your Shopping Basket/Favorites, configure a product, or to view products available For purchase in your country, Feedback □ 1. AssaYj|*tfetails: ^^^WT70 6 3 0_m 1 Alignment Hap siRNAs B. Related Products Inventoried FOB v-fos FBJ AP-1 NM_005252.2 5 GenBank Homo 77 murme C-FOS mRNAs sapiens osteosarcoma homolog 9 □ 2. Assay ID Details: Hs99999140_ml Inventoried FOS v-fos FBJ AP-1 NM_0Ci5252.2 5 GenBank Homo 77 murine C-FOB mRNAs sapiens Alias ► RefSeq Assay ID Details: Hs00170&30_ml Alignment Map siRNAs 6 Related Products Fnventoried FOS v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog AP-1 C-FOS NM 005252.2 ► GenBank m RNA 5 GenBank mRNAs ► Species ► Amplicon Length Homo sapiens 77 Homo sapiens Design primerů a sond Roche Applied Science Czech Republic Login Quick Order Shopping Cart Help Contact Us Home Products Special Interest Sites Support & Resources News Special Interest Sites > Genomic Systems > Real-Time PGR Systems > Universal ProbeLibrary System Universal ProbeLibrary - Real-Time PCR Systems ► LightCycler5 Carousel-Based System ► LightCycler»4E0 System Universal ProbeLibrary System ► System Description ► Technology ► Assay Design Center ► User Statements and Application ► Assay List ► Performance ► Product List ► Support ► Literature and References ► Multimedia Presentations ► Product Information and Pack Inserts www.universalprobelibrary.com Gene Expression Quantification with Real-Time PCR - Simple and Fast ♦ Design real-time qPCR assays online in seconds. ♦ Rely on just 165 prevalidated probes for over five million qPCR assays for a large variety of organisms. ♦ Reduce the cost of gene expression analysis by performing multiplex qPCR assays with Universal ProbeLibrary Reference Gene Assays. Universal ProbeLibrary for Human Specify yourtarget(s): By sequence ID, gene name or keyword — e.g. ENSTu00uu331739, NM_Qu1101 orX00351 orbeta-actin Roche Applied Science Advanced primer3 settings -By sequence- e.g. >part cf X0G351 Human mRNA fcr beta-actin CaCG€CaTCGTCaCCMCIGGGACGfiCATWfiGJUU^TCTG«^CCJlCaCCTTCIfiCJUlT GAGCTGCGTGTGGCTCCCGA^AGOCCCCGTGCTGCTGACCGAGGCCCCCCTGMCCCC AAGGCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATG TACGTTGCEATCCAGGCTGTGCTATCCCTGTACGCCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTG A1GGACTCCGGIGACGGGGICACCCACACTGIGCCCAICTACGAGGGG1ATGCCCTCCCC W\ Automatically select an intron spanning assay. Q Design multiplex PCR with reference gene. Design primerů a sond Real-Tims PCR Systems ► LightCycler* Carousel-Based System ► LightCycler* 4B0 System Universal Pro beLibrary System ► System Description ► Technology »" Assay Design Center ► Pack Inserts ► Assay Design Guide ► Quick Reference ► Probe No. Conversion ŕ Need Help? ► User Statements and Application ► Assay List ► Performance ► Product List ► Support ► Literature and References ► Multimedia Presentations ► Product Information and Pack Inserts Please choose the sequence(s) you would like to continue with. You can select up to 10 sequences. Name Length Description □ ENST00000400991.1 2669 O ENST00000303562.2 2103 □ ENST00000297904.2 2110 O N M_0 0 33-67.2 1732 O NM_207291.1 1531 O NM 003131.2 4343 O NM_004469.2 2128 B AB022275.1 300 B AB022276.1 700 AL139130.28-201 Clone_based_ensembl_transch Transcriptional activator of the c-fos promoter CROC4 (CROC-4). [Source:UniprctySPTREMBL;Acc:Q8N964] [I B AB20912S.1 5672 B AF126533.1 233 Homo sapie FOS-201 HG^-Proto-oncog fos>[G0/G1 [Source:Uni FIGF-001 HI endothelial ■■ (c-fos-induc [Source:Uni| Homo sapie c-fos interac Homo sapie c-fos interac Homo sapie response el [SRF}, mRN Homo sapie (vascular en mRNA. Homo sapie partial cds Homo sapie partial cds Homo sapie [c-fos serun transcription ProbeFinder has designed the optimal real-time PCR assay for: NI.-1 003567.2 homo sapiens upstream transcription factor 2, c-fos interacting (USF2), transcript variant 1, mRNA. Assay details: Use Universal ProbeLibrary probe: #26, cat.no. 04687574001 Primer Length Position Tm %GC Sequence Left Primer Right Primer 21 44S -466 540 - 560 60 59 67 43 gt ga c c c a ggt gggt gt g tgaagggattttggatcacag Amplicon (112 nt) gtgacccaggtgggtgtggacggggcagcccagcgcccgggccccgccgctgcctctgtg cccccaggtcctgcagcgcccttcccgctggctgtgatccaaaatcccttca [ Download pack insert ] [ PDF report | [ Text report ] [ Order probes or set Transcript overview: 26 TTT—i i ÁÁ Á A 1732 Design primerů a sond Universal ProbeLibrary ,*WHI Probstf* Po dnešní přednášce - Rozumíte vlastnostem primerů i základních typů sond a znáte faktory, které ovlivňují jejich hybridizaci a účinnost - Umíte navrhnout optimální sekvenci primerů i hydrolyzační sondy pomocí dostupných programů a rozumíte parametrům designu